第4章植物細(xì)胞工程的基本原理和技術(shù)基礎(chǔ)

1、第四章植物細(xì)胞工程的基本原理和技術(shù)基礎(chǔ)1.植物細(xì)胞工程的基本原理2.植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)和環(huán)境條件3.外植體的選擇和消毒4.外植體的切取和培養(yǎng)4.1植物細(xì)胞工程的基本原理一.植物細(xì)胞的全能性二.植物激素的調(diào)控作用4.1.1植物細(xì)胞的全能性植物細(xì)胞工程常用的技術(shù)是植物組織培養(yǎng)植物體細(xì)胞雜交植物細(xì)胞工程的理論基礎(chǔ)是：植物細(xì)胞的全能性概念：細(xì)胞的全能性是指生物體的細(xì)胞具有使后代細(xì)胞形成完整個(gè)體的潛能。原因：是生物體的每一個(gè)細(xì)胞都含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)及發(fā)育為完整個(gè)體所必需的全部基因。細(xì)胞的全能性受精卵的全能性最高；其次是生殖細(xì)胞（尤其是卵細(xì)胞）；體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞低得多。在生

2、物的個(gè)體發(fā)育中，由于基因在特定時(shí)間和空間下選擇性地表達(dá)而形成不同器官，因此，要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的全能性，首先必須使生物體的細(xì)胞處于離體狀態(tài)。當(dāng)植物細(xì)胞脫離了原來所在植物體的器官或組織而處于離體狀態(tài)時(shí)，在一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件的作用下，就可能表現(xiàn)出全能性，發(fā)育成完整的植株。植物組織培養(yǎng)的概念植物組織培養(yǎng)就是在無菌和人工控制條件下，將離體的植物器官、組織、細(xì)胞，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織、叢生芽，最終形成完整的植株。植物體植物組織培養(yǎng)的條件：植物組織培養(yǎng)的過程離體的植物器官、組織或細(xì)胞脫分化（又叫去分化）愈傷組織（排列疏松而無規(guī)則，高度液泡化的呈無定形狀態(tài)

3、的薄壁細(xì)胞）再分化根或芽等器官適宜的養(yǎng)料和激素，適宜的溫度和無菌條件胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果胡蘿卜愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果細(xì)胞全能性的絕對(duì)性與相對(duì)性:(1)不是所有基因型的所有細(xì)胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應(yīng);(2)即使對(duì)于植物細(xì)胞而言，細(xì)胞全能性也并不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物個(gè)體;(3)動(dòng)、植物細(xì)胞全能性的表現(xiàn)程度存在明顯的差異。植物細(xì)胞全能性表現(xiàn)根據(jù)細(xì)胞類型不同從強(qiáng)到弱:營養(yǎng)生長中心形成層薄壁細(xì)胞厚壁細(xì)胞(木質(zhì)化細(xì)胞)特化細(xì)胞(篩管、導(dǎo)管細(xì)胞)；根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強(qiáng)到弱為：頂端分生組織居間分生組織側(cè)生分生組織薄壁組織(基本組織)厚角組織輸導(dǎo)組織厚壁組織。脫分化：一個(gè)已經(jīng)停止分裂繁榮

4、成熟細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉稚鸂顟B(tài)，并形成未分化的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織的現(xiàn)象。再分化：原以分化的細(xì)胞經(jīng)過脫分化后再次分化的現(xiàn)象，最終可進(jìn)一步形成完整的小植株。離體培養(yǎng)中細(xì)胞的脫分化（Dedifferentiation）脫分化外植體愈傷組織或體細(xì)胞胚完整植株脫分化細(xì)胞不定器官直接伸長莖尖培養(yǎng)（較大時(shí)）完整植株發(fā)育幼胚培養(yǎng)（較大時(shí)）完整植株愈傷組織：脫分化后的細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無組織結(jié)構(gòu)、無明顯極性的、松散的細(xì)胞團(tuán)稱為愈傷組織。愈傷組織的種類：1、胚性愈傷組織（Embryoneniccallus）：表面光滑、組織結(jié)構(gòu)緊湊、黃綠色、細(xì)胞小、易碎、再生力強(qiáng)。胚性愈傷組織容易形成胚狀體，所以被稱為胚性愈傷組織。易

5、形成芽。2、非胚性愈傷組織：表面粗糙、組織結(jié)構(gòu)疏松、細(xì)胞大，淡黃色或白色?？梢杂糜趹腋〖?xì)胞系的建立。4.1.2植物激素的調(diào)控作用生長素：啟動(dòng)細(xì)胞的分裂，在細(xì)胞的脫分化、形成愈傷組織的過程中必不可少。如IAA、NAA、IBA、2,4-D。細(xì)胞分裂素：促進(jìn)細(xì)胞分裂和芽的形成，如KT、6-BA、Zt。4.2植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)所需的營養(yǎng)和環(huán)境條件一、培養(yǎng)基的組成和配制二、影響植物組織培養(yǎng)的環(huán)境條件4.2.1培養(yǎng)基的組成和配制培養(yǎng)基的基本成分培養(yǎng)基的種類和配制培養(yǎng)基的基本成分無機(jī)成分：大量元素和微量元素碳源：如蔗糖維生素：如肌醇植物生長物質(zhì)：生長素和細(xì)胞分裂素有機(jī)附加物一、培養(yǎng)基的成分及其作用（一）無機(jī)

6、營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)的植物組織、器官、細(xì)胞或者原生質(zhì)體需要連續(xù)的供給某些無機(jī)化學(xué)物質(zhì)，除了C、H、O之外，需要量比較多的元素叫大量元素，需要量比較少的元素叫微量元素。大量元素培養(yǎng)基的大量元素使用量一般在每升幾十至幾千毫克。大量元素包括N,P,K,Ca,Mg,S。培養(yǎng)基中加入量最多的是N，N一般以硝酸鹽或氨鹽，或者兩者結(jié)合的鹽提供。微量元素微量元素的用量一般每升不高于幾十毫克。植物所需的微量元素有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co、Cl化學(xué)藥品常帶有微量元素雜質(zhì)，因此要注意微量元素的用量不能過多，多會(huì)引起生長抑制等毒害現(xiàn)象。（二）有機(jī)化合物有機(jī)物質(zhì)包括維生素類物質(zhì)、氨基酸類物質(zhì)、糖類物質(zhì)和一些其它的

7、有機(jī)添加物。1、維生素類物質(zhì)維生素類物質(zhì)在酶系統(tǒng)中有催化功能。硫胺素（VB1）與愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有關(guān)，可能是所有植物組織培養(yǎng)初期需要的維生素，而鹽酸吡哆醇（VB6）促進(jìn)根的生長，煙酸（VB3，又稱維生素PP）促進(jìn)胚的發(fā)育。有的配方中還使用了泛酸鈣（VB5）、生物素（VH）、鈷胺素（VB12）、葉酸（VBc），Vc等。2、AA類物質(zhì)絕大多數(shù)AA適量時(shí)對(duì)培養(yǎng)效果都有正象效應(yīng)。常用的有Gly（甘氨酸）、Asn（天冬酰胺）、Gln（谷氨酰胺）。在植物組織培養(yǎng)中，有時(shí)也用水解乳蛋白和水解酪蛋白。3、糖類糖在培養(yǎng)基的作用：1）、為細(xì)胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架2）、為細(xì)胞的呼吸代謝提供底物和能量3）、維

8、持滲透壓蔗糖是廣泛應(yīng)用的一種碳源。葡萄糖和麥芽糖也是常用的碳源。4、其它有機(jī)物質(zhì)1）肌醇（環(huán)己六醇）肌醇可以形成果膠物質(zhì)，是細(xì)胞壁的構(gòu)建物質(zhì)另外還可以形成植酸，與陽離子結(jié)合或形成磷脂，參與細(xì)胞膜的組成，利于胚和芽的形成。2）天然有機(jī)物一些天然的有機(jī)物如椰乳、番茄提取物、酵母提取物、馬鈴薯煮汁也常用于植物組織培養(yǎng)，并表現(xiàn)出了良好的促進(jìn)作用。（三）植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)l植物激素是在植物體內(nèi)合成的，對(duì)植物生長發(fā)育有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機(jī)物，而植物生長調(diào)節(jié)劑是外源的調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的物質(zhì)。l無機(jī)元素和有機(jī)營養(yǎng)構(gòu)成的培養(yǎng)基僅保證培養(yǎng)物的生存與最低生理活動(dòng)，只有加入植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，才能誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、脫分化和

9、再分化。1、生長素類：1）吲哚類：IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、IPA（吲哚丙酸）2）萘酸類：NAA（萘乙酸）3）苯氧羧酸類：2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、2,4,5-T（2,4,5-三氯苯氧乙酸）、2,4,5-TP（2,4,5-三氯苯氧丙酸）等。其中吲哚乙酸在植物體內(nèi)普遍存在，是生理活性最強(qiáng)的生長素。生長素的生理作用1、促進(jìn)細(xì)胞生長和細(xì)胞分裂；2、誘導(dǎo)受傷組織表面細(xì)胞恢復(fù)分裂能力；3、形成愈傷組織，促進(jìn)生根；4、與一定量的細(xì)胞分裂素配合共同誘導(dǎo)不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長、胚狀體的誘導(dǎo)。ABCA：NAA0mg/L，芽（少），根（無）B：NAA0.1mg/L，芽（少），根（無

10、），愈傷組織（少量）C：NAA5.0mg/L，芽（少），根（多），愈傷組織（一定量）2、細(xì)胞分裂素l是一類腺嘌呤衍生物。主要有激動(dòng)素（6-糖基氨基嘌呤，KT）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6-芐基氨基嘌呤。l功能：1、促進(jìn)細(xì)胞的分裂和分化；2、誘導(dǎo)芽的分化；3、促進(jìn)側(cè)芽的萌發(fā)和生長；4、抑制衰老。ABA：BA(0mg/L)，芽（減少），根（增多）愈傷組織（一定量）B：BA(0.1mg/L)，芽（適量），根（適量）愈傷組織（一定量）控制植物細(xì)胞分化l分裂素/生長素的比例是控制芽和根形成的一個(gè)重要條件l比例高時(shí)產(chǎn)生芽,比例低時(shí)產(chǎn)生根3、赤霉素（GA3）生理作用：1

11、、誘導(dǎo)莖的細(xì)胞伸長，對(duì)矮生型植物恢復(fù)成高生型特別有效，對(duì)根無效；2、對(duì)形成層的細(xì)胞分化有影響，往往同生長素有協(xié)同作用。IAA/GA比值高有利于木質(zhì)部的分化，比值低有利于韌皮部的分化；3、破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使之提前萌發(fā)；4、對(duì)生長素和細(xì)胞分裂素的活性有增效作用。注：不耐熱，應(yīng)采用過濾滅菌加入4、脫落酸（ABA）生理作用：1、抑制蛋白質(zhì)的合成；2、抵消和抑制生長素、細(xì)胞分裂素、GA的作用；3、誘導(dǎo)休眠、促進(jìn)衰老和脫落。以上四種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，前兩類用的多，后兩類只是補(bǔ)充，對(duì)某些植物有利、對(duì)某些植物不僅沒有利，還有害，實(shí)際工作中要具體分析。生長調(diào)節(jié)物質(zhì)在生物體內(nèi)存在甚微，濃度很低，一般用ppm

12、表示1ppm=1mg/L培養(yǎng)基的種類和配制培養(yǎng)基的種類：見表4-1（MS、B5、N6）。培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)基的選擇一、培養(yǎng)基的種類（根據(jù)無機(jī)鹽的濃度）：1、高無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量較高，微量元素種類齊全，比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖性，養(yǎng)分?jǐn)?shù)量及比例比較合適，廣泛用于植物的器官、花藥、細(xì)胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。主要有MS、LS、BL、BM、ER培養(yǎng)基。2、高硝態(tài)氮培養(yǎng)基硝酸鉀含量高，氨態(tài)氮的含量低，含有較高的VB1。主要適合與木本植物、十字花科植物和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。主要有B5、N6、SH培養(yǎng)基。3、中等無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，

13、微量元素種類減少，但含量較MS的高，維生素種類比MS多，如增加了生物素、葉酸等。適合于花藥培養(yǎng)，主要有Nitch，NT、H、Miller培養(yǎng)基。4、低無機(jī)鹽含量培養(yǎng)基大量元素含量大幅度降低而且種類減少，有機(jī)含量相對(duì)也很低。多數(shù)用于生根培養(yǎng)基，主要有White、Heller、WS、HE、HB。二、根據(jù)培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程，培養(yǎng)基分為初代培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基。初代培養(yǎng)基是指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)基是指用來接種繼初代培養(yǎng)物的培養(yǎng)基。三、根據(jù)其作用不同，培養(yǎng)基分為誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。四、根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）

14、主要有MS、White、N6、B5、改良MS、Heller、Nitsh、SH、Miller等。完全培養(yǎng)基就是基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗(yàn)的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機(jī)物質(zhì)等。MS+6-BA0.5+KT0.5+NAA0.5+Su3%+Ag0.7%培養(yǎng)基的篩選：1.無機(jī)營養(yǎng)成分：一般在現(xiàn)有培養(yǎng)基配方中選擇?？梢詤⒖记叭说慕?jīng)驗(yàn)，例如：MS是廣譜性培養(yǎng)基，N6用于單子葉植物的培養(yǎng)，豆科多用B5培養(yǎng)基。2、植物生長調(diào)節(jié)劑：必須進(jìn)行篩選試驗(yàn)?？傮w原則-當(dāng)誘導(dǎo)愈傷組織形成時(shí)，細(xì)胞分裂素和生長素相對(duì)平衡；誘導(dǎo)芽分化時(shí)，細(xì)胞分裂素水平應(yīng)高于生長素，誘導(dǎo)根則要低。3、有機(jī)成分要根據(jù)培養(yǎng)類型

15、考慮，如進(jìn)行器官和組織培養(yǎng)，一般不加復(fù)雜有機(jī)成分，而進(jìn)行細(xì)胞和原生質(zhì)體培養(yǎng)則要加。培養(yǎng)基的配制（一）、貯備液（母液）的配制為什么要配制母液？1）、方便2）、準(zhǔn)確（有些成分量太?。┮訫S培養(yǎng)基配制為例：1、大量元素母液的配制各成分按照表1培養(yǎng)基濃度含量擴(kuò)大10倍，按順序逐步混合。后用蒸餾水定容到1000ml的容量瓶中，即為10倍的大量元素母液。到入細(xì)口瓶，貼好標(biāo)簽保存于冰箱中。配制培養(yǎng)基時(shí)，每配1L培養(yǎng)基取此液100ml。注意：(1)某些無機(jī)成分如Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等在一起可能發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀物。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，母液配制時(shí)要用純度高的重蒸餾水溶解，藥品采用等級(jí)較

16、高的分析純，各種化學(xué)藥品必須先以少量重蒸餾水使其充分溶解后才能混合，混合時(shí)應(yīng)注意先后順序。特別應(yīng)將Ca2+、SO42一、Mg2十和H2PO4一等離子錯(cuò)開混合，速度宜慢，邊攪拌邊混合。(2)CaCl22H2O要在最后單獨(dú)加入，在溶解CaCl22H2O時(shí)，蒸餾水需加熱沸騰，除去水中的CO2，以防沉淀。另外，CaCl22H2O放入沸水中易沸騰，操作時(shí)要防止其溢出。、微量元素母液的配制MS培養(yǎng)基的微量元素?zé)o機(jī)鹽由7種化合物（除Fe）組成。微量元素用量較少，特別是CuSO45H2O、CoCl26H2O，因此在配制中分微量、配制。按照表2，表3配方，用感量為0.0001g的分析天平稱量，其它同大量元素。配

17、制培養(yǎng)基時(shí)，每配制1L培養(yǎng)基，取微量10ml，微量ml3、鐵鹽母液的配制鐵鹽不是都需要單獨(dú)配成母液，如檸檬酸鐵，只需和大量元素一起配成母液即可。目前常用的鐵鹽是硫酸亞鐵和乙二胺四乙酸二鈉的螯合物，必須單獨(dú)配成母液。這種螯合物使用起來方便，又比較穩(wěn)定，不易發(fā)生沉淀。配制方法同上，直接用蒸餾水加熱攪拌溶解。配制培養(yǎng)基時(shí)，配制1L取此液10ml。在配制鐵鹽時(shí)，如果加熱攪拌時(shí)間過短，會(huì)造成FeS04和Na2EDTA鰲合不徹底，此時(shí)若將其冷藏，F(xiàn)eS04會(huì)結(jié)晶析出。為避免此現(xiàn)象發(fā)生，配制鐵鹽母液時(shí)，F(xiàn)eS04和Na2EDTA應(yīng)分別加熱溶解后混合，并置于加熱攪拌器上不斷攪拌至溶液呈金黃色(約加熱20-30

18、min)，調(diào)pH值至5.5，室溫放置冷卻后，保存?zhèn)溆?。Heller（1953）別強(qiáng)調(diào)鐵和氮在植物組織培養(yǎng)中的作用。鐵元素為什么單獨(dú)配制？White培養(yǎng)基中（1943）鐵以Fe2(SO4)3；Street和Henshaw(1966)改用FeCl2取代，也不滿意原因一、該方案中含有錳和其他金屬離子雜質(zhì)；原因二、PH值改變導(dǎo)致鐵利用下降鐵在pH值為5.2左右時(shí)對(duì)組織是有效的；一周內(nèi)培養(yǎng)基的pH值4.9-5.0升至5.8-6.0，根開始表現(xiàn)出缺鐵的征兆。改進(jìn)：在培養(yǎng)基中采用FeEDTA，在pH值達(dá)到7.68.0時(shí)鐵仍然有效。（Heller，1953）。4、有機(jī)母液的配制MS培養(yǎng)基的有機(jī)成分有甘氨酸、肌

19、醇、煙酸、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆素。配制直接用蒸餾水溶解，注意稱量時(shí)用電子分析天平，并貯存在棕色無菌瓶中。5、植物生長調(diào)節(jié)劑母液配制一般植物生長調(diào)節(jié)劑母液的配制的終濃度以0.5mg/ml為好，需要注意的是：（）配制生長素類，例如IAA、NAA、2，4-D、IBA，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸餾水定容到一定的濃度。后者效果好。（）細(xì)胞分裂素，例如KT，應(yīng)先用少量95%乙醇或無水乙醇加34滴1mol/L的鹽酸溶解，或直接用1mol/LHCl溶解，再用蒸餾水定容。（）GA3以95%酒精溶解（不耐高溫，過濾滅菌）保存在棕色試劑瓶中。注意：所有母液都要

20、貼上標(biāo)簽，注明名稱、配制倍數(shù)、日期，所有的母液都應(yīng)保存在04冰箱中，若母液出現(xiàn)沉淀或霉團(tuán)則不能繼續(xù)使用。在培養(yǎng)基的配制過程中，常需要用氫氧化鉀或氫氧化鈉和鹽酸來來調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿度：（1）1摩爾/升KOH液的配制:稱取57.1克KOH,加蒸餾水至1000毫升.（2）1摩爾/升NaOH液的配制:稱取40克NaOH,加蒸餾水至1000毫升.（3）1摩爾/升HCL液的配制:取濃鹽酸(比重1.19)、82.5毫升加蒸餾水至1000毫升.配制時(shí)先將濃鹽酸緩緩加入約800毫升的蒸餾水中,然后用蒸餾水補(bǔ)足至1000毫升.（二）培養(yǎng)基的配制1、計(jì)量根據(jù)配制培養(yǎng)基的量和母液的濃度計(jì)算需要吸取母液的量，計(jì)算公式：

21、吸取量ml=培養(yǎng)基中物質(zhì)的含量（mg/L）1000ml/母液濃度（mg/L）。2、移液取醫(yī)用瓷缸一只，加入少量的蒸餾水，按照計(jì)算吸取母液的量依次吸取各母液置于醫(yī)用瓷量杯中備用。注意：（1）用量筒或移液管量取培養(yǎng)基母液之前，必須用所量取的母液將量筒或移液管潤洗2次。（2）量取母液時(shí)，不要漏掉或多加。（3）移液管不能混用。3、稱取瓊脂蔗糖備用4、融化用搪瓷量杯量取600700ml的蒸餾水放在電爐上，加入瓊脂，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直到液體呈半透明狀將其取下，加入蔗糖。大燒杯底的外表面不能沾水，否則加熱時(shí)燒杯容易炸裂，使溶液外溢，造成燙傷。5、混合將融化的瓊脂和母液充分混合，用蒸餾水定容到1000m

22、l，來回混合幾次。6、調(diào)pH用滴管吸取物質(zhì)的量濃度為1mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入溶化的培養(yǎng)基中，邊滴邊攪拌，并隨時(shí)用精密的pH試紙(5.47.0)測培養(yǎng)基的pH，一直到培養(yǎng)基的pH達(dá)到要求為止(在調(diào)制時(shí)要比目標(biāo)pH值偏高0.20.5個(gè)單位，因?yàn)榕囵B(yǎng)基在滅菌過程中由于糖等物質(zhì)的降解，pH值會(huì)下降0.20.5個(gè)單位左右)。7、分裝溶化的培養(yǎng)基應(yīng)該趁熱分裝。注意不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口和瓶壁上。錐形瓶中培養(yǎng)基的量約為錐形瓶容量的1/51/4。每1L培養(yǎng)基，可分裝2030瓶。8、包扎用封口膜封口，外邊可加一層牛皮紙，扎好繩子，用鉛筆或碳素墨水筆在牛皮紙上寫上培養(yǎng)基的代號(hào)。9、培養(yǎng)基的滅菌4

23、.2.2影響植物組織培養(yǎng)的環(huán)境條件溫度光照：光照強(qiáng)度、光質(zhì)、光周期一、光照的影響培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光周期等方面：光周期：黑暗與光照交替的時(shí)間光量：光照強(qiáng)度光質(zhì)：光的波長1、光周期對(duì)植物細(xì)胞脫分化和再分化的效應(yīng)例1：黑暗中培養(yǎng)的煙草花藥，其胚狀體的分化與幼植物的生長，同經(jīng)光照培養(yǎng)一樣的多例2：短日照敏感的葡萄品種，它的莖切段，僅在短日照條件下才能分化成根例3：對(duì)日照不敏感的葡萄品種，可在任何光周期下分化成根結(jié)論：光周期的需要與否，應(yīng)根據(jù)植物種類、培養(yǎng)的目的來決定離體培養(yǎng)中光周期的調(diào)節(jié)最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。愈傷組織誘導(dǎo)階段，一般采用三種做法：

24、全暗、周期性光照、散射性光照。依據(jù)植物種類不同做法不同，多數(shù)植物適合全暗或周期性光照，器官發(fā)生階段：一般給予周期性光照比較好。2、光量的影響光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植物體、細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。一般來說，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長。離體培養(yǎng)條件下常用的光量，一般為1000-4000lx（勒克斯）。離體培養(yǎng)中通常難以達(dá)到4000lx，一般光量在2000-3000lx。光照強(qiáng)度的高低直接影響器官分化的頻率。高光量可以降低植物體內(nèi)生長素水平，低光量使植物體內(nèi)生長素素水平較高，容易生根。3、光質(zhì)的影響光質(zhì)對(duì)愈傷

25、組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，2周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下培養(yǎng)，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15天后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。離體培養(yǎng)條件下，一般用日光燈進(jìn)行光照，光譜成分主要是藍(lán)紫光，波長為419-467nm。對(duì)芽分化有效光譜成分為藍(lán)紫光，根分化則受600-680nm所刺激。二、溫度的影響l培養(yǎng)都是在2327之間進(jìn)行，一般采用252。喜溫性植物：茄科、禾本科、蘭科等。培養(yǎng)溫度一般控制在26-28。冷涼性植物：百合科、十字花科、菊科等。通常培養(yǎng)溫度控制在18-22或25。三、濕度的影響l組織培養(yǎng)中濕度的影響有兩個(gè)方面：一是培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度條件，容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。一是環(huán)境的濕度條件。環(huán)境的相對(duì)濕度一般要求7080%。常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。四、pH值不同的植物對(duì)培養(yǎng)基最適PH值的要求也是不同的（見表），大多在5.5-6.5左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8，這基本能適應(yīng)大多數(shù)植物培養(yǎng)的需要。種類最適PH值種類最適PH值杜鵑4.0月季5.8越橘4.5胡蘿卜、石刁柏6.0蠶豆5.5桃7.0番茄、葡萄5.7一般來說PH