第4章酶的分離與純化

1、 第四章第四章 酶的分離與純化酶的分離與純化l酶純化的特點： 1）在細(xì)胞中的含量少 2）可以測定酶活力跟蹤酶l判斷分離純化方法： 1）總活力的回收率 2）比活力提高的倍數(shù) 比活力：在特定條件下，1mg酶蛋白所具有的酶活力單 位數(shù)1）預(yù)處理）預(yù)處理（pretreatment） 包括發(fā)酵液處理和細(xì)胞破碎等2）初步純化）初步純化（rough fractionation） 除去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì) 鹽析，等電點沉淀和有機溶劑沉淀等3）高度純化）高度純化（fine fractionation） 除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì) 層析，電泳法等4）濃縮與干燥）濃縮與干燥（concentration and

2、 desiccation） 使酶與溶劑分離的過程 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，透析，超濾和冷凍干燥等。 第一節(jié)第一節(jié) 酶的分離酶的分離一、發(fā)酵液預(yù)處理一、發(fā)酵液預(yù)處理( (一一) )發(fā)酵液的相對純化發(fā)酵液的相對純化 無機離子的去除：形成沉淀無機離子的去除：形成沉淀2.2.雜蛋白質(zhì)的去除：沉淀法，變性法，凝聚雜蛋白質(zhì)的去除：沉淀法，變性法，凝聚和絮凝和絮凝3.3.色素及其他物質(zhì)的去除：活性炭、交換樹脂等色素及其他物質(zhì)的去除：活性炭、交換樹脂等( (二）發(fā)酵液的固液分離：二）發(fā)酵液的固液分離：離心和過濾離心和過濾1 . 影響發(fā)酵液過濾的因素影響發(fā)酵液過濾的因素 1）菌種：真菌，放線菌，細(xì)菌）菌種：真菌，放線菌，細(xì)菌

3、 2）培養(yǎng)基組成：原料和發(fā)酵時間（粘稠度）培養(yǎng)基組成：原料和發(fā)酵時間（粘稠度）2. 提高過濾性能的方法提高過濾性能的方法 1 1）絮凝和凝聚）絮凝和凝聚 2 2）稀釋、加熱）稀釋、加熱 3 3）加助濾劑，）加助濾劑，常用硅藻土等。常用硅藻土等。 微生微生物物 革蘭氏陽性革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)菌 革蘭氏陰性革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)菌 放線放線菌菌 酵母菌酵母菌 霉菌霉菌 壁厚壁厚/nm 15 50 10 13 同同G+100 300 100 250 層次層次 單層單層 多層多層 多層多層 多層多層 主要主要組成組成 肽聚糖肽聚糖(40% 90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂多糖脂多糖(1%2%) 肽聚糖

4、肽聚糖(5% 10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11% 22%)磷脂磷脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)葡聚糖葡聚糖(30% 40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)幾丁質(zhì)幾丁質(zhì)(1% 2%)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(6% 8%)脂類脂類(8.5% 13.5%)多聚糖多聚糖(80% 90%)脂類脂類蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成各種微生物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與組成 二、細(xì)胞破碎二、細(xì)胞破碎機械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲波破碎法X-press 通過機械運動產(chǎn)生的剪切通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。力，使組織、細(xì)胞破碎。物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法通過各種物理因素的作用，通過各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)

5、構(gòu)破使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。壞，而使細(xì)胞破碎。化學(xué)破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween化學(xué)試劑可以改變細(xì)胞壁化學(xué)試劑可以改變細(xì)胞壁或細(xì)胞膜的通透性，而使或細(xì)胞膜的通透性，而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)有選擇性的滲細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)有選擇性的滲透出來透出來酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過細(xì)胞本身的酶系或外通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理細(xì)胞破碎方法及其原理JY92-II D超聲波超聲波細(xì)胞粉碎機細(xì)胞粉碎機高壓細(xì)胞破碎機高壓細(xì)胞破碎機勻漿機勻漿機（

6、三）細(xì)胞破碎確認(rèn)（三）細(xì)胞破碎確認(rèn) 1.1.直接測定破碎前后的細(xì)胞數(shù)：直接測定破碎前后的細(xì)胞數(shù)： 破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數(shù)器直接計數(shù)；破碎前，用顯微鏡或電子微粒計數(shù)器直接計數(shù)； 破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。破碎后，用染色法區(qū)分破碎細(xì)胞與完整細(xì)胞。 2.2.測定導(dǎo)電率：測定導(dǎo)電率： 利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測定破碎程度。利用破碎前后導(dǎo)電率的變化測定破碎程度。 3.3.測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力：測定釋放的蛋白質(zhì)量或酶活力： 測定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，測定破碎液中胞內(nèi)蛋白質(zhì)或目的酶的釋放量，估算破碎率。估算破碎率。 三、酶的提取三、酶的提取(extraction)(

7、extraction) l 把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來，以把酶從生物組織或細(xì)胞中以溶解狀態(tài)釋放出來，以供進(jìn)一步從中分離純化所需要的酶。供進(jìn)一步從中分離純化所需要的酶。l 提取目標(biāo)：提取目標(biāo)： a. 將目的酶最大限度地溶解出來，盡量少的雜質(zhì)從將目的酶最大限度地溶解出來，盡量少的雜質(zhì)從原料中引入溶液。原料中引入溶液。 b. 保持生物活性。保持生物活性。提取液：溶解度大，破壞小；對雜質(zhì)不溶；價格低廉，操作安全。提取液：溶解度大，破壞?。粚﹄s質(zhì)不溶；價格低廉，操作安全。 提取方法提取方法：（一）鹽溶液提取（一）鹽溶液提取 鹽溶（鹽溶（salting insalting in） 濃度控制在

8、濃度控制在0.02-0.5mol/L0.02-0.5mol/L的范圍內(nèi)，常用的范圍內(nèi)，常用NaClNaCl，濃度，濃度為為0.15mol/L0.15mol/L。 提取液的體積是原料體積的提取液的體積是原料體積的1-51-5倍。倍。 提取的溫度視目標(biāo)酶的性質(zhì)而定。提取的溫度視目標(biāo)酶的性質(zhì)而定。l（二）酸、堿溶液提?。ǘ┧?、堿溶液提取 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶，0.12mol/L 硫酸提取 L-天門冬酰胺酶,pH 11-12.5 pH遠(yuǎn)離等電點 防止蛋白變性l（三）有機溶劑提取（三）有機溶劑提取 與脂結(jié)合牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的酶，不溶于水，酸或堿中。 乙醇、丙酮和丁醇四、四、 離心分離離心分

9、離借助離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，根據(jù)物質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度及浮力等因子的不同，而使物質(zhì)分離的技術(shù)。離心分離的形式：離心分離的形式：1 1）離心沉降：離心沉降：固液分離2 2）離心過濾：過濾）離心過濾：過濾介質(zhì)3 3）離心分離：）離心分離：分離相對密度不同液體離心力表示方法：離心力表示方法： 每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：表示，如：4000r/min4000r/min。相對離心力相對離心力（RCFRCF）表示，如：）表示，如：65000g65000g。Fc = m ac m r 2 m r （2 N/60）2 N為離心機每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)為離心機每分鐘轉(zhuǎn)數(shù) （r/min ）；）；Fc通常以相

10、通常以相對離心力對離心力RCF（relative centrifugal force）表示，）表示，即離心力即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用的多少倍。一般用g（或數(shù)字（或數(shù)字 g）表示。）表示。兩者可換算或查測算圖。兩者可換算或查測算圖。計算近似計算近似RCF的列線圖的列線圖（二）離心機的種類（二）離心機的種類 按離心機轉(zhuǎn)速的不同，分為：按離心機轉(zhuǎn)速的不同，分為： 常速（低速）常速（低速） 高速高速 超速超速 名稱名稱 轉(zhuǎn)速轉(zhuǎn)速(r/min)(r/min) 注意事項注意事項 低速離心機低速離心機 80008000 常溫，注意樣品熱變性和

11、常溫，注意樣品熱變性和離心管平衡離心管平衡 高速離心機高速離心機 10, 000 26, 000冷凍（防止溫度升高），冷凍（防止溫度升高），離心管的精確平衡離心管的精確平衡 超速離心機超速離心機 26, 000冷凍真空系統(tǒng)（減少空冷凍真空系統(tǒng)（減少空氣阻力和摩擦），氣阻力和摩擦），離心管的精確平衡離心管的精確平衡 離心機的種類離心機的種類 l溫度類型：溫度類型：常溫及常溫及冷凍冷凍l超速離心機均為冷超速離心機均為冷凍型。凍型。l使用冷凍離心機時使用冷凍離心機時提前降溫，預(yù)冷離提前降溫，預(yù)冷離心頭。心頭。l使用超速離心機時使用超速離心機時先抽真空。先抽真空。l角式及外擺式：外擺式一般為低速，角式

12、及外擺式：外擺式一般為低速， l 角式由低速到超速均有。角式由低速到超速均有。 l角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。作注意穩(wěn)、蓋、旋緊。l平衡、定溫、定速、定時。平衡、定溫、定速、定時。（三）常用離心方法（三）常用離心方法 差速離心法差速離心法 沉降速度法沉降速度法 密度梯度離心密度梯度離心 沉降平衡法沉降平衡法 等密度梯度離心等密度梯度離心1差速離心差速離心 （differential centrifugationdifferential centrifugation） 采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速采用不同的離心速度和離心時

13、間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法度不同的顆粒分批分離的方法。特點：特點：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。用于分離大小和密度差異較大的顆粒。 優(yōu)點：優(yōu)點：操作簡單操作簡單 。缺點：缺點：1）分離效果較差，分離效果較差， 不能一次得到純顆粒。不能一次得到純顆粒。 2）壁效應(yīng)嚴(yán)重。）壁效應(yīng)嚴(yán)重。 3 3）沉降的顆粒受到擠壓）沉降的顆粒受到擠壓。 差速離心分離示意圖差速離心分離示意圖 （a a）離心前的懸浮液）離心前的懸浮液 （b b）（）（e e）離心不同時間后顆粒的沉降情況）離心不同時間后顆粒的沉降情況 2密度梯度離心密度梯度離心 （density gradient centrifugat

14、iondensity gradient centrifugation） 樣品在樣品在密度梯度介質(zhì)密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。分離方法。 常用的密度梯度溶液是常用的密度梯度溶液是蔗糖蔗糖溶液。溶液。 密度梯度離心示意圖密度梯度離心示意圖 （a a）離心前）離心前 （b b）離心后）離心后 特點：特點：l適宜分離密度相近而大小不同的固相適宜分離密度相近而大小不同的固相 物質(zhì)物質(zhì)。l區(qū)帶內(nèi)顆粒均一，分離效果好。區(qū)帶內(nèi)顆粒均一，分離效果好。l區(qū)帶位置和寬度隨時間的不同而改變。區(qū)帶位置和寬度隨時間的不同

15、而改變。Density gradient ultracentrifugation3. 等密度梯度離心等密度梯度離心 又稱又稱沉降平衡離心沉降平衡離心 （sedimentation sedimentation equilibrium centrifugationequilibrium centrifugation）。）。 根據(jù)根據(jù)顆粒的密度不同顆粒的密度不同而進(jìn)行分離。而進(jìn)行分離。 離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆?；蛳蛳鲁两担蛳蛏掀煌芏鹊奈镔|(zhì)顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂浮，達(dá)到與其相同的密度時不再移動，形成浮，達(dá)到與其相同的密度時不再移

16、動，形成區(qū)帶。區(qū)帶。 常用常用氯化銫氯化銫（CsClCsCl）作為梯度介質(zhì)。）作為梯度介質(zhì)。特點：特點： 介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。物質(zhì)的密度。適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。的物質(zhì)。 等密度梯度離心示意圖等密度梯度離心示意圖 （a a）離心前；）離心前； （b b）離心后）離心后 密度梯度離心密度梯度離心等密度梯度離心等密度梯度離心梯度梯度介質(zhì)介質(zhì)通常用蔗糖通常用蔗糖最大的梯度密度最大的梯度密度密度密度最大的沉降樣品最大的沉降樣品離心離心條件條件在最前的沉降物質(zhì)達(dá)在最前的沉降物質(zhì)達(dá)到管底前停止，短時到管

17、底前停止，短時間，低速度間，低速度使各組分沉降到其平衡使各組分沉降到其平衡的密度區(qū)，長時間，高的密度區(qū)，長時間，高速度速度分離分離依據(jù)依據(jù)密度相近，但沉降系密度相近，但沉降系數(shù)不同數(shù)不同沉降系數(shù)相近，但密度沉降系數(shù)相近，但密度不同不同沉降速度離心和沉降平衡離心的特點沉降速度離心和沉降平衡離心的特點總結(jié)總結(jié)：等密度梯度離心等密度梯度離心是一種測定顆粒浮力密度是一種測定顆粒浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。使之包括待分離物的密度范圍。差速離心差速離心是一種動力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選是一種動力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物

18、的離心力。擇適合于各分離物的離心力。密度梯度離心密度梯度離心兼有以上兩種方法的特點，兼有以上兩種方法的特點，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。五、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同）五、沉淀分離（根據(jù)溶解度的不同） 通過改變條件或加入某種試劑，使溶液中的溶質(zhì)的溶解度降低，從而從溶液中沉淀析出。 濃縮作用濃縮作用 純化作用純化作用l在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：l 中性鹽沉淀（鹽析法）中性鹽沉淀（鹽析法）l 有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀l 選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）l 等電點沉淀等電點沉淀l 有

19、機聚合物沉淀有機聚合物沉淀（一）鹽析沉淀法（改變離子強度）（一）鹽析沉淀法（改變離子強度） 1. 基本原理（鹽溶和鹽析）基本原理（鹽溶和鹽析） 向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：產(chǎn)生兩種現(xiàn)象： 1) 鹽溶鹽溶（salting insalting in） ： 低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。 2) 鹽析鹽析（salting outsalting out） ： 高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響硫酸銨對馬血紅蛋白的溶解度的影響離子強度離子強度 原

20、因：原因： 高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。而沉淀。 不同蛋白質(zhì)表面極性基團、電荷數(shù)目和不同蛋白質(zhì)表面極性基團、電荷數(shù)目和分布不同，他們的鹽析濃度有差別。分布不同，他們的鹽析濃度有差別。 采用加入中性鹽的方法，使各種蛋白質(zhì)采用加入中性鹽的方法，使各種蛋白質(zhì)依次分別沉淀的方法依次分別沉淀的方法稱分段鹽析。稱分段鹽析。l1）中性鹽的選擇）中性鹽的選擇l 常用常用(NH4)2SO4，其突出優(yōu)點：，其突出優(yōu)點：l a. 溶解度大溶解度大l b. 分離效果好分離效果好l c. 不易引起

21、變性不易引起變性l d. 價格便宜價格便宜l2. 鹽析用鹽鹽析用鹽2) 鹽濃度的表示鹽濃度的表示 用飽和（溶解）度表示用飽和（溶解）度表示: 溶液中飽和硫酸銨的體積溶液中飽和硫酸銨的體積 飽和度飽和度 溶液的總體積溶液的總體積3) 調(diào)整鹽濃度的方式調(diào)整鹽濃度的方式 a. 飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽適用于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達(dá)到的鹽濃度又不太高時。濃度又不太高時。 配制飽和硫酸銨溶液配制飽和硫酸銨溶液所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計算：所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計算： S2-S1 V=V0 1-S2式中式

22、中 V,V0分別為所需加入的飽和硫酸銨分別為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積體積及原溶液體積S2,S1分別為所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和分別為所需達(dá)到的硫酸銨飽和度和原來溶液的硫酸銨飽和度原來溶液的硫酸銨飽和度b. 添加固體硫酸銨添加固體硫酸銨適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要達(dá)到的鹽濃度又很高時。達(dá)到的鹽濃度又很高時。按下式計算，得表中數(shù)據(jù)按下式計算，得表中數(shù)據(jù) B(S2-S1)W= 1-AS2A,B常數(shù)，與溫度有關(guān)。常數(shù)，與溫度有關(guān)。 實際使用時，可直接查表實際使用時，可直接查表 （各種飽和度下（各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。需加固體硫酸銨

23、的量）。調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表調(diào)整硫酸銨溶液飽和度計算表l低飽和度：低飽和度：飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過終飽和度不超過4040。l高飽和度：高飽和度：固體鹽添加法。不會大量增加溶液體積。固體鹽添加法。不會大量增加溶液體積。l1 1）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。）固體硫酸銨充分研細(xì)，溫和攪拌中緩慢加入。l2 2）冰箱中（）冰箱中（4 4）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。l3 3）沉淀再溶解后可用超濾）沉淀再溶解后可用超濾（ultrafiltrationultrafiltration）

24、 、透、透析析（dialysisdialysis）或?qū)游龌驅(qū)游觯╟hromatographychromatography）方法脫鹽。方法脫鹽。 硫酸銨濃度（硫酸銨濃度（% %） 枯草桿菌枯草桿菌 - -淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線 l1) 蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度：l 過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，2.5%-3%2.5%-3%最好。最好。 l2) pH值：值：等電點處最易沉淀。等電點處最易沉淀。l3) 溫度的影響：溫度的影響：l稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。l濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。濃鹽

25、溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。l 一般可在室溫下進(jìn)行。某些對溫度敏感的一般可在室溫下進(jìn)行。某些對溫度敏感的酶，可在酶，可在04下操作下操作。l4. 鹽析的影響因素鹽析的影響因素（二）（二） 有機溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）有機溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）l 利用酶等蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度利用酶等蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。不同而使之分離的方法。l1. 沉淀機理沉淀機理l 降低溶液的介電常數(shù)降低溶液的介電常數(shù)l 部分地引起蛋白質(zhì)脫水部分地引起蛋白質(zhì)脫水l2. 常用有機溶劑常用有機溶劑l 丙酮丙酮 乙醇乙醇 甲醇，用量一般為酶液體積甲醇，用量一般為酶液體積的的2 2倍左右，終濃

26、度為倍左右，終濃度為70%70%。 l3.優(yōu)缺點：優(yōu)缺點：l 優(yōu)點優(yōu)點：1）分辨率比鹽析法高分辨率比鹽析法高l 2） 沉淀不需脫鹽沉淀不需脫鹽l 3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心l缺點：缺點：1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活）容易引起蛋白質(zhì)變性失活l2)2)有機溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。有機溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。 l l4. 影響有機溶劑沉淀的因素影響有機溶劑沉淀的因素（1 1）溫度）溫度 ：低溫（低溫（0 0）操作。）操作。（2 2）pH pH 值：值：盡可能靠近其等電點。盡可能靠近其等電點。 （3 3）離子強度：）離子強度：采用采用 0.05mol/L0.05m

27、ol/L的稀鹽溶液的稀鹽溶液 增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度 目的目的 防止蛋白質(zhì)變性防止蛋白質(zhì)變性 （4 4）蛋白質(zhì)濃度：）蛋白質(zhì)濃度：適當(dāng)，一般為適當(dāng)，一般為5 52020mg/ml mg/ml （三）（三） 等電點沉淀等電點沉淀(isoelectric precipitation)(isoelectric precipitation) l1.原理原理l 蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低l 不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點 l2. 使用方法使用方法l 單獨單獨使用使用較少（較少（用于從粗酶液中除去某些等電用于從粗酶液

28、中除去某些等電點相距較大的雜蛋白）點相距較大的雜蛋白），多與其它方法聯(lián)合使用，多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機溶劑法），因（如鹽析法、有機溶劑法），因蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)在等電點時在等電點時仍有一定的溶解度。仍有一定的溶解度。l3. 優(yōu)點：優(yōu)點：l 1）大多數(shù)蛋白質(zhì)的大多數(shù)蛋白質(zhì)的pI都在偏酸性范圍內(nèi)都在偏酸性范圍內(nèi)l 2）無機酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低）無機酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低l 3）無需除掉多余酸即可進(jìn)行下一步純化）無需除掉多余酸即可進(jìn)行下一步純化l4. 缺點：缺點：l 酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活l （四）有機聚合物沉淀法（四）有機聚合物沉淀法 1.

29、 作用機理：作用機理： 與有機溶劑類似與有機溶劑類似 ，是發(fā)展較快的一種新方法。，是發(fā)展較快的一種新方法。2. 沉淀劑：沉淀劑：常用常用聚乙二醇聚乙二醇 （Polyethyene glycol，簡寫，簡寫 PEGPEG ） 多用分子量為多用分子量為600020000的的 PEG。3. 優(yōu)點：優(yōu)點：l操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。l沉淀效能高，使用少量的沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當(dāng)即可沉淀相當(dāng) l 多的生物大分子。多的生物大分子。l沉淀后有機聚合物容易去除。沉淀后有機聚合物容易去除。l（五）選擇性變性沉淀法（五）選擇性變性沉淀法l 選擇一

30、定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。 l 熱變性熱變性l 幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。l pH變性變性l 等電點沉淀法是等電點沉淀法是pH變性法中的一種變體。變性法中的一種變體。l 有機溶劑變性有機溶劑變性l 使那些對有機溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。使那些對有機溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀。六、萃?。?、萃取（extraction）分離）分離 一個液相中

31、的溶質(zhì)經(jīng)過物理或化學(xué)作用轉(zhuǎn)移一個液相中的溶質(zhì)經(jīng)過物理或化學(xué)作用轉(zhuǎn)移到另一液相的過程。到另一液相的過程。利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的利用溶質(zhì)在互不相溶的兩相之間分配系數(shù)的不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。不同而使溶質(zhì)得到純化或濃縮的方法。l特點：特點：l1）比沉淀法分離程度高）比沉淀法分離程度高l2）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快）比離子交換法選擇性好、傳質(zhì)快l3）比蒸餾法能耗低）比蒸餾法能耗低 （一）溶劑萃取法（一）溶劑萃取法 明確幾個概念：明確幾個概念：料液：料液：供提取的溶液。供提取的溶液。 溶質(zhì)：溶質(zhì)：料液中欲提取的物質(zhì)料液中欲提取的物質(zhì)。萃取劑萃取劑 ：用來進(jìn)行萃取的溶劑，通常

32、是有機溶劑用來進(jìn)行萃取的溶劑，通常是有機溶劑。萃取液萃取液 ：經(jīng)接觸分離后，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與經(jīng)接觸分離后，溶質(zhì)轉(zhuǎn)移到萃取劑中與 萃取劑形成的溶液萃取劑形成的溶液。萃余液：萃余液：被萃取出溶質(zhì)后的料液。被萃取出溶質(zhì)后的料液。反萃?。ǚ摧腿。╞ack extractionback extraction）：）：完成萃取操作后，完成萃取操作后， 將產(chǎn)物從有機相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。將產(chǎn)物從有機相轉(zhuǎn)入水相的萃取操作。 l溶劑萃取法是以分配定律（即溶質(zhì)的分配平溶劑萃取法是以分配定律（即溶質(zhì)的分配平衡規(guī)律衡規(guī)律 ）為基礎(chǔ)。）為基礎(chǔ)。l 在一定溫度、壓力下，溶質(zhì)分布在兩個在一定溫度、壓力下，溶質(zhì)分布在兩個互

33、不相溶的溶劑里，達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩互不相溶的溶劑里，達(dá)到平衡后，溶質(zhì)在兩相中的濃度比為一常數(shù)。相中的濃度比為一常數(shù)。l 萃取相濃度萃取相濃度 C1l分配系數(shù)分配系數(shù) K K0 0 = = l 萃余相濃度萃余相濃度 C2l K K0 0值隨溶液值隨溶液pHpH的變化甚大，這是用萃取的變化甚大，這是用萃取法實現(xiàn)溶質(zhì)提取的重要基礎(chǔ)。法實現(xiàn)溶質(zhì)提取的重要基礎(chǔ)。萃取操作的萃取操作的3 3個步驟：個步驟： 1）混合：料液和萃取劑充分混合）混合：料液和萃取劑充分混合 2）分離：萃取相和萃余相）分離：萃取相和萃余相 3）溶劑回收：分離有機溶劑）溶劑回收：分離有機溶劑l單級萃取單級萃取l 使用一個混合器和一個

34、分離器使用一個混合器和一個分離器l 單級萃取流程單級萃取流程93l 普通有機溶劑萃取難以進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離，普通有機溶劑萃取難以進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離， l 因為因為:l1） 蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機溶劑蛋白質(zhì)親水性，不溶于有機溶劑l2） 蛋白質(zhì)在有機相中易變性失活蛋白質(zhì)在有機相中易變性失活 故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小故溶劑萃取法一般僅用于抗生素等小分子生物物質(zhì)的提取。分子生物物質(zhì)的提取。 （二）（二） 雙水相萃取技術(shù)雙水相萃取技術(shù)l 又稱水溶液兩相分配技術(shù)又稱水溶液兩相分配技術(shù)l（partion of two aqueous phase systempartion of two aqueous

35、 phase system） l 用兩種不相溶的親水性高分子聚用兩種不相溶的親水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（合物水溶液，如聚乙二醇（PEGPEG）和葡）和葡聚糖（聚糖（DextranDextran）進(jìn)行萃取。由于形成）進(jìn)行萃取。由于形成的兩相均有很高的含水量（達(dá)的兩相均有很高的含水量（達(dá)70%70%90%90%），故稱），故稱“雙水相雙水相”系統(tǒng)。系統(tǒng)。 l優(yōu)點：優(yōu)點：l1 1）每一相中均有很高的含水量，為每一相中均有很高的含水量，為 酶等生物物質(zhì)提供了一個良好的環(huán)境；酶等生物物質(zhì)提供了一個良好的環(huán)境；l2 2）PEGPEG、DextranDextran和無機鹽對酶等無毒和無機鹽對酶等無

36、毒 害作用，不會引起變性。害作用，不會引起變性。 雙水相的形成：雙水相的形成： 兩種不同水溶性聚合物濃度達(dá)兩種不同水溶性聚合物濃度達(dá)到一定值時，體系會自然地分成互不到一定值時，體系會自然地分成互不相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。相容的兩相，構(gòu)成雙水相體系。 l 幾種典型的雙水相系統(tǒng)幾種典型的雙水相系統(tǒng)l聚丙二醇聚丙二醇 聚乙二醇、聚乙烯醇聚乙二醇、聚乙烯醇l 葡聚糖（葡聚糖（Dex）l 羥丙基葡聚糖羥丙基葡聚糖l聚乙二醇（聚乙二醇（ PEG） 葡聚糖（葡聚糖（Dex）l硫酸葡聚糖鈉鹽硫酸葡聚糖鈉鹽 聚丙烯乙二醇聚丙烯乙二醇l羧基甲基葡聚糖鈉鹽羧基甲基葡聚糖鈉鹽 甲基纖維素甲基纖維素l聚乙二醇（聚乙

37、二醇（ PEG） 磷酸鉀、磷酸鉀、硫酸銨硫酸銨l 硫酸鈉、硫酸鎂硫酸鈉、硫酸鎂2. 萃取原理：萃取原理： 利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇利用生物物質(zhì)在雙水相體系中的選擇性分配。性分配。3. 應(yīng)用應(yīng)用: 除去細(xì)胞碎片，并使酶得到純化。除去細(xì)胞碎片，并使酶得到純化。l 幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實例幾種典型的雙水相萃取酶蛋白實例 酶酶 菌菌 種種 相系統(tǒng)相系統(tǒng)l延胡索酸酶延胡索酸酶 Brevibacterium sp. PEG/ 鹽鹽l天冬氨酸酶天冬氨酸酶 E. coli PEG/ 鹽鹽l -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 E. coli PEG/ 鹽鹽l亮氨酸脫氫酶亮氨酸脫氫酶 Bacillus sp.

38、 PEG/Dexl乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶 Bakers yeast PEG/ 鹽鹽l青霉素?；盖嗝顾仵；?E. coli PEG/ 鹽鹽 雙水相萃取法的重要研究方向雙水相萃取法的重要研究方向 親和萃?。ㄓH和分配親和萃?。ㄓH和分配 ） 使用具有生物特異性的配基（使用具有生物特異性的配基（ligandligand）來提高分離選擇性和產(chǎn)品的純度。來提高分離選擇性和產(chǎn)品的純度。配基以游離或以共價結(jié)合方式與聚合物配基以游離或以共價結(jié)合方式與聚合物（PEG)PEG)聯(lián)接在一起的形式存在于系統(tǒng)中，聯(lián)接在一起的形式存在于系統(tǒng)中，配基與欲提取的蛋白質(zhì)有很強的親和力。配基與欲提取的蛋白質(zhì)有很強的親和力。 蛋白質(zhì)

39、蛋白質(zhì)配基配基胰蛋白酶胰蛋白酶胰蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶三嗪染料三嗪染料甲酸脫氫酶甲酸脫氫酶三嗪染料三嗪染料葡糖葡糖-6-6-磷酸脫氫酶磷酸脫氫酶三嗪染料三嗪染料l（三）（三） 超臨界流體萃取超臨界流體萃取l 兼有蒸餾和溶液萃取的特征，兼有蒸餾和溶液萃取的特征，與常與常規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為規(guī)溶劑萃取的區(qū)別：將超臨界流體作為萃取劑。萃取劑。 l 超臨界流體超臨界流體(supercritical fluid(supercritical fluid，SCFSCF）：超過氣液共存時的最高壓力和最：超過氣液共存時的最高壓力和最高溫度下物質(zhì)特有的點高溫度下物質(zhì)特有的

40、點臨界點后的臨界點后的流體流體。 臨界點的概念臨界點的概念可用臨界溫度和臨界可用臨界溫度和臨界壓力解釋：壓力解釋：l臨界溫度：臨界溫度：高于此溫度時，無論加壓高于此溫度時，無論加壓多大也不能使氣體液化。多大也不能使氣體液化。l臨界壓力：臨界壓力：在臨界溫度下，液化氣體在臨界溫度下，液化氣體所需要的壓力。所需要的壓力。l lSCF性質(zhì)性質(zhì)介于液體和氣體之間介于液體和氣體之間 ：l1) SCF密度接近于液體，溶解度高。密度接近于液體，溶解度高。l2) SCF粘度和擴散系數(shù)接近于氣體，粘度和擴散系數(shù)接近于氣體， 傳質(zhì)擴散快傳質(zhì)擴散快。l基本過程：基本過程：l1）在）在SCF中，溶解度大的物質(zhì)溶于中，

41、溶解度大的物質(zhì)溶于其中，與不溶解或溶解度小的物質(zhì)其中，與不溶解或溶解度小的物質(zhì)分開。分開。l2）降低壓力，使）降低壓力，使SCF變?yōu)闅鈶B(tài)（密變?yōu)闅鈶B(tài)（密度降低），溶解物質(zhì)能力下降，萃度降低），溶解物質(zhì)能力下降，萃取物與溶劑分離。取物與溶劑分離。l常用超臨界液態(tài)常用超臨界液態(tài)CO2作為萃取劑，作為萃取劑， l 因為：因為：l1）液體）液體CO2無毒無毒l2）臨界溫度（）臨界溫度（304.06K）接近常溫）接近常溫l3）臨界壓力（）臨界壓力（7.38MPa）較低）較低l4）操作安全）操作安全l超臨界超臨界CO2萃取技術(shù)在生物、食品萃取技術(shù)在生物、食品l等工業(yè)中的應(yīng)用等工業(yè)中的應(yīng)用l CO2萃取部分

42、產(chǎn)品萃取部分產(chǎn)品l原料名稱原料名稱 產(chǎn)物名稱產(chǎn)物名稱 原料名稱原料名稱 產(chǎn)物名稱產(chǎn)物名稱l小麥胚芽小麥胚芽 胚芽油胚芽油 豆子豆子 豆油精煉油豆油精煉油l啤酒花啤酒花 啤酒花精油啤酒花精油 茉莉花茉莉花 凈油凈油l辣椒辣椒 辣椒紅色素辣椒紅色素 菊花根菊花根 除蟲菊酯除蟲菊酯l當(dāng)歸當(dāng)歸 精油精油 紫草紫草 紫草寧紫草寧l銀杏葉銀杏葉 銀杏內(nèi)酯銀杏內(nèi)酯 花生花生 精煉油精煉油（四）（四） 反膠團萃取反膠團萃取l1. 反膠團：反膠團：又稱反膠束（又稱反膠束（Reversed Micelles）l 指指表面活性劑表面活性劑（由親水的極性基團和疏水由親水的極性基團和疏水的非極性基團兩部分組成）分散在連

43、續(xù)的非極性基團兩部分組成）分散在連續(xù)有機溶有機溶劑劑中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級的聚集體中自發(fā)形成的一種穩(wěn)定的納米級的聚集體。 反膠團模型反膠團模型親水基團向內(nèi)聚集親水基團向內(nèi)聚集lp154 2. 表面活性劑及有機溶劑表面活性劑及有機溶劑l 反膠團萃取與溶劑萃取的不同，是反膠團萃取與溶劑萃取的不同，是在有機溶劑中加入了少量表面活性劑。在有機溶劑中加入了少量表面活性劑。 反膠團萃取原理反膠團萃取原理 l（1）表面活性劑）表面活性劑l 常用：常用： AOT(Aerosol OT)（陰離子表面活（陰離子表面活性劑，琥珀酸性劑，琥珀酸2-乙基己基酯磺酸鈉）。乙基己基酯磺酸鈉）。l特點：特點：易獲得，強

44、度好；極性基團小，形成的易獲得，強度好；極性基團小，形成的反膠團空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子反膠團空間較大，有利于蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)入。進(jìn)入。 l（2） 非極性有機溶劑非極性有機溶劑 環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。環(huán)己烷、庚烷、辛烷、異辛烷、己醇、硅油。 3. 萃取過程萃取過程第一步：第一步：將酶從水相中萃取到反膠束相中。將酶從水相中萃取到反膠束相中。第二步：第二步：將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相將酶蛋白從反膠束轉(zhuǎn)移到第二種水相 中，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的反萃取過程。中，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的反萃取過程。l4. 優(yōu)點優(yōu)點l1）萃取率和反萃取率高。）萃取率和反萃取率高。l2）分離濃縮同時進(jìn)行

45、，溶劑可反復(fù)利用。）分離濃縮同時進(jìn)行，溶劑可反復(fù)利用。l3 3）解決胞內(nèi)酶溶劑萃取環(huán)境中迅速失活問題。解決胞內(nèi)酶溶劑萃取環(huán)境中迅速失活問題。l4）破壁功能，直接從完整細(xì)胞提取酶蛋白。）破壁功能，直接從完整細(xì)胞提取酶蛋白。l5）成本低。）成本低。一、膜分離一、膜分離 利用一種特殊的具有選擇性透過功能的利用一種特殊的具有選擇性透過功能的薄層物質(zhì)，使流體內(nèi)的一種或幾種物質(zhì)透過，薄層物質(zhì)，使流體內(nèi)的一種或幾種物質(zhì)透過，而其他物質(zhì)不能夠過，從而起到濃縮和分離而其他物質(zhì)不能夠過，從而起到濃縮和分離純化作用的技術(shù)。純化作用的技術(shù)。優(yōu)點：優(yōu)點：沒有相變，無二次污染，過程簡單，沒有相變，無二次污染，過程簡單，易

46、自動化。易自動化。第二節(jié)第二節(jié) 酶的精制酶的精制（一）（一） 擴散膜分離擴散膜分離 透析透析（dialysis）溶質(zhì)分子溶質(zhì)分子Y 從高濃度一側(cè)通過膜向低濃度一側(cè)移動從高濃度一側(cè)通過膜向低濃度一側(cè)移動蛋白質(zhì)透析蛋白質(zhì)透析 1. 透析膜透析膜 1）在溶液中形成分子篩多孔薄膜，阻止大分子通過。 2）化學(xué)惰性 3）一定的機械強度和良好的再生性能。 商品透析膜大多制成管狀商品透析膜大多制成管狀 。 材料：纖維素衍生物。材料：纖維素衍生物。1）透析膜的預(yù)處理：）透析膜的預(yù)處理：蒸餾水洗滌或者乙醇煮沸2）透析袋的保存）透析袋的保存 ：防腐劑冷藏。超濾超濾 (ultrafiltrationultrafilt

47、ration，UFUF ) 超濾原理的示意圖超濾原理的示意圖 u利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯留，而小分子及溶劑濾過的方法。子滯留，而小分子及溶劑濾過的方法。u超濾膜為非對稱膜：超濾膜為非對稱膜：1）分離層：薄，具有）分離層：薄，具有一定尺寸孔徑，分離作用。一定尺寸孔徑，分離作用。2）多孔層：厚，）多孔層：厚，海綿狀，支撐作用。海綿狀，支撐作用。u超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。中有廣泛的應(yīng)用。u濃度極化：由于小分子溶質(zhì)通過膜，而大分濃度極化：由于小分子溶質(zhì)通過膜，而大分子溶質(zhì)被截留于膜面，漸

48、漸形成濃度梯度。子溶質(zhì)被截留于膜面，漸漸形成濃度梯度。常規(guī)過濾常規(guī)過濾(A)(A)和超濾和超濾(B)(B)的示意圖的示意圖 A AB圖圖4-61 超濾濃縮裝置超濾濃縮裝置 l影響流率（一定壓力下每分鐘通過單位面積膜的液一定壓力下每分鐘通過單位面積膜的液體量體量）的因素：l1）溶質(zhì)的分子性質(zhì)：）溶質(zhì)的分子性質(zhì)：比重大的纖維狀分子擴散性差比重大的纖維狀分子擴散性差l2）溶質(zhì)濃度：）溶質(zhì)濃度：l3）壓力：）壓力：不同溶質(zhì)選擇不同的壓力操作不同溶質(zhì)選擇不同的壓力操作l4）攪拌：）攪拌：蛋白質(zhì)對攪拌產(chǎn)生的剪切力敏感蛋白質(zhì)對攪拌產(chǎn)生的剪切力敏感l(wèi)5）溫度：）溫度：一般為低溫一般為低溫l 層析法也稱色譜法，

49、是層析法也稱色譜法，是19031903年俄國年俄國植物學(xué)家植物學(xué)家Michael TswettMichael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過裝有將植物色素溶液通過裝有CaCOCaCO3 3 吸附劑吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開。被分開。l 色譜起源色譜起源色譜色譜組分色素石油醚石油醚碳酸鈣顆粒 用色彩（用色彩（chromachroma）和圖譜（）和圖譜（graphsgraphs）組）組成色譜一詞（成色譜一詞（Chromatography) Chrom

50、atography) 。l 利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在流動相和固力、分配系數(shù)等），使各組分在流動相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動而達(dá)到分離的目的。動而達(dá)到分離的目的。：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體：靜止不動的一相：靜止不動的一相l(xiāng) 按層析過程的機理分類：按層析過程的機理分類：吸附層析吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異。能的差異。

51、分配層析分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數(shù)的不同。間的分配系數(shù)的不同。離子交換層析離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。和力的不同。凝膠層析凝膠層析：利用某些凝膠對于不同分子大小的：利用某些凝膠對于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。組分阻滯作用的不同。1. 基本原理基本原理 大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來； 小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長而小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長而后流出

52、層析柱。后流出層析柱。凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)KdKd表示：表示： Ve-Vo Kd= ViVo外水體積外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（的體積（ml）Vi內(nèi)水體積內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（孔體積的總和（ml）Ve某組分的洗脫體積某組分的洗脫體積，從加進(jìn)層析柱到流，從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（ml）凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰. K. Kd d=0=0時時, ,即即Ve=Vo,Ve=Vo,說

53、明該組分分子量足夠大，不進(jìn)入微孔，最說明該組分分子量足夠大，不進(jìn)入微孔，最先流出。先流出。. K. Kd d=1=1時時, ,即即Ve=Vo+ViVe=Vo+Vi，說明該組分能進(jìn)入凝膠的全部內(nèi)空隙，說明該組分能進(jìn)入凝膠的全部內(nèi)空隙，最后流出。最后流出。. . 其它組分其它組分0K0Kd d1,1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。因分子大小而改變洗脫峰的位置。KdKd小的先小的先流出，流出，KdKd大的后流出。大的后流出。 分配系數(shù)分配系數(shù)Kd的意義：的意義：1) 可定量地衡量各組分的流出順序?？啥康睾饬扛鹘M分的流出順序。2) 判斷分離效果，判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好，差異大，分離效果

54、好， Kd差異小，分離效果差。差異小，分離效果差。2.2.凝膠的種類和性質(zhì)凝膠的種類和性質(zhì) 1)1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（交聯(lián)葡聚糖凝膠（dextran gel)dextran gel) 商品名商品名:Sephadex:Sephadex 型號型號 Sephadex GSephadex G1010至至G-200 G-200 G G 后的數(shù)字為凝膠吸水量。數(shù)字越后的數(shù)字為凝膠吸水量。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。越廣。凝膠型號凝膠型號 顆粒大小顆粒大小/m/m 溶脹體積溶脹體積/(ml/g)/(ml/g) 分離范圍（分離范圍（MrMr） Sephadex

55、 G-10Sephadex G-10 Sephadex G-15Sephadex G-15 Sephadex G-25Sephadex G-25 Sephadex G-50Sephadex G-50 Sephadex G-75Sephadex G-75 Sephadex G-100Sephadex G-100 Sephadex G-150Sephadex G-150Sephadex G-200Sephadex G-2004 4120120 4 4120120 5050150150 5050150150 4040120120 4040120120 4040120120 4040120120 2

56、23 3 2.52.53.53.5 4 46 6 9 91111 12121515 15152020 20203030 20203030 小于小于7 710102 2 小于小于1.51.510103 3 1.01.010103 35.05.010103 3 1.51.510103 33.03.010104 43.03.010103 38.08.010104 4 4.04.010103 31.01.010105 5 5.05.010103 33.03.010105 5 5.05.010103 36.06.010105 5 葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù)葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù) 2 2）瓊脂糖凝

57、膠（）瓊脂糖凝膠（agarose gel)agarose gel) 商品名商品名:Sepharose :Sepharose （瑞典）（瑞典）; ; Bio-Gel A ( Bio-Gel A (美國）美國） 依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。型號型號 使用范圍（蛋白質(zhì)的分子量）使用范圍（蛋白質(zhì)的分子量）含瓊脂糖含瓊脂糖（） 6B 6BSepharose 4BSepharose 4B 2B 2B10104 43 310106 610105 53 310107 710106 610108 8 6 64

58、 4 2 2 6B 6BSepharose CL 4BSepharose CL 4B 2B 2B 同上同上 同上同上 0.5m 0.5m Bio-Gel A 1.5m Bio-Gel A 1.5m 5m 5m 15m 15m 50m 50m 150m 150m101050050010103 3101015001500101050005000404015000150001001005000050000 1000 1000150000150000 10108 86 64 42 2 1 1 SepharoseSepharose及及Bio-gel A Bio-gel A 型號型號 3 3）聚丙烯酰胺凝

59、膠）聚丙烯酰胺凝膠 （polyacrylamide gelpolyacrylamide gel） 商品名為商品名為Bio-Gel,Bio-Gel,型號從型號從 Bio-Gel PBio-Gel P2 2至至P-300P-300，P P值越大，孔徑也越大。值越大，孔徑也越大。 以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。3. 操作：操作：1）凝膠的選擇和處理）凝膠的選擇和處理 根據(jù)相對分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號的根據(jù)相對分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號的凝膠介質(zhì)。凝膠介質(zhì)。（分子質(zhì)量相差很大，選用交聯(lián)程度大的凝膠作為介質(zhì)）

60、 將干膠懸浮于將干膠懸浮于510倍的倍的蒸餾水中蒸餾水中 ，充分，充分溶脹，再用溶脹，再用NaOH-NaCl浸泡浸泡0.5h，用蒸餾水，用蒸餾水洗至中性。洗至中性。2）柱的選擇）柱的選擇 采用采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速但影響流速。l3）裝柱）裝柱 干裝和濕裝干裝和濕裝l4）流動相對選擇：）流動相對選擇：平衡時用的平衡時用的buffer一致一致l5）上樣）上樣l 體積不能過多，不超過床體積的體積不能過多，不超過床體積的5，脫鹽時可在，脫鹽時可在 10左右。左右。l6）洗脫）洗脫 洗脫液與平衡時用的洗脫液與平衡時用的buffer一致。一致。 洗速不