色譜法液相PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1色譜法液相色譜法液相2第1頁/共55頁3固定相為固體吸附劑，屬吸附色譜固定相為固體吸附劑，屬吸附色譜（一）分離原理（一）分離原理第2頁/共55頁4（二）、吸附劑（二）、吸附劑對吸附劑的要求：對吸附劑的要求：（1 1）具有較大的表面積和一定的吸附能力）具有較大的表面積和一定的吸附能力（2 2）顆粒要有一定的細度）顆粒要有一定的細度(d=75-150m(d=75-150m，即，即100-200100-200目目) )，且粒度均勻，且粒度均勻（3 3）與洗脫劑及樣品不起反應(yīng)）與洗脫劑及樣品不起反應(yīng)常用：硅膠、氧化鋁、聚酰胺、活性炭、大孔樹脂常用：硅膠、氧化鋁、聚酰胺、活性炭、大孔樹脂第3頁/

2、共55頁5吸附機制：吸附機制： 表面的硅醇基，與物質(zhì)形成氫鍵表面的硅醇基，與物質(zhì)形成氫鍵適用范圍：適用范圍：微酸性（微酸性（pH=45），）， 適于酸性和中性物質(zhì)適于酸性和中性物質(zhì)失活：失活：水與硅醇基結(jié)合使其失去活性水與硅醇基結(jié)合使其失去活性活化：活化：105-110105-110加熱加熱30min30min粒度：粒度：100-200100-200目目1. 硅膠（硅膠（SiO2H2O）中等極性吸附劑中等極性吸附劑第4頁/共55頁62. 氧化鋁氧化鋁第5頁/共55頁7硅膠、氧化鋁的含水量與活性關(guān)系硅膠、氧化鋁的含水量與活性關(guān)系 硅膠含水量硅膠含水量%活度級活度級氧化鋁含水量氧化鋁含水量%005

3、315625103815活度測定法：活度測定法：BrockmamnBrockmamn法法第6頁/共55頁83 3、聚酰胺、聚酰胺CH 2CH CH CH CH CONH2222n商品名：錦綸、尼龍商品名：錦綸、尼龍-6不溶于水和有機溶劑，易溶于濃無機不溶于水和有機溶劑，易溶于濃無機酸酸分離機制：主要是分離機制：主要是氫鍵吸附氫鍵吸附適用對象：適用對象：黃酮類、鞣質(zhì)、醌黃酮類、鞣質(zhì)、醌粒度：粒度：2020100100目目氫鍵能力氫鍵能力強強組分越后出柱組分越后出柱 第7頁/共55頁9依據(jù)被測組分、吸附劑和流動相的性質(zhì)依據(jù)被測組分、吸附劑和流動相的性質(zhì)第8頁/共55頁酸性成分：硅膠酸性成分：硅膠

4、堿性成分：氧化鋁堿性成分：氧化鋁 黃酮類：聚酰胺黃酮類：聚酰胺用量：用量： 化學(xué)分離：化學(xué)分離：30倍倍 除雜：除雜：10倍倍第9頁/共55頁113、流動相的選擇、流動相的選擇流動相極性：流動相極性：烷烴烷烴 苯苯 乙醚乙醚 氯仿氯仿 酯酯 酮酮 醇醇 1.51.5 使待測組分的使待測組分的R Rf f在在0.30.30.50.5 展開后各斑點圓而集中，不拖尾展開后各斑點圓而集中，不拖尾 具有適中的沸點和小的粘度具有適中的沸點和小的粘度 臨用前配制臨用前配制2 2、展開劑、展開劑第34頁/共55頁36展開劑的組成：單一溶劑、多元溶劑展開劑的組成：單一溶劑、多元溶劑 單一溶劑：重現(xiàn)性好，分離能力

5、差單一溶劑：重現(xiàn)性好，分離能力差 多元展開劑：可改善分離效果，重現(xiàn)性差多元展開劑：可改善分離效果，重現(xiàn)性差展開系統(tǒng)的優(yōu)化展開系統(tǒng)的優(yōu)化優(yōu)化原則：優(yōu)化原則：先調(diào)整展開劑極性使待測組分先調(diào)整展開劑極性使待測組分R Rf f值適中，保持這個極性不變，改變展開劑值適中，保持這個極性不變，改變展開劑的選擇性，直至所有組分有合適的分離度的選擇性，直至所有組分有合適的分離度第35頁/共55頁Stahl圖解法圖解法展開劑展開劑極性極性非極性非極性V活性活性I吸附劑吸附劑待測物待測物非極性非極性極性極性展開系統(tǒng)的優(yōu)化展開系統(tǒng)的優(yōu)化Rf值的決定因素：值的決定因素：組分極性組分極性展開劑的極性展開劑的極性 吸附劑的

6、活性吸附劑的活性第36頁/共55頁38 加入少量的酸堿加入少量的酸堿常用酸：常用酸：甲酸、冰醋酸甲酸、冰醋酸常用堿：常用堿：濃氨水、乙二胺濃氨水、乙二胺展開系統(tǒng)的優(yōu)化展開系統(tǒng)的優(yōu)化 展開劑用量：展開劑用量：展開劑浸沒薄板下端約展開劑浸沒薄板下端約0.5cm0.5cm第37頁/共55頁39常用展開系統(tǒng)常用展開系統(tǒng)人參皂苷、黃芪甲苷：人參皂苷、黃芪甲苷：氯仿氯仿-甲醇甲醇-水（水（65：35：10，下層），下層）正丁醇正丁醇-醋酸乙酯醋酸乙酯-水（水（4：1：5，上層），上層）黃酮苷：黃酮苷：醋酸乙酯醋酸乙酯-丁酮丁酮-甲酸甲酸-水（水（10：1：1：1）糖：糖：正丁醇正丁醇-冰醋酸冰醋酸-水（水

7、（4 4：1 1：5 5，上層），上層）展開系統(tǒng)的優(yōu)化展開系統(tǒng)的優(yōu)化中等極性：中等極性：甲苯甲苯-醋酸乙酯醋酸乙酯-甲酸甲酸（1010：3 3：0.5)0.5) 第38頁/共55頁40苯苯醋酸乙酯醋酸乙酯甲醇甲醇異丙醇異丙醇濃氨水濃氨水（6：3：1.5：1.5：0.5）展開系統(tǒng)的優(yōu)化展開系統(tǒng)的優(yōu)化第39頁/共55頁413 3、展開過程的控制、展開過程的控制（1）展開方式：多次、分步展開）展開方式：多次、分步展開ABAB一次展開一次展開多次展開多次展開第40頁/共55頁原因：低極性低沸點物質(zhì)在薄層板邊緣易揮原因：低極性低沸點物質(zhì)在薄層板邊緣易揮發(fā)發(fā)產(chǎn)生邊緣效應(yīng)產(chǎn)生邊緣效應(yīng)克服辦法：克服辦法： a

8、 “預(yù)飽和預(yù)飽和” b 層析缸內(nèi)壁貼浸濕的濾紙條層析缸內(nèi)壁貼浸濕的濾紙條 c 點樣時不要太靠邊緣點樣時不要太靠邊緣展開過程的控制展開過程的控制（2 2）溶劑蒸氣的飽和程度）溶劑蒸氣的飽和程度第41頁/共55頁43（3 3）濕度）濕度相對濕度硫酸（ml）+水（ml）32%6810042%5710058%39.510065%3410072%27.510088%1.8100（4 4）溫度）溫度展開過程的控制展開過程的控制第42頁/共55頁441、定位方法：日光檢視、定位方法：日光檢視 紫外光紫外光365nm下檢視下檢視 紫外光紫外光254nm下檢視下檢視檢檢 測測熒光熒光淬滅淬滅斑點斑點第43頁/共

9、55頁45a 噴霧顯色噴霧顯色注意：噴霧顯色前展開劑須注意：噴霧顯色前展開劑須揮干揮干 噴霧宜噴霧宜細而均勻細而均勻 b 浸漬顯色浸漬顯色注意：注意： 浸漬液溶劑易揮發(fā)，否則斑點擴散浸漬液溶劑易揮發(fā)，否則斑點擴散 浸漬時間為幾秒浸漬時間為幾秒檢檢 測測2 2、顯色劑：與待測物質(zhì)反應(yīng)生成有色化合物、顯色劑：與待測物質(zhì)反應(yīng)生成有色化合物第44頁/共55頁46 1） 加熱加熱 加熱時應(yīng)把握好時間和溫度，特加熱時應(yīng)把握好時間和溫度，特別在定量時應(yīng)注意別在定量時應(yīng)注意(常常510min) 2）防止顯色后褪色）防止顯色后褪色加熱顯色后的板加熱顯色后的板蓋上一潔凈的玻板并封蓋上一潔凈的玻板并封邊，放邊，放置

10、于干燥器中置于干燥器中注意：注意：檢檢 測測第45頁/共55頁47四、高效薄層色譜法（四、高效薄層色譜法（HPTLCHPTLC）高效薄層板：粒度高效薄層板：粒度510m m 普通板：普通板：1040m m特點：點樣量小，展距短，特點：點樣量小，展距短， 斑點集中，分離度好，斑點集中，分離度好， 靈敏度高靈敏度高第46頁/共55頁48五、聚酰胺薄層色譜法五、聚酰胺薄層色譜法聚酰胺色譜是分離黃酮類是最有效的方聚酰胺色譜是分離黃酮類是最有效的方法法常用溶劑系統(tǒng)常用溶劑系統(tǒng)苷元：氯仿苷元：氯仿- -甲醇（甲醇（9696：6 6） 氯仿氯仿- -甲醇甲醇- -甲酸（甲酸（3030：2020：1 1） 苷

11、：苷： 甲醇甲醇- -水（水（4 4：1 1） 30%30%60%60%醋酸醋酸第47頁/共55頁49六、紙色譜法六、紙色譜法1、載體：紙、載體：紙 固定相：纖維素結(jié)合的固定相：纖維素結(jié)合的水水，屬屬正相正相分配色譜分配色譜 展開劑：有機溶劑（正丁醇）展開劑：有機溶劑（正丁醇）2 2、適用：極性化合物（多糖）、適用：極性化合物（多糖）第48頁/共55頁CHOC-OHHCHOH-CH-OHCH-OHCH -OH2CHOCHOH-CH-OHCH-OHOH-CHCH3CHOCH-OHCH-OHCH-OHCH 2CH3葡萄糖葡萄糖鼠李糖鼠李糖毛地黃毒毛地黃毒糖糖極性極性最強最強其次其次最弱最弱Rf值值

12、最小最小其次其次最大最大3、Rf值與物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系：值與物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的關(guān)系：第49頁/共55頁51樣品預(yù)處理樣品預(yù)處理七、薄層色譜法的應(yīng)七、薄層色譜法的應(yīng)用用第50頁/共55頁52依據(jù)：固定色譜條件下，相同物質(zhì)的依據(jù)：固定色譜條件下，相同物質(zhì)的Rf值相同值相同供試品供試品 對照藥對照藥材材 對照品對照品 陰性對陰性對照照1 2 3 4（一）定性鑒別（一）定性鑒別第51頁/共55頁531、 限量檢查限量檢查如：附子中烏頭堿的限量檢查如：附子中烏頭堿的限量檢查1. 烏頭堿對照烏頭堿對照品品2，3，4. 樣品樣品1 2 3 4（二）定量分析（二）定量分析第52頁/共55頁2 2、洗脫測定法、洗脫測定法準確吸取準確吸取直線狀點樣，直線狀點樣，置于置于層析缸層析缸中，展至中，展至14cm14cm，取出晾干，于紫外燈下，取出晾干，于紫外燈下，用針將用針將R Rf f值約為值約為0.40.4的鹽酸嗎啉雙胍譜帶的鹽酸嗎啉雙胍譜帶劃出，劃出，用刮刀將譜帶全部刮入用刮刀將譜帶全部刮入100 ml100 ml容量容量瓶中，瓶中，準確加入準確加入50ml50ml蒸餾水，振搖蒸餾水，振搖靜置靜置離心。準確吸取上清液離心。準確吸取上清液以蒸餾水作參以蒸餾水作參比，在比，在237nm237nm處處測其吸光度測其吸光度鹽酸嗎啉雙胍分