飼料中有毒有害物質(zhì)的測定

1、7/3/20221飼料中有毒有害物質(zhì)的測定飼料中有毒有害物質(zhì)的測定黎觀紅黎觀紅江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院7/3/20222 9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定飼料中有毒有害物質(zhì)的測定P244（一）飼料質(zhì)量（一）飼料質(zhì)量n營養(yǎng)質(zhì)量：營養(yǎng)質(zhì)量：飼料營養(yǎng)成分含量；n技術(shù)質(zhì)量：技術(shù)質(zhì)量：飼料的物理特性、如顆粒大小、形狀、硬度、適口性適口性等、混合均勻度；n衛(wèi)生（安全）質(zhì)量：衛(wèi)生（安全）質(zhì)量：對動物、人和環(huán)境的安全；n情緒質(zhì)量：情緒質(zhì)量：倫理標(biāo)準(zhǔn)或感覺可影響對質(zhì)量的討論， 如有爭議的動物性原料 或人造著色劑和調(diào)味劑。 一、概述一、概述公眾對飼料質(zhì)量重要性的認識的變化公眾對飼料質(zhì)量重要性的

2、認識的變化 表表1 7/3/20223 9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定飼料中有毒有害物質(zhì)的測定（二）幾起典型的飼料安全事故（二）幾起典型的飼料安全事故世紀(jì)年代中期至年代中期瘋牛病瘋牛?。ā芭：＞d狀腦病” ）的暴發(fā)流行。1999年1月15日以來，比利時、荷蘭、法國、德國相繼發(fā)生因動物飼料被二惡英二惡英污染，導(dǎo)致畜禽類產(chǎn)品及乳制品含高濃度二惡英事件。 “瘦肉精瘦肉精”中毒問題、“毒奶粉（毒奶粉（2008）”、“紅心鴨蛋（使用紅心鴨蛋（使用蘇丹紅，蘇丹紅，2006）”、“多寶魚（藥物殘留，多寶魚（藥物殘留，2006）”等。 “配合飼料有毒”、“配合飼料生產(chǎn)的肉蛋奶不能吃”、“小孩肥胖原因是吃了含激素的

3、肉”。 一、概述一、概述飼料安全等于畜產(chǎn)品安全！飼料安全等于畜產(chǎn)品安全！ 7/3/20224蘇丹紅蘇丹紅三聚氰胺三聚氰胺n瘋牛病n二惡英n瘦肉精n三聚氰胺n蘇丹紅（紅心鴨蛋）n孔雀石綠（水產(chǎn)品）n抗生素等藥物殘留n7/3/20225“飼料雞飼料雞”“土雞土雞”新概念雞蛋全是新概念雞蛋全是“扯蛋扯蛋”？ 7/3/20226 9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定飼料中有毒有害物質(zhì)的測定（三）飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（三）飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)強制性國家標(biāo)準(zhǔn)強制性國家標(biāo)準(zhǔn) 對飼料中有獨有害物質(zhì)及有害微生物以法律形式做出的統(tǒng)一規(guī)定。* 19911991年版年版飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：n覆蓋面較小覆蓋面較小，造成許多事故糾紛無判定

4、依據(jù)，一些重要的產(chǎn)品衛(wèi)生指標(biāo)沒有規(guī)定等。一、概述一、概述7/3/20227 9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定飼料中有毒有害物質(zhì)的測定（三）飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（三）飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)強制性國家標(biāo)準(zhǔn)強制性國家標(biāo)準(zhǔn)* 2001年新版年新版GB130782001飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)： n有害物質(zhì)及微生物衛(wèi)生指標(biāo)項目增加了“鉻鉻”在皮革、蛋白粉和雞、豬配合飼料中的允許量指標(biāo)。即由原標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的即由原標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的16項，修訂為項，修訂為17項。項。n新版標(biāo)準(zhǔn)覆蓋的產(chǎn)品品種達66種，是原標(biāo)準(zhǔn)的3倍多。n砷在磷酸鹽產(chǎn)品中的允許量指標(biāo)由每千克產(chǎn)品10毫克，修訂為20毫克。n氟在磷酸氫鈣產(chǎn)品中的允許量指標(biāo)由每千克2000毫克，修

5、訂為1800毫克。n黃曲霉毒素B1指標(biāo)將肉用仔雞配合飼料分為前期料和后期料，其允許量分別為每千克飼料中10微克和20微克。n補充規(guī)定了與各項指標(biāo)相對應(yīng)的試驗方法，補充規(guī)定了與各項指標(biāo)相對應(yīng)的試驗方法，消除了原標(biāo)準(zhǔn)沒有指明特定試驗方法的缺陷。一、概述一、概述7/3/20228 9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定飼料中有毒有害物質(zhì)的測定（三）飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)（三）飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)強制性國家標(biāo)準(zhǔn)強制性國家標(biāo)準(zhǔn)*現(xiàn)行的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)將進行不斷的修訂和完善！現(xiàn)行的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)將進行不斷的修訂和完善！n相對于發(fā)達國家的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，我國的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)項目偏少。相對于發(fā)達國家的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，我國的飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)項目偏少。n新

6、農(nóng)藥的不斷出現(xiàn)（現(xiàn)行飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了兩種農(nóng)藥的限量標(biāo)準(zhǔn)：新農(nóng)藥的不斷出現(xiàn)（現(xiàn)行飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)只規(guī)定了兩種農(nóng)藥的限量標(biāo)準(zhǔn)：六六六六六、滴滴涕六、滴滴涕）。）。敵敵畏敵敵畏 、敵百蟲敵百蟲 、甲胺磷甲胺磷 、菊酯類菊酯類 、馬拉磷馬拉磷 、蚜螨磷蚜螨磷安全限量標(biāo)準(zhǔn)草案。 n測定方法靈敏度的提高，對于某些有毒有害物質(zhì)限量的規(guī)定將可能發(fā)生改變。測定方法靈敏度的提高，對于某些有毒有害物質(zhì)限量的規(guī)定將可能發(fā)生改變。n新飼料資源的開發(fā)利用。新飼料資源的開發(fā)利用。一、概述一、概述7/3/20229 9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定飼料中有毒有害物質(zhì)的測定（四）飼料中有毒有害物質(zhì)的分類（四）飼料中有毒有害物質(zhì)的分

7、類1. 1. 按來源分：按來源分： 天然：天然：棉酚、硫甙、脲酶、胰蛋白酶抑制劑等 次生：次生：微生物次生代謝產(chǎn)物，如黃曲霉毒素黃曲霉毒素B B1 1、由氨基酸產(chǎn)生的組胺、尸胺、腐胺、精胺等 外源性：外源性：重金屬污染，2 2 按性質(zhì)分：按性質(zhì)分： 有機：有機：棉籽餅粕、菜籽餅粕、蓖麻餅粕中的蓖麻毒素和蓖麻堿、四 季豆中的皂甙（皂素）和胰蛋白酶抑制劑等，病原微生物、霉菌毒素、有機農(nóng)藥等。 無機：無機：鉛、砷砷、鉻、鎘、汞、氟、鉬等。一、概述一、概述7/3/202210 9 飼料中飼料中有毒有害物質(zhì)有毒有害物質(zhì)的測定的測定l砷的毒性：砷與動物體組織中酶的巰基結(jié)合使之失活，損害機體全身組織。l砷的

8、氧化物毒性很高，三價砷毒性五價；無機砷毒性有機砷：砒霜（As2O3 ）。l一般情況下，植物性飼料砷含量很低。l植物飼料中砷含量與土壤中的水平、農(nóng)藥污染和工業(yè)污染有關(guān)。 二、飼料中總砷的測定二、飼料中總砷的測定（P248）7/3/202211 9 飼料中飼料中有毒有害物質(zhì)有毒有害物質(zhì)的測定的測定二、飼料中總砷的測定二、飼料中總砷的測定l有機砷飼料添加劑：有機砷飼料添加劑：對氨基苯砷酸（阿散酸阿散酸）、對氨基苯砷酸鈉和3-硝基-4-羥基苯砷酸 （洛克殺生 ）。 促生長，抗球蟲及著色（使皮膚紅潤，毛色發(fā)亮）等功效。促生長，抗球蟲及著色（使皮膚紅潤，毛色發(fā)亮）等功效。l我國制定的飼料中砷測定標(biāo)準(zhǔn)方法是

9、測定飼料中總砷含量（目前目前的檢測方法還不能區(qū)分有機砷和無機砷的檢測方法還不能區(qū)分有機砷和無機砷），而衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中砷的限量標(biāo)準(zhǔn)為無機砷，造成了使用有機砷添加劑的配合料，含砷量超過我國國家允許量標(biāo)準(zhǔn)，這也使得檢測結(jié)果無法依據(jù)產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)進行質(zhì)量判定。7/3/202212 9 飼料中飼料中有毒有害物質(zhì)有毒有害物質(zhì)的測定的測定二、飼料中二、飼料中總砷的測定總砷的測定7/3/202213 9 飼料中飼料中有毒有害物質(zhì)有毒有害物質(zhì)的測定的測定（一）概述（一）概述 黃曲霉毒素（aflatoxins, AF）是由一組真菌（黃曲霉、曲霉等）產(chǎn)生的一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的真菌毒素。主要污染花生、玉米、棉籽及其餅粕等。對

10、人和動物均具有極強的毒性和致癌性。黃曲霉毒素還可在動物產(chǎn)品中蓄積，影響人體健康。 目前已分離鑒定出12種，包括B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。其中黃曲霉毒黃曲霉毒B1最為多見，其毒性和致癌性也最強。 在自然條件下，飼料污染的黃曲霉毒素飼料污染的黃曲霉毒素主要為AFB1、B2 、G1 、G2，其中以AFB1含量最高。 黃曲霉毒素的毒性、致癌性和蓄積性飼料產(chǎn)品質(zhì)量控制中的必檢項目必檢項目。 二、飼料中黃曲霉毒素二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定的測定7/3/202214 9 飼料中飼料中有毒有害物質(zhì)有毒有害物質(zhì)的測定的測定( (二二) )檢測方法檢測方法n酶聯(lián)免

11、疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）n薄層層析法（薄層層析法（thin layer chromatography，TLC）n快速篩選法快速篩選法二、飼料中黃曲霉毒素二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定的測定（P288）7/3/202215 9 飼料中飼料中有毒有害物質(zhì)有毒有害物質(zhì)的測定的測定酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法1、原理、原理 ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記酶標(biāo)記。以待測抗原（或抗體）與酶標(biāo)抗體（或抗原）的特異結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過酶活力測定來確定抗原（或抗體）含量。 特點：特點：很強的特異性：很

12、強的特異性：建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上。建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上。 很高的靈敏度：很高的靈敏度：酶催化反應(yīng)。酶催化反應(yīng)。對于黃曲霉毒素對于黃曲霉毒素B1，ELISA法法最低可檢出最低可檢出0.1g。 二、飼料中黃曲霉毒素二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定的測定7/3/202216 9 飼料中飼料中有毒有害物質(zhì)有毒有害物質(zhì)的測定的測定酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：種必要的試劑：n固相的抗原或抗體，固相的抗原或抗體，n酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，n酶作用的底物。酶作用的底物。 二、飼料中黃曲霉毒

13、素二、飼料中黃曲霉毒素B1的測定的測定7/3/202217酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法A A、抗體、抗體o將某種抗原經(jīng)各種途徑免疫動物，成熟的B細胞克隆受到抗原刺激后，將抗體分泌到血清和體液中。實際上血清中的抗體是多種單克隆抗體的混合物，因此稱之為多克隆抗體多克隆抗體。 9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定飼料中有毒有害物質(zhì)的測定7/3/202218o單克隆抗體是由生長在細胞培養(yǎng)物中的同一B細胞的群體（一個克?。┖铣刹⒎置诘?、均一的、識別同一抗原表位的抗體。7/3/202219酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法B B、酶與底物：、酶與底物：n在在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶中，常用的酶為辣根過氧化

14、物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少數(shù)商品。在少數(shù)商品ELISA試試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。n辣根過氧化物酶底物：鄰苯二胺辣根過氧化物酶底物：鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基、四甲基聯(lián)苯胺聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和和ABTS。用。用2mol/L硫酸終硫酸終止酶反應(yīng)。止酶反應(yīng)。n堿性磷酸酶底物：一般采用對硝基苯磷酸酯堿性磷酸

15、酶底物：一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)作為底物，用作為底物，用NaOH終止酶反應(yīng)。終止酶反應(yīng)。 9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定飼料中有毒有害物質(zhì)的測定7/3/202220酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法B B、酶與底物：、酶與底物：n在在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和堿性磷酸酶和堿性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。在少數(shù)商品。在少數(shù)商品ELISA試試劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、劑中，應(yīng)用的酶尚有葡萄糖氧化酶、-D-半乳

16、糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。n辣根過氧化物酶底物：鄰苯二胺辣根過氧化物酶底物：鄰苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基、四甲基聯(lián)苯胺聯(lián)苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和和ABTS。用。用2mol/L硫酸終硫酸終止酶反應(yīng)。止酶反應(yīng)。n堿性磷酸酶底物：一般采用對硝基苯磷酸酯堿性磷酸酶底物：一般采用對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)作為底物，用作為底物，用NaOH終止酶反應(yīng)。終止酶反應(yīng)。 9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定飼料中有毒有害物質(zhì)的測定7/3/202221酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附

17、法ELISA最常用的四種方法：最常用的四種方法：u直接法測定抗原；直接法測定抗原；u間接法測定抗體；間接法測定抗體；u雙抗體夾心法測定抗原；雙抗體夾心法測定抗原；u競爭法測定抗原。競爭法測定抗原。 9 飼料中有毒有害物質(zhì)的測定飼料中有毒有害物質(zhì)的測定7/3/202222（1 1） 直接法測定抗原直接法測定抗原 A. 將抗原吸附在載體表面； B. 加酶標(biāo)抗體，形成抗原抗體復(fù)合物； C. 加底物。底物的降解量抗原量。 7/3/202223（2 2）間接法測定抗體）間接法測定抗體A. 將抗原吸附于固相載體表面；B. 加抗體, 形成抗原-抗體復(fù)合物; C. 加酶標(biāo)抗體；D. 加底物。 測定底物的降解量

18、抗體量。 7/3/202224（3 3）雙抗體夾心法測定抗原）雙抗體夾心法測定抗原A. 將抗體吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物; C. 加酶標(biāo)抗體; E. 加底物。底物的降解量抗原量。 7/3/202225（4 4）競爭法測定抗原）競爭法測定抗原A. 將抗體吸附在固相載體表面; B. 加入酶標(biāo)抗原和待測抗原，競爭結(jié)合抗體； 對照只加入酶標(biāo)抗原； C. 加底物。對照孔與樣品孔底物降解量的差未知抗原量。7/3/202226黃曲霉毒素黃曲霉毒素B1酶聯(lián)免疫競爭檢測法酶聯(lián)免疫競爭檢測法 7/3/202227樣品樣品黃黃曲霉毒素曲霉毒素B B1 1分子分子7/3/202228微微 孔

19、孔 表表 面面 情情 況況AFB1抗體抗體7/3/202229標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品品7/3/202230標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液7/3/202231酶酶標(biāo)抗原標(biāo)抗原7/3/202232酶酶標(biāo)抗原標(biāo)抗原酶酶AFB17/3/202233標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品品, 樣品樣品 和和 酶酶標(biāo)抗原標(biāo)抗原加加進微孔進微孔7/3/202234樣品酶標(biāo)抗原 樣樣 品品 孔孔先加后加7/3/202235標(biāo)準(zhǔn)品酶標(biāo)抗原標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn) 孔孔先加后加7/3/202236孵育孵育30分鐘分鐘 抗抗 原原 與與 抗抗 體體 結(jié)結(jié) 合合7/3/202237微微 孔孔 清清 洗洗7/3/202238洗滌洗滌5次，間隔次，間隔2分鐘分鐘7/3/202239加入加入酶催化反應(yīng)底物酶催化反應(yīng)底物7/3/202240加入加入反應(yīng)底物反應(yīng)