新教材選修3專5課2.PCR技術(shù)

1、DNA(DNA(基基因因) )的的功能功能貯存貯存遺傳信息（脫氧核苷酸的排列順序）遺傳信息（脫氧核苷酸的排列順序）復(fù)制復(fù)制( (傳遞傳遞) )遺傳信息遺傳信息表達遺傳信息表達遺傳信息轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 錄錄翻翻 譯譯場所場所模板模板原料原料產(chǎn)物產(chǎn)物特點特點復(fù)習(xí)：基因功能的比較復(fù)習(xí)：基因功能的比較細胞核細胞核細胞核細胞核核糖體核糖體DNA的兩條鏈的兩條鏈DNA一條鏈的一條鏈的部分片段部分片段RNA單鏈單鏈四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸四種核糖核苷酸四種核糖核苷酸20種氨基酸種氨基酸子代子代DNAmRNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)邊解旋邊復(fù)制邊解旋邊復(fù)制 半保留復(fù)制半保留復(fù)制A-TA-U、T-AA-U、U-A選修選修1專題專題

2、2課題課題2 PCR技術(shù)技術(shù)l知識回顧：知識回顧：1.DNA分子的結(jié)構(gòu)（外側(cè)、內(nèi)側(cè)、基分子的結(jié)構(gòu)（外側(cè)、內(nèi)側(cè)、基本單位）；本單位）；2. DNA復(fù)制過程和特點；復(fù)制過程和特點；3.PCR技術(shù)技術(shù)概念及應(yīng)用。概念及應(yīng)用。l基本概念：變性、復(fù)性、基本概念：變性、復(fù)性、Taq DNA聚合酶、引物聚合酶、引物l理解理解PCR技術(shù)的原理技術(shù)的原理l掌握掌握PCR技術(shù)的全過程技術(shù)的全過程l比較比較PCR技術(shù)和體內(nèi)技術(shù)和體內(nèi)DNA復(fù)制的異同點。復(fù)制的異同點。l（一）、（一）、PCRPCR技術(shù)的概念技術(shù)的概念 是一種體外迅速擴增是一種體外迅速擴增DNADNA片段的片段的技術(shù)，它能以極少量的技術(shù)，它能以極少量的

3、DNADNA為模板，為模板，在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百份的在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百份的DNADNA拷貝拷貝l（二）、（二）、PCRPCR技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用l遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物遺傳疾病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和學(xué)、基因克隆和DNADNA序列測定序列測定q從藍藻里面克從藍藻里面克隆隆SODSOD( (超氧化物歧化超氧化物歧化酶酶) )清除人體內(nèi)細胞中自由基清除人體內(nèi)細胞中自由基抗氧化、抗輻射、消炎、抗抗氧化、抗輻射、消炎、抗衰老、抗癌衰老、抗癌高壓氧中毒、肺氣腫、糖尿高壓氧中毒、肺氣腫、糖尿病、早衰病、早衰食品、保健品、藥品、化妝食品、保健品、藥品、化妝品品基因庫檢索基因庫檢索

4、SODSOD的序列的序列 設(shè)計引物設(shè)計引物以藍以藍藻總藻總DNADNA位模板做位模板做PCRPCR獲得的基因片斷連接獲得的基因片斷連接在表達載體在表達載體原核表達蛋白原核表達蛋白q檢測粉末樣品檢測粉末樣品是否含有炭疽桿是否含有炭疽桿菌菌 炭疽菌恐慌，降臨美國，炭疽菌恐慌，降臨美國，席卷全球席卷全球生命力強、傳染快、發(fā)作生命力強、傳染快、發(fā)作快、死亡率高?？?、死亡率高。有兩對引物是根據(jù)編碼有兩對引物是根據(jù)編碼炭疽桿菌炭疽桿菌EFEF因子的基因子的基因序列設(shè)計的，僅與各種炭疽桿菌的因序列設(shè)計的，僅與各種炭疽桿菌的EFEF因子因子同源。同源。PCRPCR產(chǎn)物是產(chǎn)物是1247bp1247bp和和208

5、bp208bp的片斷。非的片斷。非炭疽桿菌均呈陰性。炭疽桿菌均呈陰性。用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)2 2小時小時取培養(yǎng)液直接作取培養(yǎng)液直接作PCRPCRq基因測序基因測序l（三）、（三）、 PCRPCR技術(shù)的原理技術(shù)的原理解旋酶解旋酶DNA母鏈母鏈4種脫氧核苷酸種脫氧核苷酸DNA聚合酶聚合酶引物（引物（ RNA）打開打開DNADNA雙鏈雙鏈模板模板合成子鏈的原料合成子鏈的原料催化催化子鏈子鏈合成合成使使DNA聚合酶能從聚合酶能從引物引物3端開始連接端開始連接脫氧核苷酸脫氧核苷酸變性（變性（80-100）Taq聚合酶（耐高溫）聚合酶（耐高溫）2030個核苷酸構(gòu)個核苷酸構(gòu)成成,是一小段是一小段DN

6、A或或RNAATP提供能量提供能量l（1 1）DNADNA單鏈兩端的命名單鏈兩端的命名基本單位脫氧核苷酸脫氧脫氧核糖核糖磷酸磷酸T1號碳5號碳3號碳連連 接接 ATGCATGC5，端含磷酸基團3，端（含羥基）3，端5，端DNADNA單鏈兩端的命名單鏈兩端的命名lDNADNA聚合酶不能從頭開始合成聚合酶不能從頭開始合成DNADNA，而只能從而只能從33端延伸端延伸DNADNA鏈。鏈。因此，因此，DNADNA復(fù)制需要引物。復(fù)制需要引物。 思考：思考：DANDAN復(fù)制的前提是什么？復(fù)制的前提是什么？ 體體外擴增外擴增DNA DNA 如何打開雙鏈？如何打開雙鏈？ 雙鏈的解開雙鏈的解開控制溫度控制溫度D

7、NA雙鏈雙鏈單鏈單鏈變性（加熱變性（加熱80-100）復(fù)性（緩慢冷卻）復(fù)性（緩慢冷卻）4、DNA 分子的熱變性原理：分子的熱變性原理： PCR儀原理儀原理變性的目的：變性的目的：復(fù)性的目的：復(fù)性的目的：解開雙鏈解開雙鏈有利于引物有利于引物和引物和引物與兩條單與兩條單鏈的結(jié)合鏈的結(jié)合P21托馬斯托馬斯.布魯克布魯克lDNADNA模板；模板；l分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物；引物；l四種脫氧核苷酸；四種脫氧核苷酸；l耐高溫的聚合酶；耐高溫的聚合酶；l 控制溫度，但不需解旋酶控制溫度，但不需解旋酶. .l以便增加大分子模板以便增加大分子模板DNADNA徹底變徹底變性的概

8、率性的概率1、循環(huán)之前的一次預(yù)變性、循環(huán)之前的一次預(yù)變性2、PCR 一般要經(jīng)歷一般要經(jīng)歷三十多三十多次循環(huán)次循環(huán)l（1 1）變性：當(dāng)溫度上升到變性：當(dāng)溫度上升到90 90 以上時，以上時，雙鏈雙鏈DNADNA解聚為單鏈。解聚為單鏈。l（2 2）復(fù)性：溫度下降到）復(fù)性：溫度下降到50 50 左右，兩種左右，兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNADNA結(jié)合。結(jié)合。l（3 3）延伸：溫度上升到）延伸：溫度上升到7272左右，溶液中左右，溶液中的的四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸(A(A，T T，C C，G)G)在在DNADNA聚合聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成酶

9、的作用下，根據(jù)堿基互補配對原則合成新的新的DNADNA鏈。鏈。3、每個循環(huán)包括、每個循環(huán)包括：變性變性 復(fù)性復(fù)性延伸延伸9595變性變性9595變性變性9595變性變性5555復(fù)性復(fù)性4、循環(huán)特點：、循環(huán)特點：上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板上一次循環(huán)的產(chǎn)物為下一循環(huán)的模板 結(jié)果單鏈中有最初母鏈的只兩條（無引物結(jié)果單鏈中有最初母鏈的只兩條（無引物存于兩個子代存于兩個子代DNADNA分子中分子中 其它子代其它子代DNADNA分子都為雙引物分子式分子都為雙引物分子式 處于兩引物之間的處于兩引物之間的DNADNA序列呈指數(shù)增長序列呈指數(shù)增長1 12 2N N準(zhǔn)備好準(zhǔn)備好PCRPCR反應(yīng)體系的配方反應(yīng)

10、體系的配方用微量移液器按配方在微量試管中用微量移液器按配方在微量試管中加入各組分加入各組分蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁蓋嚴(yán)蓋子，用手指輕輕彈擊管壁離心離心1010分鐘分鐘將離心管放入將離心管放入PCRPCR儀上，設(shè)置好循環(huán)程序儀上，設(shè)置好循環(huán)程序電泳檢測電泳檢測PCRPCR結(jié)果結(jié)果l 操作提示操作提示l 1 1為避免外源為避免外源DNADNA等因素的污染，等因素的污染，PCRPCR實驗中實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行在使用前必須進行高壓滅菌高壓滅菌。l 2 2PCRPCR所用的緩沖液和酶應(yīng)所用的緩沖液和酶應(yīng)分裝成小份分

11、裝成小份，并，并在在-20-20儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在放在冰塊上緩慢融化冰塊上緩慢融化。l 3 3在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取在微量離心管中添加反應(yīng)成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換槍頭都必須更換。所有。所有的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，的成分都加入后，蓋嚴(yán)離心管口的蓋子，用手指用手指輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻輕輕彈擊管的側(cè)壁，使反應(yīng)液混合均勻，再將微，再將微量離心管放在離心機上，離心約量離心管放在離心機上，離心約10s10s，使反應(yīng)液，使反應(yīng)液集中在離心管底部，再放入集中在離心管

12、底部，再放入PCRPCR儀中進行反應(yīng)。儀中進行反應(yīng)。目的：目的：避免外源性避免外源性DNA大量擴增造成假陽性反應(yīng)。大量擴增造成假陽性反應(yīng)。l1 1、原理：、原理：DNADNA在在260nm260nm的紫外線波段有的紫外線波段有一強烈的吸收峰一強烈的吸收峰( (圖圖5-11)5-11)?？梢岳谩？梢岳肈NADNA的這一特點進行的這一特點進行DNADNA含量的測定。含量的測定。l2 2、具體方法如下。、具體方法如下。l1 1）將樣品進行）將樣品進行5050倍稀釋：取倍稀釋：取2LPCR2LPCR反反應(yīng)液，加入應(yīng)液，加入98 L98 L蒸餾水。蒸餾水。l2 2）以蒸餾水作為空白對照，在波長）以蒸

13、餾水作為空白對照，在波長260nm260nm處，將紫外分光光度計處，將紫外分光光度計( (圖圖5-12)5-12)的讀的讀數(shù)調(diào)節(jié)至零。數(shù)調(diào)節(jié)至零。l3 3）加入步驟）加入步驟1 1中的中的DNADNA稀釋液稀釋液100L100L至比色至比色杯中，測定杯中，測定260nm260nm處的光吸收值。處的光吸收值。l4 4）根據(jù)下面的公式計算）根據(jù)下面的公式計算DNADNA含量。含量。l DNA DNA含量含量(g/ml)=50 x(260nm(g/ml)=50 x(260nm的讀數(shù)的讀數(shù))x)x稀稀釋倍數(shù)釋倍數(shù)l1 1、PCRPCR優(yōu)點：優(yōu)點：l2 2、PCRPCR技術(shù)的意義技術(shù)的意義原理雖然復(fù)雜，

14、但操作卻十分簡單?？煸黼m然復(fù)雜，但操作卻十分簡單。快速、高效、靈活和易于操作速、高效、靈活和易于操作 復(fù)習(xí)：復(fù)習(xí)：PCRPCR技術(shù)與體內(nèi)技術(shù)與體內(nèi)DNADNA復(fù)制的區(qū)別：復(fù)制的區(qū)別： 1. PCR 1. PCR不需要解旋酶；體內(nèi)不需要解旋酶；體內(nèi)DNADNA復(fù)制復(fù)制需要；需要； 2. PCR 2. PCR需要耐熱的需要耐熱的DNADNA聚合酶（常用聚合酶（常用TaqDNATaqDNA聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合聚合酶），而生物體內(nèi)的聚合酶在高溫時會變性；酶在高溫時會變性； 3. PCR 3. PCR一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán)，而生物體內(nèi)生物體內(nèi)DNADNA復(fù)制需要生物體自

15、身的復(fù)復(fù)制需要生物體自身的復(fù)制。制。 1 1、書本、書本2 2、課課練、課課練l9 9 下圖為下圖為PCRPCR過程的前三次循環(huán)的圖解，請據(jù)圖回答：過程的前三次循環(huán)的圖解，請據(jù)圖回答：l ()()請將請將PCRPCR緩沖液中提供的緩沖液中提供的4 4種組分填寫在圖中的方框內(nèi)：種組分填寫在圖中的方框內(nèi)：l (2)(2)第一輪循環(huán)中變性第一輪循環(huán)中變性 是指是指_；復(fù)性；復(fù)性 是指是指_ _ ；l延伸是指延伸是指_。l (3)(3)假設(shè)假設(shè)PGRPGR反應(yīng)中的反應(yīng)中的DNADNA模板為模板為P P，第一輪循環(huán)的產(chǎn)物，第一輪循環(huán)的產(chǎn)物2 2個子代個子代DNADNA為為l NlNl，第二輪的產(chǎn)物，第二

16、輪的產(chǎn)物4 4個子代個子代DNADNA為為N2N2，第二輪的產(chǎn)物，第二輪的產(chǎn)物8 8個子代個子代DNADNA為為l N3N3，則，則NlNl、N2N2、N3N3中分別含有模板中分別含有模板DNADNA單鏈的單鏈的DNADNA分子分子 ，l _、_個，若繼續(xù)循環(huán)個，若繼續(xù)循環(huán)3636次，則次，則N N 3636中將有中將有個個DNADNA分子含有模板分子含有模板DNADNA單鏈。單鏈。l (4)N3(4)N3的的8 8個個DNADNA分子中分子中是以是以N2N2中的中的_為模板復(fù)制而來的，為模板復(fù)制而來的，l 是以是以N2N2中的中的 為模板復(fù)制而采的，為模板復(fù)制而采的，是以是以N2N2中的中的

17、 為模為模l 板復(fù)制而來的，板復(fù)制而來的，是以是以N2N2中的中的 為模板復(fù)制而來的。從圖中可以為模板復(fù)制而來的。從圖中可以l看出，看出，DNADNA聚合酶只能特異地復(fù)制處于聚合酶只能特異地復(fù)制處于2 2個引物之間的個引物之間的DNADNA序列，使這段固定長序列，使這段固定長度的序列呈指數(shù)擴增，原因是度的序列呈指數(shù)擴增，原因是_ _ l1 1、DNADNA單鏈的單鏈的_末端為末端為3 3, ,端端, , _末端為末端為5 5, ,端端, ,在在DNADNA復(fù)制時復(fù)制時, ,引引物從模板鏈的物從模板鏈的_端配對結(jié)合端配對結(jié)合. .在在_酶的作用下酶的作用下, ,引物提供引物提供_端端, ,使子鏈

18、向下延伸使子鏈向下延伸. .l2 2每次循環(huán)可以分為每次循環(huán)可以分為_這三個過程這三個過程, ,對應(yīng)溫度分別為對應(yīng)溫度分別為_._.l3 3、一個、一個DNADNA片段經(jīng)過片段經(jīng)過3030次循環(huán)后能形次循環(huán)后能形成成_個這樣的片段個這樣的片段. .l4 4依據(jù)依據(jù)DNADNA吸收紫外光的情況吸收紫外光的情況, ,用紫外分用紫外分光光度計測得光光度計測得lDNA=_DNA=_l1 1、DNADNA單鏈的單鏈的_末端為末端為3 3, ,端端, , _末端為末端為5 5, ,端端, ,在在DNADNA復(fù)制時復(fù)制時, ,引引物從模板鏈的物從模板鏈的_端配對結(jié)合端配對結(jié)合. .在在_酶的作用下酶的作用下, ,引物提供引物提供_端端,