抗細菌轉(zhuǎn)基因工程 課程

1、主講人：李立志第三(d sn)小組成員:李立志、李小強、李瑜轉(zhuǎn) Rxo1 基因(jyn)抗細菌性條斑病水稻精品資料水稻細條(x tiao)病的發(fā)現(xiàn)水稻細菌性條斑病(簡稱細條病)由 Xanthomonascam Pestris pv. Oryzicola（簡稱Xoc）引起。最早在1918年由Reinking首次報道了菲律賓水稻上發(fā)生細條病,在我國范懷忠等(1957)于20世紀50年代在廣東省首先(shuxin)發(fā)現(xiàn)該病害。開始時誤認為是白葉姑病，后經(jīng)方中達等(1957)將該病與白葉枯病區(qū)分開來確認為一種新的由細菌性病害。精品資料病菌(bngjn)特點 該病菌屬黃單胞桿菌屬細菌,生長(shngzh

2、ng)最適溫28-30C。低于16C基本不發(fā)病。細條病的發(fā)生初侵染源主要有稻種、稻草和自生稻帶菌,但也不排除野生稻、李氏禾的交叉?zhèn)魅尽?病原菌主要從傷口侵入,菌膿可借風(fēng)、雨、露等傳播后進行再侵染。高溫高濕等有利于病害發(fā)生。臺風(fēng)暴雨造成傷口,病害容易流行。偏施氮肥,灌水過深加重發(fā)病。精品資料水稻細條病的發(fā)病(f bng)特點 危害水稻的主要特點危害水稻的主要特點: 主要侵害水稻葉片主要侵害水稻葉片,病斑初呈暗綠色水病斑初呈暗綠色水橫狀半透明小斑點橫狀半透明小斑點,后逐漸沿葉脈方向后逐漸沿葉脈方向擴展擴展,成黃褐色成黃褐色,干結(jié)后呈黃色樹膠狀干結(jié)后呈黃色樹膠狀小粒小粒,形如虛線形如虛線,不易脫落。

3、發(fā)病嚴不易脫落。發(fā)病嚴iR吋吋,條斑融合成不規(guī)則的黃褐色至枯白條斑融合成不規(guī)則的黃褐色至枯白色大斑塊色大斑塊,外觀與白葉枯病有些相似外觀與白葉枯病有些相似,但對光觀察但對光觀察,病斑呈半透明狀。病害流病斑呈半透明狀。病害流行時行時,葉片卷曲葉片卷曲,完全呈一片白色。該完全呈一片白色。該病在水稻生長前期、后期都易感染病在水稻生長前期、后期都易感染,苗苗期癥狀較白葉枯病明顯期癥狀較白葉枯病明顯;病害嚴重時能病害嚴重時能引起稻株早期死亡或不能抽穂。即使引起稻株早期死亡或不能抽穂。即使能夠抽穗能夠抽穗(chu su)結(jié)實結(jié)實,但批谷增多但批谷增多,千粒重降低。一般年份可減產(chǎn)千粒重降低。一般年份可減產(chǎn)1

4、0%-20%,在氣候條件沾發(fā)病嚴重時達在氣候條件沾發(fā)病嚴重時達40%。精品資料Rxo1 基因(jyn)來源 Rxo1 基因(jyn)是來自玉米的一個抗玉米細菌性條斑病的寄主抗性基因(jyn)，將其轉(zhuǎn)入水稻后轉(zhuǎn)基因(jyn)水稻中接種細菌性條斑病病原菌，在接種點處表現(xiàn)典型的 HR 表型，證實該基因(jyn)為一重要的非寄主抗性基因(jyn)。精品資料Rxo1 基因(jyn)定位Rxo1 基因CDS 序列全長（從起始密碼子 ATG 到終止密碼子 TAG）為 2718bp。與許多 R 基因一樣，該基因編碼的產(chǎn)物是 NBS-LRR 結(jié)構(gòu)的抗病蛋白（GenBank登錄號為 AAX31149.1），其蛋白

5、質(zhì)序列為 905aa。根據(jù) SMART 數(shù)據(jù)庫軟件掃描該蛋白的 domains、repeats、motifs，找到一個從 4-18 位點的 low compositional complexity：IAVLLVLKKIAIALA 及一個位于 118-147 的 coiled coil region（LVSLDEIASEIKKIKQELKQLSESRDRWTK）；此外還預(yù)測到了 37 個其余結(jié)構(gòu)（如 UME_PTB、SynN、IRO、RING、NADH-G_4Fe-4、TOP1Ac、LRR_BAC、IFabd、SCAN、LytTR、LRR_CC、LRR_TYP 及 LRR_SD22 等），但是其

6、顯著性未達到極顯著的閾值。Sanger 的分析則找到 3 個 Pfam-A matchs，其中顯著的一個是 NB-ARC 結(jié)構(gòu)：envelope 范圍是 183-470；比對結(jié)果(ji gu)的范圍則是 185-467；HMM 范圍為3-282；另有兩個非顯著的 4 個 copy 的 LRR 結(jié)構(gòu)。精品資料基因基因(jyn)Rxo1 的雙右邊界雙元載的雙右邊界雙元載體的構(gòu)建體的構(gòu)建 1. 1 菌株和載體 含有9kb Rxo1 基因的pCAMBIA1305-1 Rxo1 質(zhì)粒由美國(mi u)堪薩斯州立大學(xué)Scot H. Hulbert 博士提供。pCAMBIA1305-1 質(zhì)粒是由澳大利亞CA

7、MBIA 研究中心構(gòu)建的含有35S 啟動子和細菌卡那霉素抗性基因的雙元載體。采用的農(nóng)桿菌菌株為EHA105。精品資料 （1）美國Kansas州立大學(xué)的Scot H. Hulbert博士提供pCA1ViBIA1305-1質(zhì)粒，其中(qzhng) 攜帶有外源目的基因Rxol;pCAMBIA1305-1質(zhì)粒精品資料 （2）澳大利亞CSIRO Plant Industry的M Upadhyaha博士提供雙右邊界雙元載體pMNDRBBin6。該載體用于轉(zhuǎn)接Rxol基因并將重組體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌(gnjn)中進行后續(xù)轉(zhuǎn)基因:雙右邊界(binji)雙元載體pMNDRBBin6結(jié)構(gòu)圖及可能產(chǎn)生的3種T DNA類型

8、(3)農(nóng)桿菌菌株為LBA4404;(4)大腸桿菌菌株為DHSa ;精品資料1.2雙右邊界雙元載體雙右邊界雙元載體(zit)的構(gòu)建的構(gòu)建1.感受態(tài)細胞的制備和轉(zhuǎn)化2. 雙右邊界雙元載體構(gòu)建(u jin)（1）目的基因和載體的酶切連接將攜帶Rxol基因的載體pCAMBIA1305-1用限制性內(nèi)切酶Sac I (AGTVACT), NgoMN (GV CCGGC)進行消化，同時，用限制性內(nèi)切酶Xma I ( C V CCGGG)和Hpa I ( GTT V AAC )消化載體pMNDRBBin6。將酶切后得到的目的基因片斷和雙元載體用T4噬菌體連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。精品資料質(zhì)粒質(zhì)粒pC

9、AMBIA1305-1-Rxol經(jīng)內(nèi)切酶經(jīng)內(nèi)切酶Sac I和和NgoM IV酶切，得酶切，得到大小為到大小為8.Skb的的Rxol目的目的(md)基因片斷基因片斷(圖圖A )，載體，載體pMNDRBBin6經(jīng)經(jīng)Hpa I和和Xma I酶切，得到大小為酶切，得到大小為12.3kb的線性的線性化雙右邊界載體化雙右邊界載體(圖圖B ) A: Sac I和NgoM N酶切pCAMBIAI305-I-Rxol; B: Hpa I和Xma I酶切pMNDRBBin6; I: pCAMBIA1305-1-Rxol; 2: pMNDRBBin6;M: 250 by DNA Marker.精品資料(2)陽性克隆

10、篩選將過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在LB固體培養(yǎng)基(含SOmg/L壯觀霉素)上涂布37培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子單克隆于LB培養(yǎng)基(含SOmg幾壯觀霉素)中振蕩培養(yǎng)Sh;提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進行擴增，使用引物Rxol-F (5ACTCGGTAAACCTACGGACTGA-3)和Rxol-R (5-CTTCCTGCAGGTATACCACTCC-3 )篩選獲得陽性克隆;篩選出1個轉(zhuǎn)化子，其特異性擴增片段與1.45kb目的基因片段Rxol大小相符。提取該克隆質(zhì)粒DNA進行PCR擴增，擴增片段大小與陽性對照pCAMBIA1305-1-Rxol相同，將產(chǎn)物回收(hushu)純化連接到pMD20-T上測序，與目的基因序列比

11、對相同，表明Rxol基因片段已整合到pMNDRBBin6載體中。精品資料 1 M 2 3 41:陽性對照pCAMBIA1305-1-itcol; M: 1 kb DNAlandderMarker; 2:陰性(ynxng)對照pMNDRBBin6質(zhì)粒;3:陽性克隆PCR擴增;4:陽性克隆的質(zhì)粒PCR擴增;M: 1 kb DNA ladder marker.-1.45kb精品資料 (2)對整合了Rxol基因的pMNDRBBin6載體使用Hpa I和Xma I進行雙酶切，應(yīng)得到大小為20.875kb的片段。該陽性克隆的質(zhì)粒經(jīng)酶切后產(chǎn)生1條帶約為20kb(圖2.5 )，與目的(md)基因片段和pMND

12、RBBin6載體的長度之和相等記為pMNDRBBin6-Rxol a 1 Ml0kb 1:質(zhì)粒;2: Marker. 精品資料(3) pMNDRBBin6-Rxol經(jīng)EcoR I酶切后產(chǎn)生4個片段，大小分別為9378bp, 8576bp, 1632bp和1268bp (9378bp和8576bp片段長度(chngd)相近，圖中合為一條粗帶)(圖2.6A); Sac I酶切產(chǎn)生5個片段，大小分別為8525bp, 5194bp, 2683bp, 1763bp和1528bp(圖2.6B ) 圖2.6陽性克隆質(zhì)粒的EcoR I C A)和Sac I (B)酶切圖譜.1:質(zhì)粒;Ml: 250 by DN

13、A ladder maker; M2: 1 kb DNA ladder marker.上述酶切結(jié)果與Premier Primer 5.0分析的理論酶切片段大小相符(xingf)，表明Rxol基因整合到了雙邊界載體中，且位于T DNA相鄰的左右邊界之間。精品資料(3)陽性克隆酶切鑒定和PCR擴增(4)載體序列分析(5)保存陽性克隆，以備后續(xù)遺傳(ychun)轉(zhuǎn)化工作。精品資料水稻(shudo)的遺傳轉(zhuǎn)化 將處理好的種子誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS（含 100 mL/L MS 大量元素混合液上，26培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)約 30 天。 （1） 繼代培養(yǎng) 將上述誘導(dǎo)的質(zhì)地緊密(jnm)、色澤鮮艷的胚性愈傷組織在超凈臺中

14、用鑷子剝離，轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中（MS 培養(yǎng)基，如上），2 周后選擇原胚性愈傷組織分化出來的質(zhì)地均勻、顆粒較小、色澤良好的愈傷顆粒繼代一次，共繼代 2 次。精品資料（2） 農(nóng)桿菌(gnjn)活化將超低溫保存的農(nóng)桿菌(gnjn)劃線于含50 mg/L卡那霉素的YEB培養(yǎng)基上，28培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；挑取單菌落，接于 2mL 含有 50 mg/L 卡那霉素的 YEB 液體培養(yǎng)基中，28搖床中振蕩培養(yǎng)約 36小時；用移液槍吸取 1mL 新鮮菌液接于 50mL 含 50 mg/L 卡那霉素的 YEB 液體培養(yǎng)基中，搖菌至 OD600為 0.8-1.0；將活化好的農(nóng)桿菌(gnjn)離心，4000rpm，1

15、0min，去上清后重懸于 AAM-As （100含 mL/L AAM 大量元素、5 mL/L上述鐵鹽、0.1mg/L VB1、0.6mg/L VB6、0.5mg/L 煙酸、0.75mg/L 甘氨酸、100 mg/L 肌醇、876mg/L谷氨酰胺、266mg/L 天冬氨酸、175mg/L 精氨酸、0.5g/L 酪蛋白、68.5g/L 蔗糖及 36g/L 葡萄糖，調(diào)節(jié) PH 至 5.2，滅菌后冷卻至約 60的培養(yǎng)基中加入 1mL 10mmol/L 的乙酰丁香酮）液體培養(yǎng)基中，28，200rpm 振搖 3-4 小時，用分光光度計調(diào)節(jié) OD600為 0.7-1.0，即可用于分裝、侵染愈傷組織。精品資料

16、（3） 侵染(qn rn)、共培養(yǎng)與篩選材料為在繼代培養(yǎng)基上生長 4-5 天的愈傷組織，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到滅菌濾紙(lzh)上吸濕 20min 后轉(zhuǎn)移到調(diào)好濃度的菌液中；搖床中緩慢搖晃 20-30 min ；倒掉菌液，于滅菌濾紙(lzh)上吸棄多于菌液；取出愈傷，播于鋪有一層濾紙(lzh)的共培養(yǎng)培養(yǎng)基（PH 為 5.2 的 MS 培養(yǎng)基）中，20生化培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng) 2-3 天。當(dāng)共培養(yǎng)的愈傷周圍出現(xiàn)明顯的菌體時，將其轉(zhuǎn)移至滅菌濾紙(lzh)上，吸去表面菌體后用含有 150mg/L 頭孢噻奎鈉和 200 mg/L 羧芐青霉素的無菌水中，100 rpm 振蕩 30 min，重復(fù) 3 次；將洗過的

17、愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌濾紙(lzh)上，吸取多于水分；將愈傷接入篩選培養(yǎng)基（含有 150 mg/L 頭孢噻奎鈉和 200 mg/L 羧芐青霉素及 50 mg/L 潮霉素）中，26避光篩選 15-20 天后將未變黑的愈傷轉(zhuǎn)移到新的篩選培養(yǎng)基，重復(fù) 2 次。精品資料（4） 植株(zhzh)再生將篩選培養(yǎng)基上的抗性愈傷組織介入預(yù)分化培養(yǎng)基（含有 N6 大量、MS 微量、鐵鹽、1 mg 煙酸、10 mg VB1、1 mg VB6、0.1g 肌醇、0.3g 酪蛋白、0.5g 甘氨酸、0.5g 脯氨酸、30g 蔗糖、3g植物凝膠、2.2 mg NAA、2.5 mg 6-BA，PH 為 5.8）上，26暗培養(yǎng) 7

18、天后在 12 小時光照、12小時黑暗(hi n)的條件下培養(yǎng) 7 天。將預(yù)分化的抗性愈傷組織接入鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，干燥處理3 小時后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（每升含有 N6 大量、MS 微量、鐵鹽、1 mg 煙酸、10 mg VB1 mgVB6、0.1g 肌醇、0.3g 酪蛋白、0.5g 甘氨酸、0.5g 脯氨酸、30g 麥芽糖、3g 植物凝膠、0.5 mg NAA、1.5 mg 6-BA，PH 為 5.8）上，在 26環(huán)境中 12 小時光照及 12 小時避光的條件下，培養(yǎng)至愈傷變綠，長出少量根，且分化出莖葉。精品資料（5） 生根(shng gn)培養(yǎng)當(dāng)分化的小苗生長到 4-5cm 時，將其轉(zhuǎn)移

19、到生根培養(yǎng)基（每升中含 25mL MS 大量元素、5mLMS 微量元素混合液、5mL 鐵鹽、30g 蔗糖(zhtng)、3g 植物凝膠、0.1mg/LNAA、0.1g 肌醇、0.3g 酪蛋白、0.5g 谷氨酰胺及 0.5g 脯氨酸，調(diào)節(jié) PH 至 5.8）上，上述溫度和光照的條件下繼續(xù)培養(yǎng) 30天左右。精品資料（6） 壯苗(zhun mio)與煉苗 將小苗經(jīng) 7 天溫室煉苗后，轉(zhuǎn)移到人工氣候(qhu)室水培 20 天，再轉(zhuǎn)移至隔離的網(wǎng)室中種植。精品資料（7） 轉(zhuǎn)基因后代(hudi)的表型檢測與分子檢測當(dāng)植株生長到分蘗盛期時，用針刺法接種毒性 Xoc 小種，分別在第 3 天、第 5 天、第 7

20、天及第 10 天觀察記錄接種點的反應(yīng)表型。DNA 提?。篊TAB 法提取轉(zhuǎn)移至網(wǎng)室種植的基因工程苗的基因組 DNA（經(jīng)液氮速凍后研磨的約 0.1g 葉片粉末中加入 400L CTAB 提取液；65水浴 40 分鐘，期間(qjin)搖晃混勻 2 次；8000rpm離心 10 分鐘后吸取上清；上清中加入等體積的 24:1 氯仿：異戊醇，搖床上 100rpm 5 min；10000rp離心 10 分鐘；吸取轉(zhuǎn)移上清至新管，加入 2/3 體積預(yù)冷的異丙醇后混勻；-20下放置 30min 以上；10,000rpm 離心 5 min，棄廢液；用酒精洗兩遍，室溫下風(fēng)干，加入 200L 溶解 DNA;1%瓊脂

21、糖凝膠電泳檢測質(zhì)量）。精品資料基因(jyn)檢測 為了檢測所轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)，采用了 Nothern 雜交(zjio)的方法（雜交(zjio)步驟見地高辛試劑盒說明）：提取經(jīng) PCR 檢測為陽性的植株及受體對照的 DNA，用 EcoR、Hind雙酶切后于 1%瓊脂糖凝膠 電 泳 中 低 電 壓 條 件 下 過 夜 。 雜 交 操 作 參 照 試 劑 盒 所 述 方 法 。 所 用 的 探 針 為Rxo1-pCAMBIA1305-1 質(zhì)粒為模板 Rxo1-1F 和 Rxo1-1R 為引物擴增出的約 1.45kb 的 Rxo1 片段。精品資料 細菌性條斑病菌株的分離培養(yǎng)與接種(jizhng)鑒定菌株

22、分離：以從田間取具有細條病表型（水浸狀條斑，有菌膿）且無其余病害（特別是白葉枯病）導(dǎo)致的癥狀的葉片為標本，經(jīng) 75%酒精表面消毒 10s，放入滅菌水中清洗 2min，重復(fù) 3 次；在滅菌水中剪碎，放置 3 分鐘；用滅菌接種針蘸取游離有病原細菌的處理液，在 PSA 培養(yǎng)基（300g土豆煮出的水中加入 5g 蛋白(dnbi)胨、15g 蔗糖、0.5g 硝酸鈣、0.78g 磷酸氫二鈉及 15g 瓊脂粉，定容至 1000mL）上劃線；置于 28培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2-3 天；挑取從形態(tài)與外觀上看為黃單胞菌的單菌落，擴繁培養(yǎng)，并經(jīng)接種鑒定為正確的菌株在 20%甘油的條件下置于-70中保存。菌體培養(yǎng)與接種：用接

23、種針蘸取保存菌株的菌液，在上述培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng) 2-3 天；挑取單菌落擴繁培養(yǎng) 2 天；用無菌水將菌體洗下，混勻成濃度為 108cells/mL；在吸滿菌液的海綿上用大頭針針刺接種不同水稻葉片；接種后 3-15 天內(nèi)連續(xù)觀察和記錄表型。精品資料精品資料 轉(zhuǎn)基因植株(zhzh)的表型鑒定和分子鑒定轉(zhuǎn)基因植株的獲得過程見圖 2.1：經(jīng)誘導(dǎo)(yudo)、繼代后的狀態(tài)良好的愈傷用于攜帶目的基因的農(nóng)桿菌侵染，再經(jīng)篩選獲得抗性愈傷，將抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中繼續(xù)篩選與分化 3-5 周，將分化的抗性苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng) 2 周后壯苗與煉苗。針刺法接種轉(zhuǎn)基因植株及受體分蘗盛期葉片的結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因植株中表現(xiàn)出明顯的抗病反應(yīng)而受體則高度感病（見圖 2.2 a）。如圖所示，轉(zhuǎn)基因植株葉片接種點僅變白，周圍未見病斑；而受體植株葉片上有明顯的條狀病斑沿著接種點擴展，且病葉表面有菌膿呈現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因植株的DNA 及質(zhì)粒對照的 PCR 擴增產(chǎn)物是大小約為 1.45kb 的片段（如圖 2.2 b）。T0代轉(zhuǎn)基因植株的Southern 雜交的結(jié)果驗證了轉(zhuǎn)基因植株的外源基因?qū)霠顩r（如圖 2.2 c）。精品資料 轉(zhuǎn)基因植株的抗病反應(yīng)接種后 12 小時的 9804-Rxo1 和 9804 植株在接種點沒有可見的表型差異；在空氣濕度(shd