SDS-PAGE電泳

1、實驗四實驗四 蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子量的測定量的測定 SDS聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳法電泳法v聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE ）是根據(jù)）是根據(jù)被分被分離物質(zhì)所帶的電荷多少及其分子大小、形狀離物質(zhì)所帶的電荷多少及其分子大小、形狀的不同，的不同，在電場的作用下，產(chǎn)生不同的移動在電場的作用下，產(chǎn)生不同的移動速度而分離的方法。它具有速度而分離的方法。它具有電泳和分子篩電泳和分子篩的的雙重作用。雙重作用。 一、實驗原理一、實驗原理SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDS-PAGE) ，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進引進SDS（十二烷基硫酸

2、鈉）。（十二烷基硫酸鈉）。SDS是陽離子去污劑，作用有四：去是陽離子去污劑，作用有四：去蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、蛋白質(zhì)電荷、解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵、取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用、去多肽折疊。（空間構(gòu)象破壞）折疊。（空間構(gòu)象破壞） 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)與SDS分子按比例分子按比例(1.4gSDS/g蛋蛋白質(zhì)白質(zhì))結(jié)合，形成結(jié)合，形成帶負電荷帶負電荷的的SDS-蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)復合物，其負電荷遠遠超過了蛋白質(zhì)分子復合物，其負電荷遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷原有的電荷,因而因而降低或消除降低或消除了各種蛋白了各種蛋白質(zhì)分子之間質(zhì)分子之間天然的電荷差異天然的電荷差異，由于，

3、由于SDS與與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的進行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決遷移速度取決于分子大小于分子大小。 帶負電荷帶負電荷的的SDS-蛋白質(zhì)復合物蛋白質(zhì)復合物當分子量在當分子量在15KD到到200KD之間時，蛋白質(zhì)的之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：符合下式： logMW=K-bX，式中：式中：MW為分子量，為分子量，X為遷移率，為遷移率，k、b均為均為常數(shù)。常數(shù)。若將若將已知分子量的標準蛋白質(zhì)已知分子量的標準蛋白質(zhì)的遷移率對的遷移率對分子分子量對數(shù)作圖量對數(shù)作圖

4、，可獲得一條，可獲得一條標準曲線標準曲線，未知蛋白，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在率即可在標準曲線上求得分子量。標準曲線上求得分子量。SDS-PAGE SDS-PAGE 標準曲線標準曲線相相對對分分子子量量相對遷移率相對遷移率二、凝膠的原理二、凝膠的原理v聚丙烯酰胺（Acr）單體和交聯(lián)劑 N ， N 亞甲基雙丙烯酰胺（Bis 在催化劑的作用下聚合成含有酰胺基側(cè)鏈的脂肪族長鏈。相鄰的兩個鏈通過亞甲基橋交聯(lián)起來就形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的聚丙烯酰胺凝膠。 v雙丙烯酸銨決定交聯(lián)形成的程度，丙烯酰胺決定決定交聯(lián)的長度常用的催化劑（包括催化劑和加

5、速劑）常用的催化劑（包括催化劑和加速劑）（1）過硫酸銨）過硫酸銨 (AP) TEMED （四甲基乙二（四甲基乙二胺）系統(tǒng)胺）系統(tǒng)在 Acr 和 Bis 的溶液中放入這個催化系統(tǒng)后，過硫酸銨 （NH4）2S2O8 產(chǎn)生出游離氧原子使單體成為具有游離基的狀態(tài)，從而發(fā)生聚合作用。聚合的初速度和過硫酸銨濃度的平方根成正比。這種催化系統(tǒng)需要在堿性條件下進行（pH8.8)。 （ 2 ）核黃素）核黃素 TEMED 系統(tǒng)系統(tǒng)v 這是一個光激發(fā)的催化反應。核黃素在光照下分解，被還原成無色型，但在有氧條件下，無色型又被氧化成有游離基的黃素環(huán)，使聚合作用開始。 凝膠的濃度：凝膠的濃度：v常用的所謂標準膠是指濃度為

6、7.5 的凝膠，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)在此膠中電泳都能得到滿意的結(jié)果。當分析一個未知樣品時，常常先用 7.5 的標準凝膠或用4 10的凝膠梯度來試測，選出適宜的凝膠濃度。 SDS-PAGE電泳系統(tǒng)有兩種電泳系統(tǒng)有兩種：（1）連續(xù)聚丙烯酰胺電泳系統(tǒng)：）連續(xù)聚丙烯酰胺電泳系統(tǒng)：凝膠全部有分離膠組成，凝膠全部有分離膠組成，不具備濃縮效應。不具備濃縮效應。（2）不連續(xù)的聚丙烯酰胺電泳系統(tǒng)：）不連續(xù)的聚丙烯酰胺電泳系統(tǒng)： 有濃縮膠和分離膠組成。有濃縮膠和分離膠組成。 通過濃縮效應、電荷效應和分子篩效應通過濃縮效應、電荷效應和分子篩效應 ，使蛋白質(zhì)在進入分離膠之前，快、慢離使蛋白質(zhì)在進入分離膠之前，快、慢

7、離子之間子之間濃縮成一薄層濃縮成一薄層，有利于提高電泳，有利于提高電泳的分辨率。的分辨率。三、三、 所用試劑：所用試劑： vAcr（acrylamide）/Bis 儲備液儲備液v10% (w/v) SDS ：vTEMED(四甲基乙二胺四甲基乙二胺)v過硫酸銨過硫酸銨 (AP):10%現(xiàn)配現(xiàn)用現(xiàn)配現(xiàn)用vTrisHCL緩沖系統(tǒng)，緩沖系統(tǒng)，v分離膠緩沖液分離膠緩沖液（1.5 mol/L Tris-HCl, pH 8.8）v濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl, pH 6.8v電極泳緩沖液：電極泳緩沖液：使用的使用的Tris甘氨酸緩沖系統(tǒng)：甘氨酸緩沖系統(tǒng)：pH 8.3內(nèi)含內(nèi)含

8、SDSv樣品緩沖液（樣品緩沖液（62.5 mmol/L Tris-HCl, pH 6.8 ）v染色液（考馬斯亮藍染色液（考馬斯亮藍 R-250）v脫色液：（脫色液：（ 甲醇：冰醋酸：水甲醇：冰醋酸：水=4：1：5）v溴粉蘭：溴粉蘭：0.1%四、實驗步驟四、實驗步驟l. 貯液配制：貯液配制： v應注意：應注意：（1）配好的貯液用棕色瓶盛裝置冰箱內(nèi)保存，）配好的貯液用棕色瓶盛裝置冰箱內(nèi)保存，可放可放 l 2 個月。個月。 （2）過硫酸銨應當天配制。）過硫酸銨應當天配制。 （3）如有不溶物要過濾。）如有不溶物要過濾。 （4）顯色液用前再混和。）顯色液用前再混和。 （5）電極緩沖液用時稀釋）電極緩沖液

9、用時稀釋 10 倍。倍。 2. 安裝夾心式垂直板電泳槽安裝夾心式垂直板電泳槽 3.配膠：配膠：采用不連續(xù)系統(tǒng)采用不連續(xù)系統(tǒng)（1）分離膠的制備（）分離膠的制備（10ml，12%）：）： 蒸餾水蒸餾水 3.4ml Acr/Bis儲備液儲備液 4.0ml 分離膠緩沖液分離膠緩沖液 2.5ml 10% SDS 100l 10% APS 50l TEMED 5l按上述配方依次加入各種溶液，充分搖勻后灌按上述配方依次加入各種溶液，充分搖勻后灌入制膠架中。入制膠架中。 （2）濃縮膠的制備（）濃縮膠的制備（5ml，5%） 蒸餾水蒸餾水 2.85mlAcr/Bis儲備液儲備液 0.85ml濃縮膠緩沖液濃縮膠緩沖

10、液 1.25ml10% SDS 50l10% APS 25lTEMED 5l在灌入濃縮膠后插入樣品梳。在灌入濃縮膠后插入樣品梳。 4. 樣品的處理及點樣：樣品的處理及點樣： 將提取的蛋白質(zhì)（或標準蛋白）中加入等體將提取的蛋白質(zhì)（或標準蛋白）中加入等體積的上樣緩沖液，混勻，置于沸水浴中加熱積的上樣緩沖液，混勻，置于沸水浴中加熱5min，冷卻后經(jīng)，冷卻后經(jīng)10000rpm離心離心15min，取，取上清液點樣。上清液點樣。5.電泳：電泳：將制好膠的電泳槽放入底座中，加入電極緩沖將制好膠的電泳槽放入底座中，加入電極緩沖液，上層液中加入溴粉蘭指示劑，連接好電泳液，上層液中加入溴粉蘭指示劑，連接好電泳儀，

11、開始電泳。儀，開始電泳。濃縮膠恒壓濃縮膠恒壓75V，分離膠恒壓，分離膠恒壓120V，電泳時間，電泳時間約約90min。6.染色和脫色：染色和脫色：v當藍色染料遷移至距離橡膠框下緣當藍色染料遷移至距離橡膠框下緣 1 cm 時，時，電泳結(jié)束。電泳結(jié)束。v將膠剝離，放入容器中，用蒸餾水清洗將膠剝離，放入容器中，用蒸餾水清洗2-3遍，倒入染色液染色遍，倒入染色液染色2-3h或靜置或靜置過夜。過夜。染色結(jié)束后，用蒸餾水沖洗膠染色結(jié)束后，用蒸餾水沖洗膠2-3遍，以清除遍，以清除多余的染料，倒入多余的染料，倒入脫色液脫色液，置于脫色搖床上，置于脫色搖床上脫色，中間換脫色，中間換1-2次脫色液，直至背景色完全次脫色液，直至背景色完全脫掉。脫掉。v附：附： 樣品的制備樣品的制備 v稱取植物材料稱取植物材料 1 g ，放入研缽內(nèi)，加，放入研缽內(nèi)，加 pH8.0 提取液提取液 1 mL ，于冷水浴中研成勻漿，然后，于冷水浴中研成勻漿，然后