實時熒光定量PCR介紹PPT教案

1、實時熒光定量實時熒光定量PCR介紹介紹主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容Real Time PCRReal Time PCR基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識12Real Time PCRReal Time PCR實驗方法實驗方法3Real Time PCRReal Time PCR解析方法解析方法4Real Time PCRReal Time PCR應(yīng)用實例應(yīng)用實例第1頁/共51頁Real Time PCRReal Time PCR基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識1. Real Time PCR的用途及原理2. Real Time PCR的檢測方法Real Time PCRReal Time PCR基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識1第2頁/共51頁Re

2、al Time PCR的用途的用途病毒及病原菌定量分析病毒及病原菌定量分析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析導(dǎo)入基因拷貝數(shù)解析GMO定量檢測定量檢測差異顯示結(jié)果驗證差異顯示結(jié)果驗證基因芯片結(jié)果驗證基因芯片結(jié)果驗證siRNA效果確認效果確認mRNA表達量分析表達量分析病毒及病原菌檢測病毒及病原菌檢測物種鑒定物種鑒定基因分型基因分型第3頁/共51頁Real Time PCRReal Time PCR的原理的原理 激發(fā)光激發(fā)光發(fā)射光發(fā)射光使用使用Real Time PCRReal Time PCR擴增裝置實時監(jiān)測擴增裝置實時監(jiān)測PCRPCR擴增產(chǎn)物并進行分析的方法。擴增產(chǎn)物并進行分析的方法。Real Time PC

3、RReal Time PCRCtCt值值第4頁/共51頁Real Time PCRReal Time PCR基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識1. Real Time PCR的用途及原理2. Real Time PCR的檢測方法Real Time PCRReal Time PCR基礎(chǔ)知識基礎(chǔ)知識1第5頁/共51頁TaqManProbeTaqManProbeCyclingCyclingProbeProbeMolecularMolecularBeaconBeaconetc.熒光染料嵌合法熒光染料嵌合法熒光探針法熒光探針法Real Time PCRReal Time PCR的檢測方法的檢測方法第6頁/共51頁熒光染料

4、嵌合法（熒光染料嵌合法（SYBR Green ISYBR Green I）SYBR Green ISYBR Green I：是一種能結(jié)合于所有：是一種能結(jié)合于所有dsDNAdsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的雙螺旋小溝區(qū)域的 具有綠色激發(fā)波長的染料。具有綠色激發(fā)波長的染料。第7頁/共51頁Primer退退 火火 FFFFSYBR Green I 法法作用機理示意圖作用機理示意圖Pol.FPrimerPol.延延 伸伸 FFFFFFPrimer熱變熱變性性 FFFF第8頁/共51頁TaqManTaqMan法作用機理法作用機理TaqManTaqMan探針為一寡核苷酸，探針為一寡核苷酸，5 5 端標記一個報告

5、基團（端標記一個報告基團（ReporterReporter），），3 3 端標記一個淬滅基團（端標記一個淬滅基團（QuencherQuencher）。）。 RQ第9頁/共51頁RQPrimerRQPrimerRQPrimerPol.Pol.熱變熱變性性 退退 火火 延延 伸伸 TaqManTaqMan Probe Probe法原理示意圖法原理示意圖 第10頁/共51頁 One-Step RT-PCR特異性高特異性高多重多重PCRPCR檢出檢出ProbeProbe設(shè)計要求高設(shè)計要求高 ProbeProbe法法 ProbeProbe合成費用高合成費用高SYBR Green I SYBR Green

6、 I 法與法與ProbeProbe法比較法比較常用于常用于mRNAmRNA表達量分析等表達量分析等SYBR Green I SYBR Green I 法法 簡便易行簡便易行價格便宜價格便宜要求反應(yīng)的特異性要求反應(yīng)的特異性不能進行多重不能進行多重PCRPCR常用于常用于SNPSNP解析，病毒、病源菌檢測解析，病毒、病源菌檢測第11頁/共51頁主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容2Real Time PCR實驗方法第12頁/共51頁RTRT PrimerPrimer的選擇的選擇 Random PrimerRandom Primer Oligo dT PrimerOligo dT Primer Gene Spec

7、ific Primer Gene Specific PrimerRandom 6mer PrimerRandom 6mer PrimerGene Specific PrimerGene Specific PrimerOligo dT PrimerOligo dT PrimerPCR R-PrimerPCR R-PrimerPCR F-PrimerPCR F-Primer第13頁/共51頁目的片段在距目的片段在距Poly(A) Tail Poly(A) Tail 1.5 kbp 1.5 kbp 以內(nèi)適用，以內(nèi)適用，RTRT效效率較高。率較高。One Step RT-PCR One Step RT

8、-PCR 只能使只能使用用Gene Specific PrimerGene Specific Primer，但不適用于復(fù)數(shù)基因的檢但不適用于復(fù)數(shù)基因的檢出。出。5 53 3Gene Specific PrimerGene Specific Primer目的片段目的片段R RF FAAAAAA5 53 3目的片段目的片段R RF F1,500 base1,500 baseOligo dT PrimerOligo dT PrimerRandomRandom目的片段目的片段5 53 3R RF F目的片段在目的片段在mRNAmRNA任何位任何位置都能使用。通常置都能使用。通常mRNAmRNA表達量分

9、析最適。表達量分析最適。Oligo dT PrimerOligo dT Primer5 53 3R RF FAAAAAA目的片段目的片段RandomRandom適用于適用于mRNAmRNA表達量分析表達量分析，提升反應(yīng)檢測的靈敏度，提升反應(yīng)檢測的靈敏度。RTRT PrimerPrimer的選擇的選擇第14頁/共51頁Real Time PCRReal Time PCR引物設(shè)計引物設(shè)計目的是獲得目的基因，對非特異性反應(yīng)和引物二目的是獲得目的基因，對非特異性反應(yīng)和引物二聚體要求不嚴格。聚體要求不嚴格。目的是讓目的基因按照理論值進行擴增，對非特異目的是讓目的基因按照理論值進行擴增，對非特異性反應(yīng)和引

10、物二聚體要求嚴格。性反應(yīng)和引物二聚體要求嚴格。Real Time PCRReal Time PCR用引物與普通用引物與普通PCRPCR引物設(shè)計要求不同引物設(shè)計要求不同= = 對引物設(shè)計要求嚴格對引物設(shè)計要求嚴格普通普通PCRPCR引物引物Real Time PCRReal Time PCR引物引物第15頁/共51頁兩條引物的兩條引物的TmTm值盡量接近，應(yīng)用專用軟件計算值盡量接近，應(yīng)用專用軟件計算TmTm值值 TmTm值值40-60%(40-60%(最好最好45-55%)45-55%) GCGC含量含量PrimerPrimer長度長度80-150 bp(80-150 bp(盡量限制在盡量限制在

11、300 bp300 bp以內(nèi)以內(nèi)) )擴增片段大擴增片段大小小17-25 base17-25 base使用使用BLASTBLAST檢索，確認引物特異性檢索，確認引物特異性 特異性特異性 引物內(nèi)部或兩條引物之間避免引物內(nèi)部或兩條引物之間避免3 base3 base以上的互補序列以上的互補序列 引物引物3 3 末端避免末端避免2 base2 base以上的互補序列以上的互補序列 互補性互補性3 3 末端序列末端序列 整體上堿基不能過偏整體上堿基不能過偏 個別部分避免個別部分避免GC richGC rich或或AT rich(AT rich(特別是特別是3 3 端端) ) 避免避免T/CT/C連續(xù)，

12、連續(xù)，A/GA/G連續(xù)連續(xù)序列序列 3 3 末端避免末端避免GC richGC rich或或AT richAT rich 3 3 末端堿基最好為末端堿基最好為G G 或或C C 3 3 末端堿基盡量避免為末端堿基盡量避免為T T盡量在盡量在Exon junctionExon junction上設(shè)計引物，限制基因組上設(shè)計引物，限制基因組DNADNA擴增擴增 RT-PCRRT-PCR用引物用引物Real Time PCRReal Time PCR引物設(shè)計原則引物設(shè)計原則第16頁/共51頁探針的探針的TmTm比引物高比引物高8-108-10 TmTm值值20-24 bp20-24 bp ProbeP

13、robe長度長度探針探針5 5 末端的第一個堿基不能是末端的第一個堿基不能是G G5 5 末端序列末端序列 目的序列目的序列GCGC含量相對較高的區(qū)域設(shè)計含量相對較高的區(qū)域設(shè)計 整體上堿基不能過偏整體上堿基不能過偏 個別部分避免個別部分避免GC richGC rich或或AT rich (AT rich (特別是特別是3 3 端端) )；避免；避免T/C T/C 連續(xù)，連續(xù)，A/CA/C連續(xù)連續(xù)序列序列ProbeProbe內(nèi)部或內(nèi)部或ProbeProbe與兩條引物之間避免與兩條引物之間避免3 base3 base以上的互補序以上的互補序列列 互補性互補性BLASTBLAST檢索確認檢索確認Pr

14、obeProbe特異性特異性 特異性特異性Real Time PCRReal Time PCR用用TaqManTaqMan探針設(shè)計原則探針設(shè)計原則Real Time PCRReal Time PCR探針設(shè)計原則探針設(shè)計原則第17頁/共51頁線性關(guān)系、擴增效率確認線性關(guān)系、擴增效率確認檢測靈敏度確認檢測靈敏度確認PCRPCR擴增效率（擴增效率（E E）：）：0.8-1.20.8-1.235Cycles35Cycles內(nèi)可得到好的定量結(jié)果。內(nèi)可得到好的定量結(jié)果。如果采用如果采用SYBRSYBR檢測方法，檢測方法，30Cycles30Cycles內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增。內(nèi)無非特異性產(chǎn)物擴增。No No

15、 T Template emplate C Controlontrol確認確認30Cycles30Cycles內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生。內(nèi)無引物二聚體產(chǎn)生。相關(guān)系數(shù)（相關(guān)系數(shù)（r r2 2）：大于）：大于0.980.98反應(yīng)性能確認反應(yīng)性能確認第18頁/共51頁主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容3Real Time PCR解析方法1. 標準曲線分析2. 融解曲線分析3. 絕對定量和相對定量解析方法第19頁/共51頁標準曲線制作標準曲線制作擴增曲線擴增曲線標準曲線標準曲線標準品梯度的選擇：標準品梯度的選擇：5 56 6個梯度個梯度標準品稀釋倍數(shù)的選擇：標準品稀釋倍數(shù)的選擇：標準品稀釋倍數(shù)通常為標準品稀釋倍數(shù)通常為

16、101010105 5 10104 4 10103 3 10102 2 10101 1 10100 0 10105 5 10104 4 10 103 3 10 102 2 10 101 1 10 100 0第20頁/共51頁標準品的種類標準品的種類 基因組基因組DNADNA 質(zhì)粒質(zhì)粒 Total RNA & Total RNA & cDNAcDNA 體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄RNARNADNADNA樣品定量標準樣品定量標準品品 RNARNA樣品定量標準品樣品定量標準品第21頁/共51頁質(zhì)粒標準品構(gòu)建流質(zhì)粒標準品構(gòu)建流程程基因組基因組DNADNAPCRPCR目的基因克隆目的基因克隆目的基因目的基因目的基因

17、目的基因目的基因目的基因質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒提取，質(zhì)粒提取，ODOD值定量。將質(zhì)粒梯度稀釋至值定量。將質(zhì)粒梯度稀釋至10105 5-10-101 1 copies/ulcopies/ul，作為標準品。，作為標準品。第22頁/共51頁體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄RNARNA標準品構(gòu)建流標準品構(gòu)建流程程RNARNA純化后，測純化后，測ODOD定量。將定量。將RNARNA梯度稀釋至梯度稀釋至10105 5-10-101 1 copies/ulcopies/ul，作為標準品。，作為標準品。T7 RNA polymeraseT7 RNA polymerase體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄RNARNATotal Total RNARNAP

18、CRPCRcDNAcDNARTRTT7 PromoterT7 PromoterTTTTTTTTT TPCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因目的基因AAAAAAAAAAAAAAAAAAA A第23頁/共51頁理想的標準品擴增曲線理想的標準品擴增曲線基線平整基線平整Negative ControlNegative Control為水平線為水平線指數(shù)區(qū)較明顯，陡度大指數(shù)區(qū)較明顯，陡度大平臺區(qū)匯于一起平臺區(qū)匯于一起線性范圍寬線性范圍寬第24頁/共51頁理想的標準曲線理想的標準曲線 相關(guān)系數(shù)（相關(guān)系數(shù)（r r2 2）：大于）：大于0.980.98，越接近，越接近1 1，結(jié)果可信度越

19、高。，結(jié)果可信度越高。 擴增效率（擴增效率（E E）：）：0.8-1.20.8-1.2，越接近，越接近1 1，越理想。，越理想。 擴增效率擴增效率 相關(guān)系數(shù)相關(guān)系數(shù) 擴增效率（擴增效率（E E）計算方法）計算方法 標準曲線標準曲線X X軸表示起始模板濃度（軸表示起始模板濃度（loglog1010) )，Y Y軸表示軸表示CtCt值時值時 E=10E=10-1/a-1/a-1-1 標準曲線標準曲線X X軸表示軸表示CtCt值，值，Y Y軸表示起始模板濃度（軸表示起始模板濃度（loglog1010) ) E=10 E=10-a-a-1 -1 第25頁/共51頁Real Time PCRReal T

20、ime PCR解析方法解析方法3Real Time PCR解析方法1. 1. 標準曲線分析標準曲線分析2. 2. 融解曲線分析融解曲線分析3. 3. 絕對定量和相對定量解析方法絕對定量和相對定量解析方法第26頁/共51頁融解曲線分融解曲線分析析 Tm值是指雙鏈DNA分子解鏈一半時的溫度。 SYBR Green I SYBR Green I 法進行檢出時，法進行檢出時，要根據(jù)融解曲線確認要根據(jù)融解曲線確認PCRPCR產(chǎn)物的特異性。產(chǎn)物的特異性。第27頁/共51頁特異性產(chǎn)物特異性產(chǎn)物非特異產(chǎn)物非特異產(chǎn)物引物二聚體引物二聚體對對PCRPCR產(chǎn)物特異性進行分析產(chǎn)物特異性進行分析融解曲線分融解曲線分析析

21、第28頁/共51頁3Real Time PCR解析方法1. 標準曲線分析2. 融解曲線分析3. 絕對定量和相對定量解析方法Real Time PCR解析方解析方法法第29頁/共51頁絕對定量解析方法絕對定量解析方法提取樣品提取樣品引物設(shè)計引物設(shè)計標準品制備標準品制備Real Time PCRReal Time PCR反應(yīng)反應(yīng)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析流流程程第30頁/共51頁絕對定量解析方法絕對定量解析方法通過制作標準曲線來確定樣品的初始模板拷貝數(shù)或濃度。通常應(yīng)用于病通過制作標準曲線來確定樣品的初始模板拷貝數(shù)或濃度。通常應(yīng)用于病毒、細菌、衣原體、支原體的定量檢測及轉(zhuǎn)基因食品的檢測。毒、細菌、衣原體、支原

22、體的定量檢測及轉(zhuǎn)基因食品的檢測。10105 510104 410103 310101 1擴增曲線圖擴增曲線圖標準曲線標準曲線圖圖 檢測樣檢測樣品品檢測樣檢測樣品品10102 2第31頁/共51頁相對定量解析方相對定量解析方法法以上條件不可能同時得到滿足，必須用內(nèi)對照基因（管家基因）校正，以上條件不可能同時得到滿足，必須用內(nèi)對照基因（管家基因）校正，進行相對表達量分析。進行相對表達量分析。Sample BSample A目的基因擴增效率相同RNA提取效率相同細胞起始數(shù)相同進行相對表達量分析必要性實際上目的基因表達量分析實際上目的基因表達量分析第32頁/共51頁相對定量解析方法相對定量解析方法管家

23、基因管家基因 維持細胞基本代謝活動所必須的基因維持細胞基本代謝活動所必須的基因, , 如如：GAPDHGAPDH、-actin-actin等。等。篩選方法篩選方法 根據(jù)文獻提供根據(jù)文獻提供 通過具體實驗篩選通過具體實驗篩選第33頁/共51頁主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容Real Time PCR基礎(chǔ)知識12Real Time PCR實驗方法3Real Time PCR解析方法4Real Time PCR應(yīng)用實例 對對SARSSARS病毒基因進行定量分析病毒基因進行定量分析 分析小鼠分析小鼠PAH基因在不同組織中的表達量變化基因在不同組織中的表達量變化第34頁/共51頁絕對定量應(yīng)用例絕對定量應(yīng)用例 對對

24、SARSSARS樣品樣品中所含中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA進行定量進行定量 檢測方法檢測方法 TaqManTaqMan probe probe 法法 檢測樣品檢測樣品 3 3個從個從SARSSARS樣品中提取的樣品中提取的Total RNATotal RNA 目的基因目的基因 SARSSARS病毒病毒RNARNA 內(nèi)內(nèi) 參參 SARS Internal ControlSARS Internal Control RNARNA 標標 準準 品品 SARS Control RNASARS Control RNA 試試 劑劑 One Step PrimeScriptOne Step Pr

25、imeScript RT-PCR Kit RT-PCR Kit （Perfect Real TimePerfect Real Time）（）（DRR064DRR064） 儀儀 器器 Smart Cycler Smart Cycler 第35頁/共51頁 SYN247 F02SYN247 F02SYN247R03SYN247R03SYN247 F01SYN247 F01SYN247R02SYN247R02SYN247R01SYN247R01SYN247 F01SYN247 F01BamBamH H HinHind d pBluescript II SK(+pBluescript II SK(+)

26、 Vector) VectorT7 PromoterT7 PromoterBamBamH H HinHind d Sac Sac site site SARS Control RNASARS Control RNA構(gòu)建構(gòu)建絕對定量應(yīng)用例絕對定量應(yīng)用例 對對SARSSARS培養(yǎng)液中所含培養(yǎng)液中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA進行定量進行定量第36頁/共51頁 純化的純化的SARS Control RNA ODSARS Control RNA OD值測定結(jié)果值測定結(jié)果 體外轉(zhuǎn)錄的體外轉(zhuǎn)錄的SARS Control RNA SARS Control RNA 電泳照片電泳照片M1 M2M1 M

27、2M1: M1: - -HinHind digest d digest M2: DL2,000 MarkerM2: DL2,000 MarkerDNase IDNase I處理前處理前DNase IDNase I處理后處理后絕對定量應(yīng)用例絕對定量應(yīng)用例 對對SARSSARS樣品樣品中所含中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA進行定量進行定量第37頁/共51頁 DNDNA A BNITMSARAs2 Adaptor R BNITMSARAs2 Adaptor R SacSacsite site Bam Bam Hsite Hsite BNITMSARS1 Adaptor F BNITMSAR

28、S1 Adaptor F T7 PromoterT7 PromoterSARS Internal Control RNASARS Internal Control RNA的構(gòu)建的構(gòu)建A AA ApBluescriptII pBluescriptII SK(+SK(+) Vector) Vector 絕對定量應(yīng)用例絕對定量應(yīng)用例 對對SARSSARS樣品樣品中所含中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA進行定量進行定量第38頁/共51頁探針的選擇探針的選擇 TemplateTemplatePrimerPrimerTaqManTaqMan Probe Probe5 5 端報告基團端報告基團3 3

29、 端淬滅基團端淬滅基團SARS Control RNASARS Control RNAor SARS Genomic RNAor SARS Genomic RNA共用共用FAMFAM標記標記EclipseEclipse標記標記SARS Internal Control RNASARS Internal Control RNA共用共用ROXROX標記標記EclipseEclipse標記標記絕對定量應(yīng)用例絕對定量應(yīng)用例 對對SARSSARS樣品樣品中所含中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA進行定量進行定量第39頁/共51頁SARS Control RNA 10SARS Control RNA

30、 105 5-10-101 1擴增曲擴增曲線線 SARS Genomic RNA Sample 1SARS Genomic RNA Sample 1、擴增曲、擴增曲線線 SARS Internal Control RNASARS Internal Control RNA擴增曲線擴增曲線 標準曲線標準曲線 絕對定量應(yīng)用例絕對定量應(yīng)用例 對對SARSSARS樣品樣品中所含中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA進行定量進行定量第40頁/共51頁定量結(jié)果定量結(jié)果對三個樣品所含對三個樣品所含SARSSARS病毒病毒RNARNA進行了準確定量。進行了準確定量。絕對定量應(yīng)用例絕對定量應(yīng)用例 對對SARS

31、SARS樣品樣品中所含中所含SARSSARS病毒病毒RNARNA進行定量進行定量第41頁/共51頁相對定量應(yīng)用例相對定量應(yīng)用例 分析小鼠不同組織中分析小鼠不同組織中PAHPAH基因表達量的變化情況基因表達量的變化情況檢測方法檢測方法 SYBR Green I SYBR Green I 熒光嵌合法熒光嵌合法管家基因管家基因 GAPDHGAPDH基因基因目的基因目的基因 PAHPAH基因基因標標 準準 品品 cDNAcDNA試試 劑劑 PrimeScriptPrimeScript RT RT reagent Kit with reagent Kit with gDNAgDNA Eraser Era

32、ser （DRR047DRR047） SYBR SYBR Premix Ex Premix Ex TaqTaqTMTM II ( II (TliTli RNaseRNase H Plus) H Plus) （DRR820DRR820）儀儀 器器 Thermal Cycler DiceThermal Cycler Dice Real Time System Real Time System （TP800TP800） 第42頁/共51頁Total RNATotal RNA提取提取Total RNATotal RNA基因組基因組DNADNA去除去除標準品標準品RNARNA制備制備標準曲線制作及預(yù)實驗

33、標準曲線制作及預(yù)實驗詳細的實驗資料獲詳細的實驗資料獲取取實驗設(shè)計及引物實驗設(shè)計及引物 設(shè)計、合成設(shè)計、合成樣品樣品Real Time PCRReal Time PCR反應(yīng)反應(yīng)相對定量計算及相對定量計算及數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)整理及論文撰寫數(shù)據(jù)整理及論文撰寫相對定量應(yīng)用例相對定量應(yīng)用例 分析小鼠不同組織中分析小鼠不同組織中PAHPAH基因表達量的變化情況基因表達量的變化情況第43頁/共51頁提取提取Total RNATotal RNA后電泳照片后電泳照片提取試劑：提取試劑：TaKaRa RNAiso PlusTaKaRa RNAiso Plus （ D9108 D9108 ）相對定量應(yīng)用例相對定量

34、應(yīng)用例 分析小鼠不同組織中分析小鼠不同組織中PAHPAH基因表達量的變化情況基因表達量的變化情況M C L B M MM：DL2,000 DNA MarkerDL2,000 DNA MarkerC C：Control RNAControl RNAL L：Liver RNALiver RNAB B：Brain RNABrain RNA第44頁/共51頁目的基因標準曲線制作結(jié)果目的基因標準曲線制作結(jié)果擴增曲線圖擴增曲線圖融解曲線圖融解曲線圖標準曲線圖標準曲線圖管家基因標準曲線制作結(jié)果管家基因標準曲線制作結(jié)果相對定量應(yīng)用例相對定量應(yīng)用例 分析小鼠不同組織中分析小鼠不同組織中PAHPAH基因表達量的變化情況基因表達量的變化情況第45頁/共51頁擴增曲線圖擴增曲線圖樣品目的基因定量結(jié)果樣品目的基因定量結(jié)果樣品管家基因定量結(jié)果樣品管家基因定量結(jié)果管家基因管家基因 GAPDHG