檢測生物組織中蛋白質(zhì)、還原糖、脂肪實驗

1、實驗方案2009級5班 2組組長：田薪瑜組員：謝婷、付千武、王娟、石蛟、成娟、白靖檢測生物組織中蛋白質(zhì)、糖類、脂肪和淀粉一實驗背景資料本實驗選自人教版高中生物必修1分子與細胞第二章。本章逐一介紹了蛋白質(zhì)、糖類和脂肪，以初步了解組成生物細胞的化學(xué)元素為基礎(chǔ)，加強學(xué)生對蛋白質(zhì)、脂肪和糖類的認(rèn)識和理解，起到承上啟下的重要作用?？荚嚧缶V要求：檢測生物組織中蛋白質(zhì)、還原糖、脂肪和淀粉，要求理解上述知識和其他知識之間的聯(lián)系和區(qū)別，并能在較復(fù)雜的環(huán)境中綜合運用其進行分析、判斷、推理和評價。相關(guān)的熱點問題有生物組織中蛋白質(zhì)、還原糖、脂肪和淀粉檢測，注意事項及相關(guān)的實驗拓展。本實驗是驗

2、證性試驗，要檢測的蛋白質(zhì)是生物體的重要能源物質(zhì)，糖類是生物題主要的能量來源，而脂肪是生物體的儲能物質(zhì)，它們在生物體中都有著不可代替的重要作用。對于學(xué)生來說實驗內(nèi)容與生活聯(lián)系緊密，容易產(chǎn)生興趣。但檢測所用的實驗材料，試劑繁多，操作難度較大，需要教師精心的組織好教學(xué)，促使學(xué)生形成良好的習(xí)慣（一）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)是由氨基酸按一定順序結(jié)合形成一條多肽鏈，再由一條或一條以上的多肽鏈按照其特定方式結(jié)合而成的高分子化合物。蛋白質(zhì)具有一級、二級、三級、四級結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)決定了它的功能。蛋白質(zhì)的生理功能：在生命活動中，蛋白質(zhì)是一類極為重要的大分子，各種生命活動都與蛋白有關(guān)。1、蛋白質(zhì)不僅是細胞的主要結(jié)構(gòu)成分

3、，還是人體組織更新和修補的主要原料。人體的每個組織：毛發(fā)、皮膚、肌肉、骨骼、內(nèi)臟、大腦、血液、神經(jīng)、內(nèi)分泌等都是由蛋白質(zhì)組成；2、生物催化劑酶主要是蛋白質(zhì)，因此，細胞的代謝活動離不開蛋白質(zhì)；3、維持肌體正常的新陳代謝和各類物質(zhì)在體內(nèi)的輸送。載體蛋白對維持人體的正常生命活動是至關(guān)重要的?？梢栽隗w內(nèi)運載各種物質(zhì)。比如血紅蛋白輸送氧（紅血球更新速率250萬/秒）、脂蛋白輸送脂肪、細胞膜上的受體還有轉(zhuǎn)運蛋白等；4、維持體液的酸堿平衡；5、免疫細胞和免疫蛋白：有白細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、抗體（免疫球蛋白）、補體、干擾素等；6、激素的主要原料，如胰島素是由51個氨基酸分子合成，生長素是由191個氨基酸分

4、子合成；7、構(gòu)成神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿、五羥色氨等，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能：味覺、視覺和記憶等功能；8、膠原蛋白：占身體蛋白質(zhì)的1/3，生成結(jié)締組織，構(gòu)成身體骨架，如骨骼、血管、韌帶等；9、提供生命活動的能量。蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)：1、具有兩性：蛋白質(zhì)是由氨基酸通過肽鍵構(gòu)成的高分子化合物，在蛋白質(zhì)分子中存在著氨基和羧基，因此跟氨基酸相似，同時具有酸的性質(zhì)和堿的性質(zhì)；2、可發(fā)生水解反應(yīng)，蛋白質(zhì)在酸、堿或酶的作用下發(fā)生水解反應(yīng)，經(jīng)過多肽，最后得到多種氨基酸；3、溶水具有膠體的性質(zhì),有些蛋白質(zhì)能夠溶解在水里（例如雞蛋白能溶解在水里）形成溶液, 蛋白質(zhì)的分子直徑達到了膠體微粒的大?。?09107m），所以蛋白質(zhì)

5、具有膠體的性質(zhì)；4、加入電解質(zhì)可產(chǎn)生鹽析作用：少量的鹽（如硫酸銨、硫酸鈉等）能促進蛋白質(zhì)的溶解。如果向蛋白質(zhì)水溶液中加入濃的無機鹽溶液，可使蛋白質(zhì)的溶解度降低，而從溶液中析出，這種作用叫做鹽析。這樣鹽析出的蛋白質(zhì)仍舊可以溶解在水中，而不影響原來蛋白質(zhì)的性質(zhì)，因此鹽析是個可逆過程利用這個性質(zhì)，采用分段鹽析方法可以分離提純蛋白質(zhì)；5、蛋白質(zhì)的變性：在熱、酸、堿、重金屬鹽、紫外線等作作用下，蛋白質(zhì)會發(fā)生性質(zhì)上的改變而凝結(jié)起來這種凝結(jié)是不可逆的，不能再使它們恢復(fù)成原來的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的這種變化叫做變性。蛋白質(zhì)變性后，就失去了原有的可溶性，也就失去了它們生理上的作用因此蛋白質(zhì)的變性凝固是個不可逆過程。造成

6、蛋白質(zhì)變性的原因：物理因素包括：加熱、加壓、攪拌、振蕩、紫外線照射、X射線、超聲波等，化學(xué)因素包括：強酸、強堿、重金屬鹽、三氯乙酸、乙醇、丙酮等；6、顏色反應(yīng)：蛋白質(zhì)可以跟許多試劑發(fā)生顏色反應(yīng)例如在雞蛋白溶液中滴入濃硝酸，則雞蛋白溶液呈黃色這是由于蛋白質(zhì)（含苯環(huán)結(jié)構(gòu)）與濃硝酸發(fā)生了顏色反應(yīng)的緣故還可以用雙縮脲試劑對其進行檢驗，該試劑遇蛋白質(zhì)變紫；7、蛋白質(zhì)在灼燒分解時，可以產(chǎn)生一種燒焦羽毛的特殊氣味（二）還原糖分子結(jié)構(gòu)中含有還原性基團（如游離醛基、半縮醛羥基或游離羰基），能夠還原斐林(H.von Fehling)試劑或托倫斯(B.Tollens)試劑(銀氨溶液)的糖稱為還原糖，所有的單糖，不論

7、醛糖、酮糖都是還原糖。大部分雙糖也是還原糖，蔗糖例外。斐林試劑是含Cu2+絡(luò)合物的溶液，被還原后得到磚紅色Cu2O的沉淀。托倫斯試劑被還原后（銀鏡反應(yīng)）能生成單質(zhì)銀，在試管壁上可看到“銀鏡”。 一般情況下，單糖的還原能力主要來自它的醛基，如葡萄糖，而多糖則大多因為半縮醛羥基的存在。還原后，自己會變成糖酸，如葡萄糖就會變成葡萄糖酸。葡萄糖溶液與斐林試劑反應(yīng)生成磚紅色沉淀：CH2OH（CHOH）4CHO+2Cu(OH)2-加熱CH2OH（CHOH）4COOH+Cu2O+2H2O細胞中的單糖既作為能源又是合成與糖類有關(guān)的化合物的原料。重要的單糖有五碳糖（戊糖）和六碳糖（己糖），其中最主要的五碳糖為核

8、糖，最重要的六碳糖為葡萄糖。葡萄糖不僅是能量代謝中的重要單糖，而且是構(gòu)成多糖的主要單體。淀粉是一種多糖，淀粉在餐飲業(yè)又稱芡粉，通式是(C6H10O5)n。制造淀粉是植物儲存能量的一種方式，種子、果實及變態(tài)根莖中都富含淀粉。淀粉可以看作是葡萄糖的高聚體。淀粉除食用外，工業(yè)上用于制糊精、麥芽糖、葡萄糖、酒精燈，也用于調(diào)制印花漿、紡織品的上漿、紙張的上膠、藥物片劑的壓制等。（三）脂肪脂肪所含的化學(xué)元素主要是C、H、O,部分還含有N，P等元素。脂肪是由甘油和脂肪酸組成的三酰甘油酯。甘油的分子比較簡單，而脂肪酸的種類和長短卻不相同，脂肪酸分三大類：飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸。 脂肪在多數(shù)

9、有機溶劑中溶解，但不溶解于水。三酰甘油常溫下呈液態(tài)的?；视头Q油（oil），呈固態(tài)的稱脂（fat）。純的三酰甘油是無色、無臭、無味的稠性液體或蠟狀固體，三酰甘油的密度均小于1 g/cm3。三酰甘油不溶于水，略溶于低級醇，易溶于乙醚、氯仿、苯和石油醚等非極性有機溶劑。脂肪的生理功能：1、生物體內(nèi)儲存能量的物質(zhì)并給予能量 ，1克脂肪在體內(nèi)分解成二氧化碳和水并產(chǎn)生38KJ能量，比1克蛋白質(zhì)或1克葡萄糖高一倍多；2、構(gòu)成一些重要生理物質(zhì)（如細胞膜的磷脂雙分子層），脂肪是生命的物質(zhì)基礎(chǔ) 是人體內(nèi)的三大組成部分(蛋白質(zhì)、脂肪、糖類)之一；3、維持體溫和保護內(nèi)臟、緩沖外界壓力 皮下脂肪可防止體溫過多向外散失

10、，減少身體熱量散失, 維持體溫恒定。也可阻止外界熱能傳導(dǎo)到體內(nèi)，有維持正常體溫的作用。內(nèi)臟器官周圍的脂肪墊有緩沖外力沖擊保護內(nèi)臟的作用。減少內(nèi)部器官之間的摩擦；4、提供必需脂肪酸；5、脂溶性維生素的重要來源 魚肝油和奶油富含維生素A、D，許多植物油富含維生素E。脂肪還能促進這些脂溶性維生素的吸收；6、增加飽腹感 脂肪在胃腸道內(nèi)停留時間長，所以有增加飽腹感的作用。脂肪攝入過量將產(chǎn)生肥胖，并導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生，如脂肪肝等，膳食脂肪總量增加，還會增大癌癥的發(fā)生幾率。必需脂肪酸缺乏，可引起生長遲緩、生殖障礙、皮膚受損等；另外，還可引起肝臟、腎臟、神經(jīng)和視覺等多種疾病。二 實驗?zāi)康?、 了解斐林試劑和雙

11、縮脲試劑的配制方法以及兩者的不同點與相同點。2、 明白蛋白質(zhì)、脂肪、還原糖及淀粉分別與雙縮脲試劑、蘇丹（或蘇丹）、斐林試劑、碘液的顯色原理。3、 掌握顯色反應(yīng)基本的實驗方法，實驗儀器的使用，試劑的配制。4、 培養(yǎng)學(xué)生理解、思考和分析問題的能力和動手實際操作實驗的能力。三 實驗原理（一）還原糖的鑒定1、斐林試劑鑒定可溶性還原糖斐林試劑是由0.1 g/mL的NaOH溶液和0.05 g/mLCuSO4的溶液，還有含量為0.2g/mL酒石酸鉀鈉配制而成的，其本質(zhì)是新配制的Cu(OH)2。 可溶性還原糖如葡萄糖、果糖、麥芽糖等的分子內(nèi)部含有游離的具有還原性半縮羥基，當(dāng)與新配制的一定濃度的Cu(OH)2懸

12、濁液混合后，在加熱的條件下將Cu(OH)2還原為磚紅色的Cu2O沉淀，而還原糖本身則被氧化為相應(yīng)的有機酸。以葡萄糖為例的反應(yīng)式如下： 2、班氏試劑鑒定可溶性還原糖班氏試劑由A液(硫酸銅溶液)，B液(檸檬酸鈉和碳酸溶液)配制而成。實驗原理與斐林試劑相似，所不同的是班氏試劑可長期使用。用班氏試劑鑒定可溶性還原糖，比用斐林試劑更簡便。斐林試劑要現(xiàn)配現(xiàn)用，否則實驗難以得到滿意結(jié)果，因為此反應(yīng)利用的是斐林試劑中的Cu(OH)2產(chǎn)物作為弱氧化劑參與與還原糖的反應(yīng)，而Cu(OH)2是一種沉淀物質(zhì)，放置過久沉淀過多則不利于反應(yīng)，而班氏試劑是斐林試劑的改良，它利用檸檬酸作為Cu2+的絡(luò)合劑，使溶液穩(wěn)定、靈敏度高

13、且可以長期使用，故更簡便。利用斐林試劑或班氏試劑可以進行尿糖檢測。3、還原糖的3，5-二硝基水楊酸檢測法還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其他產(chǎn)物，3，5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖含量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計，在540 nm波長下測定光密度值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。（二） 脂肪的鑒定脂肪是體內(nèi)儲存能量和供給能量的重要物質(zhì)，根據(jù)其性質(zhì)可以分為中性脂肪、脂肪酸、膽固醇、鞘磷脂等。很多細胞都含有脂肪，游離狀態(tài)的脂肪呈小滴狀懸浮于細胞質(zhì)內(nèi)，比較顯著的如肝細胞。脂肪小滴可以集合，將細胞質(zhì)及細胞核

14、擠到一旁，如脂肪細胞。如果組織中脂肪過多，將會影響其正常功能。如脂肪肝。脂肪不溶于水，易溶于濃乙醇、苯、氯仿和乙醚等，因此制作脂類標(biāo)本一般不用石蠟切片，而用冰凍切片或者鋪片法以保存脂類，固定多用甲醛類固定液。其染色方法有脂溶性染料顯示法、化學(xué)顯示法和特異染色法等。脂溶性染料顯示法利用蘇丹染料中的蘇丹III、蘇丹IV或者蘇丹黑等溶于脂類，而使脂類顯色的原理顯示脂類，使用時，要注意選擇溶劑，要求既要溶解蘇丹染料，又不溶掉脂肪。蘇丹染料是偶氮染料，它對脂類的顯示是一種簡單的物理變化。蘇丹染料是一種脂溶性染料，易溶于乙醇但更易溶于脂肪，所以當(dāng)含有脂肪的標(biāo)本與蘇丹染料接觸時，蘇丹染料即脫離乙醇而溶于該含

15、脂肪結(jié)構(gòu)中而使其顯色。脂肪可以被蘇丹染液染成橘黃色（或被蘇丹染液染成紅色）。（三）蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑反應(yīng)原理雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)及多肽的肽鍵與雙縮脲的結(jié)構(gòu)類似，也能與Cu2+形成紫紅色絡(luò)合物。分子中只要含有肽鍵，一般都會發(fā)生這種特征的紫色反應(yīng)。蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅離子絡(luò)合的示意圖：紫紅色化合物雙縮脲試劑是由雙縮脲試劑A(NaOH)和雙縮脲試劑B(CuSO4)兩

16、種試劑組成. 故可用于鑒定蛋白質(zhì)。（四）淀粉的鑒定 淀粉分為直鏈淀粉和支鏈淀粉。直鏈淀粉是由葡萄糖基用-1，4-糖苷鍵鍵合而成的多糖鏈，如圖1：支鏈淀粉相對分子質(zhì)量比直鏈淀粉大得多，其分子比較復(fù)雜 ,由大約20個D一葡萄糖基用-1，4-糖苷鍵連結(jié)起來的許多短鏈組成 ,短鏈連接處是用-1，6-糖苷鍵互相連接起來的，如圖2：圖2 直鏈淀粉是由D-葡萄糖基用-1，4-糖苷鍵鍵合而成的直鏈分子，淀粉鏈盤繞成螺旋狀,每個葡萄糖基都仍有羥基暴露在螺旋外,碘分子跟這些羥基作用,使碘分子嵌入淀粉螺旋體的軸心部位,碘跟淀粉的這種作用叫做包合作用,生成物叫做包合物。包合物改變了吸收光的性能而變色 ,能均勻吸收除藍

17、光以外波長范圍為400一750nm的可見光 ,淀粉液即呈現(xiàn)出藍色。淀粉跟碘生成的包合物的顏色與淀粉糖苷鏈的長度有關(guān) ,當(dāng)鏈長小于6個葡萄糖基時,不能形成一個螺旋圈,因而不能呈色。當(dāng)平均長度為20個葡萄糖基時呈紅色 ,大于60個葡萄糖基時呈藍色。支鏈淀粉相對分子質(zhì)量雖大,但支鏈淀粉的分支長度只有20-30個葡萄糖基,碘鉆人長短不一的螺旋卷曲管內(nèi)顯出不同顏色 ,支鏈淀粉遇碘呈紫紅色正是藍、紅混合色。而直鏈淀粉的鏈長超過60個葡萄糖基 ,所以與碘作用呈現(xiàn)藍色。 配好的淀粉溶液不宜放置時間過長,淀粉溶液越新鮮,與碘作用呈藍色反應(yīng)越明顯,淀粉液存放時間越長,部分淀粉液會緩慢地水解為糊精等,降低反應(yīng)的靈敏

18、度,反應(yīng)呈藍紫色,甚至紫紅色。因此,實驗所用淀粉液最好臨時配制以保持其新鮮程度。四 實驗材料及器具1.實驗材料用于鑒定還原糖的實驗材料 梨兩個（制備成組織勻漿：去皮切小塊，研缽研碎，濾渣留漿）。做可溶性還原糖的檢測（鑒定）實驗，應(yīng)該選擇含糖量較高、顏色為白色或近于白色的植物組織。本實驗最理想的實驗材料是還原糖含量較高的植物組織(或器官)，而且組織的顏色較淺或近于白色的，如蘋果和梨的果實。經(jīng)試驗比較，顏色反應(yīng)的明顯程度依次為蘋果、梨、白色甘藍葉、白蘿卜。在雙子葉植物中，光合作用的主要產(chǎn)物葡萄糖形成后，合成為淀粉，暫時儲藏在葉子內(nèi)，因此最好不用雙子葉植物的葉子作實驗材料。有些單子葉植物，如韭菜、鳶

19、尾，并不將光合作用的初始產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榈矸郏虼巳~內(nèi)含有大量的可溶性單糖，但是，由于葉片中葉綠素的顏色較深，對于鑒定時的顏色反應(yīng)起著掩蓋作用，導(dǎo)致實驗現(xiàn)象不明顯，因此，也不宜用單子葉植物的葉子作實驗材料。（2）用于鑒定脂肪的實驗材料  花生種子、花生種子勻漿：去殼花生2兩（做脂肪的檢測（鑒定）實驗，應(yīng)該選擇富含脂肪的種子，以花生種子為最好。花生種子實驗前必須提前浸泡34小時，浸泡時間短了，不容易切片，浸泡時間過長，則組織太軟，切下的薄片不易成形）。(3) 用于鑒定蛋白質(zhì)的實驗材料準(zhǔn)備 雞蛋(卵白)稀釋液 ：雞蛋2個（用鑷子在一端輕輕敲破一小塊蛋殼，用吸管從蛋殼的破孔處吸取3mL蛋清液滴入

20、若干個小燒杯中，分別向小燒杯中加入30 mL水，攪拌均勻，加以稀釋）（4）用于鑒定淀粉的實驗材料 馬鈴薯1個（制備成組織勻漿：將整個馬鈴薯去皮切小塊，研缽研碎，濾渣留漿）。2.實驗藥品（1）斐林試劑的配制甲液：質(zhì)量濃度為0.1g/ml的NaOH溶液取10 g氫氧化鈉放入有刻度的燒杯中，加水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中，配成質(zhì)量濃度為0.1 gmL的氫氧化鈉溶液，瓶口塞上膠塞，貼上標(biāo)簽，寫上試劑甲液。乙液：質(zhì)量濃度為0.05g/ml的CuSO4溶液稱取2.5g 無水CuSO4放入有刻度的燒杯中，加水至50ml，待充分溶解后倒入試劑瓶中，配成質(zhì)量濃度為0.05g/ml的CuSO4溶液，

21、瓶口塞上膠塞，貼上標(biāo)簽，寫上試劑乙液。還原糖與菲林試劑反應(yīng)的機理 還原糖的還原性能夠?qū)⒍r銅離子還原，產(chǎn)生磚紅色沉淀。 用菲林試劑鑒定可溶性還原糖一般會要求用梨子等無色或淺色的材料來進行試驗以排除干擾，在實驗的過程中會出現(xiàn)“淺藍色-棕色-磚紅色”的顏色變化過程。剛開始呈現(xiàn)藍色是滴入菲林試劑的顏色，試劑本身為藍色懸濁液。慢慢的，加熱過程中開始產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，會逐漸因為二價銅與醛基在沸水浴加熱條件下反應(yīng)而生成磚紅色的沉淀。因為反應(yīng)不會很快，磚紅色和藍色混合在一起就會變?yōu)樽厣ｋS著反應(yīng)進行，藍色的含銅離子的溶液中的銅全轉(zhuǎn)化為磚紅色的銅化合物，這時候就整體看上去顏色變成磚紅色。葡萄糖溶液與新制氫氧化銅濁

22、液還原糖與菲林試劑反應(yīng)的機理反應(yīng)生成磚紅色沉淀（2）雙縮脲試劑的配制 A液（質(zhì)量濃度為0.1g/ml的NaOH溶液）：取10 g氫氧化鈉放入有刻度的燒杯中，加水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中，配成質(zhì)量濃度為0.1 gmL的氫氧化鈉溶液，瓶口塞上膠塞，貼上標(biāo)簽，寫上試劑A。B液（質(zhì)量濃度為0.01g/ml的CuSO4溶液）：取1 g硫酸銅放入有刻度的燒杯中，加水至100 mL，待充分溶解后倒入試劑瓶中，配成質(zhì)量濃度為0.01 gmL的硫酸銅溶液(藍色)。瓶口塞上膠塞，貼上標(biāo)簽，寫上試劑B。將尿素加熱，兩分子尿素放出一分子氨而縮合成雙縮脲。雙縮脲反應(yīng)是指在堿性條件下，雙縮脲(H

23、2N-CO-NH-CO-NH2)與二價銅離子作用，生成紫紅色配合物的反應(yīng)。在肽和蛋白質(zhì)分子中具有肽鍵(-CO-NH-)，其結(jié)構(gòu)與雙縮脲類似，也能發(fā)生此反應(yīng)，生成藍紫色或紫紅色的配合物，且呈色強度在一定濃度范圍內(nèi)與肽鍵數(shù)量即與蛋白質(zhì)含量成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故常用于蛋白質(zhì)的定性或定量測定。 凡分子中含二個或二個以上酰胺基(-CO-NH2)，或與此相似的基團，如-CH2-NH2，-CS-NH2，-C(NH)NH2的任何化合物，無論這類基團直接相連，還是通過一個碳或氮原子間接相連，均可發(fā)生上述反應(yīng)，并且該反應(yīng)的干擾因素較多。NH3對此反應(yīng)具有嚴(yán)重的干擾，因為NH3與銅離子可生成深

24、藍色的銅氨配合物。應(yīng)當(dāng)注意，蛋白質(zhì)和多肽都有雙縮脲反應(yīng)，但有雙縮脲反應(yīng)的物質(zhì)不一定都是蛋白質(zhì)或多肽。（3）蘇丹溶液的配制  稱取0.05 g蘇丹干粉，溶于50 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精中，待全部溶解后再使用。關(guān)于脂肪與蘇丹III或蘇丹反應(yīng)： 蘇丹紅有、號四種，經(jīng)毒理學(xué)研究表明，蘇丹紅具有致突變性和致癌性。蘇丹(蘇丹)為一種脂肪染色劑(易溶解于酒精，不溶解于水)。蘇丹染液遇脂肪的顏色反應(yīng)為橘黃色，蘇丹染液遇脂肪的顏色反應(yīng)為紅色。其反應(yīng)式為：蘇丹系列染料不溶于水，微溶于乙醇，易溶于油脂.蘇丹在脂肪中的溶解度比在酒精中的溶解度大，當(dāng)用蘇丹的酒精溶液處理含有脂肪的生物組織時，酒精中的蘇丹進

25、入脂肪中，將脂肪染成橘黃色。（4）碘液：碘2g;碘化鉀4g;蒸餾水600mL。將碘化鉀溶于10mL蒸餾水中，將碘加入使之溶解，待藥品溶解后,加水至600mL，即成碘液。在棕色瓶中保存，否則變?yōu)闅涞馑帷５馊芤褐写嬖谝韵缕胶猓篕I + I2 KI3 (多鹵化物)； I+I2I3碘化鉀的作用在于增大碘在水中的溶解度,此時碘溶液呈棕紅色,根據(jù)以上平衡原理可以解釋為：KI 溶液相對過量, I2 溶解度增大, KI 與I2 生成棕紅色的配合物KI3。I2 與淀粉作用時,平衡向左移動,棕紅色逐漸褪去,但過剩的KI3 會混在淀粉和碘溶液中,從而干擾了溶液藍色的觀察,常看到藍色或藍紫色. 若淀粉濃度過大,與I2

26、 結(jié)合完全,平衡向左移動, KI3 多鹵化物濃度降低,棕紅色褪去,溶液藍色明顯。碘含量過高,溶解不完全,則單質(zhì)碘的黑紫色會干擾溶液的顏色,從而出現(xiàn)藍中帶褐色或深褐色。（5）蒸餾水3.實驗儀器大燒杯：50mL的一個,用于還原糖鑒定中的溫水加熱，小燒杯：25mL的5個,用于分裝梨勻漿、花生種子勻漿、浸泡過的花生種子、蛋清稀釋液、馬鈴薯勻漿、有刻度的玻璃燒杯：100mL，用于配制斐林試劑和雙縮脲試劑量筒：5mL的兩個，一個用于量取勻漿、一個用于量取試劑，50mL的一個，注意清洗膠頭滴管：90 mm的5個，分別用于蘇丹染液、體積分?jǐn)?shù)為50%的酒精溶液、蒸餾水、雙縮脲試劑B液、碘液玻璃試管：10mL 的

27、6支，3支用于實驗組，3支用于對照組試管架：木制架子，有6孔。架中附有相應(yīng)數(shù)目的小木柱。用于放置試管，有孔的可將試管豎放，以便繼續(xù)觀察反應(yīng)的進行。有柱的可將洗凈試管倒放，以便晾干。酒精燈：由燈體、燈芯管和燈帽組成，容量150mL,口徑18mm,玻璃瓶的。三腳架：高13cm、口徑11cm.石棉網(wǎng):14×14cm火柴:生活常用火柴雙面刀片：長43mm，寬22mm，厚0.1mm載玻片：長75mm，寬25mm,厚1.2-1.3mm蓋玻片:長寬各20mm普通光學(xué)顯微鏡：10*的目鏡和4*/10*/40*的物鏡毛筆：普通毛筆一只吸水紙：濕強衛(wèi)生紙試劑瓶：細口瓶、玻璃材質(zhì)、容量100mL，玻璃瓶塞

28、、橡膠瓶塞（與試劑瓶匹配）溫度計：選用水銀溫度計，可用來測量0-150以內(nèi)范圍的溫度培養(yǎng)皿：直徑為9cm,玻璃材質(zhì)五 實驗步驟(一)還原糖的檢測和觀察1、制備梨組織液。用水果刀將梨去皮并切成小塊，在研缽中充分研磨，在裝有兩層紗布的漏斗中過濾，取其濾液。（梨組織液必須臨時制備。因梨多酚氧化酶含量高，組織液很易被氧化成褐色，將產(chǎn)生的顏色掩蓋。）2、取2試管，用量筒分別量取2mL梨組織液注入試管中。3、向其中一支試管內(nèi)注入新制的1mL斐林試劑（應(yīng)將組成斐林試劑的質(zhì)量濃度為0.1g/ml的NaOH溶液（甲液）、質(zhì)量濃度為0.05g/ml的CuSO4溶液（乙液）分別配制、儲存，使用前才將甲、乙液各取0.

29、5ml等量混勻成斐林試劑，切勿將甲液、乙液分別加入梨組織樣液中進行檢測），振蕩試管。4、在大燒杯中裝入適量的水，將大燒杯放到架有三腳架、上鋪石棉網(wǎng)的酒精燈上加熱，常把溫度計插入水中（溫度計玻璃泡不能碰到杯底）測量溫度，當(dāng)水溫達到50-60是，關(guān)閉電爐，將試管放入盛有5060溫水的大燒杯中加熱約2min（最好用試管夾夾住試管上部，使試管底部不觸及燒杯底部，試管口不朝向?qū)嶒炚撸?、觀察兩支試管中出現(xiàn)的顏色變化。（二）脂肪的檢測和觀察方法一：選10粒浸泡過了3-4小時的花生，去種皮后放入研缽研磨，然后在裝有一層紗布的漏斗中過濾，得勻漿。向花生種子勻漿中滴加3滴蘇丹染液，觀察樣液染色的情況。方法二：

30、制作子葉的臨時切片，用顯微鏡觀察子葉細胞的著色情況1、取材:取一粒浸泡過3-4小時，花生種子(干種子要浸泡3-4小時，新花生的浸泡時間可縮短),去掉種皮。2、切片：用刀片在花生子葉的橫斷面上平行切下若干薄片（切片要盡可能薄些，便于觀察），放入盛有清水的培養(yǎng)皿中待用。 3、制片：從培養(yǎng)皿中選取最薄的切片，用毛筆蘸取放在載玻片中央；用滴管在花生子葉薄片上滴2-3滴蘇丹染液，染色3min（如果用蘇丹染液染色1min）；用吸水紙吸取染液，再滴加1-2滴體積分?jǐn)?shù)為50%的酒精溶液，洗去浮色；用吸水紙吸取花生子葉周圍的酒精，滴一滴蒸餾水（滴上清水可防止蓋蓋玻片時產(chǎn)生氣泡），蓋上蓋玻片，制成臨時裝片。 蘇丹

31、是弱酸性染料，易溶于體積分?jǐn)?shù)為50%酒精。洗去的是染液.染色時一般用蘇丹III或蘇丹IV染液,這些染色劑都是有顏色的,如果不洗去會影響觀察脂肪的染色情況,便無法判斷是否有脂肪被染色。同時，酒精是脂溶性溶劑，可將花生細胞中的脂肪顆粒溶解成油滴。4、觀察:先在低倍鏡下找到花生子葉最薄處移到視野中央，將物像調(diào)節(jié)清楚；轉(zhuǎn)為高倍鏡觀察。（裝片不宜久放，時間一長，油滴會溶解在50%的酒精中。）危險性評價：蘇丹，蘇丹，蘇丹已經(jīng)被國際癌癥研究協(xié)會歸到3類致癌物，對人體的危害很大。動物試驗顯示，給予大鼠4-氨基偶氮苯（蘇丹的初級代謝產(chǎn)物）104周，劑量為80-400mg/kg，大鼠肝癌發(fā)生率明顯升高。蘇丹紅IV

32、的初級代謝產(chǎn)物鄰-甲苯胺（ortho-toluidine）和鄰-氨基偶氮甲苯（ortho-aminoazotoluole）均列為二類致癌物，即對人可能致癌物。動物試驗顯示，給予大鼠150mg/kgBW鄰-甲苯胺100104周，在多器官肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤發(fā)生率增加，給予狗5mg/kgBW鄰-氨基偶氮甲苯30個月，則發(fā)生了膀胱癌。提醒學(xué)生小心操作或戴手套進行操作。（三）蛋白質(zhì)的檢測和觀察1、制備組織樣液。將黃豆浸泡12小時左右，用研缽研磨成勻漿，在裝有兩層紗布的漏斗中過濾后取其濾液。可購新鮮豆?jié){以節(jié)約實驗時間。也可用蛋清稀釋液（在小燒杯中按蛋清:蒸餾水=1:10來量取，并用玻璃棒攪勻）。蛋清應(yīng)

33、盡量稀釋，如果稀釋不夠，在實驗中蛋清粘在試管壁，與雙縮脲試劑反應(yīng)后會粘固在試管內(nèi)壁上，使反應(yīng)不容易徹底，并且試管也不易洗干凈。2、取2試管，分別加加組織樣液約2ml于試管中。3、用量筒量取雙縮脲試劑A液(質(zhì)量濃度為0.1g/ml的NaOH溶液)1ml，加入到有其中一支試管中，搖勻。4、用滴管向同一試管內(nèi)注入雙縮脲試劑B液(質(zhì)量濃度為0.01g/ml的CuSO4溶液)4滴，搖勻。 A液和B液也要分開配制，儲存。鑒定時先加A液后加B液，A、B液混裝或同時加入，會導(dǎo)致Cu2+變成Cu ( OH )2沉淀，而失效。B液不能多加，否則CuSO4的藍色會遮蓋反應(yīng)的真實顏色。5、觀察兩支試管中出現(xiàn)的顏色變化

34、。（四）淀粉的檢測和觀察1、取2試管，向其中一支試管注入2ml待測馬鈴薯勻漿（制備馬鈴薯勻漿的方法：將馬鈴薯洗凈后，用刀切碎，用研缽將其研磨成糊狀，加入少量蒸餾水，在裝有兩層紗布的漏斗中過濾后取其濾液）。2、向該試管中滴加2滴碘液，觀察兩支試管的顏色變化（碘液不要滴太多，以免影響顏色觀察）。（五）光學(xué)顯微鏡的使用1、安放 右手握住鏡臂，左手托住鏡座，使鏡體保持直立。桌面要清潔、平穩(wěn)，要選擇臨窗或光線充足的地方。單筒的一般放在左側(cè)，距離桌邊34厘米處。2、清潔 檢查顯微鏡是否有毛病，是否清潔，鏡身機械部分可用干凈軟布擦拭。透鏡要用擦鏡紙擦拭，如有膠或粘污，可用少量二甲苯清潔之。3、對光 鏡筒升至

35、距載物臺12厘米處，低倍鏡對準(zhǔn)通光孔。調(diào)節(jié)光圈和反光鏡，光線強時用平面鏡，光線弱時用凹面鏡，反光鏡要用雙手轉(zhuǎn)動。若使用的為帶有光源的顯微鏡，可省去次步驟，但需要調(diào)節(jié)光亮度的旋鈕。4、安裝標(biāo)本 將玻片放在載物臺上，注意有蓋玻片的一面一定朝上。用彈簧夾將玻片固定，轉(zhuǎn)動平臺移動器的旋鈕，使要觀察的材料對準(zhǔn)通光孔中央。5、調(diào)焦 調(diào)焦時，先旋轉(zhuǎn)粗調(diào)焦旋鈕慢慢降低鏡筒，并從側(cè)面仔細觀察，直到物鏡貼近玻片標(biāo)本，然后左眼自目鏡觀察，左手旋轉(zhuǎn)粗調(diào)焦旋鈕抬升鏡筒，直到看清標(biāo)本物像時停止，再用細調(diào)焦旋鈕回調(diào)清晰。 操作注意：不應(yīng)在高倍鏡下直接調(diào)焦；鏡筒下降時，應(yīng)從側(cè)面觀察鏡筒和標(biāo)本間的間距；要了解物距的臨界值。 若

36、使用雙筒顯微鏡，如觀察者雙眼視度有差異，可靠視度調(diào)節(jié)圈調(diào)節(jié)。另外雙筒可相對平移以適應(yīng)操作者兩眼間距。6、觀察 若使用單筒顯微鏡，兩眼自然張開，左眼觀察標(biāo)本，右眼觀察記錄及繪圖，同時左手調(diào)節(jié)焦距，使物象清晰并移動標(biāo)本視野。右手記錄、繪圖。 鏡檢時應(yīng)將標(biāo)本按一定方向移動視野，直至整個標(biāo)本觀察完畢，以便不漏檢，不重復(fù)。 光強的調(diào)節(jié)：一般情況下，染色標(biāo)本光線宜強，無色或未染色標(biāo)本光線宜弱；低倍鏡觀察光線宜弱，高倍鏡觀察光線宜強。除調(diào)節(jié)反光鏡或光源燈以外，虹彩光圈的調(diào)節(jié)也十分重要。六替代的實驗方法本實驗的原料是勻漿的蘋果、 梨、 馬鈴薯、 花生種子、 大豆，鮮肝提取液和浸泡的花生種子。實驗材料多，準(zhǔn)備時

37、間長，尤其是花生種子需要提前浸泡34h， 浸泡時間太長， 則組織太軟，切下的薄片不易成形；浸泡時間短，則組織太硬，切片厚，不易觀察。一節(jié)課很難完成實驗， 會導(dǎo)致學(xué)生匆忙實驗， 只求驗證結(jié)果不求思維， 不利于學(xué)生創(chuàng)新精神和探究能力的培養(yǎng)。 針對這種情況應(yīng)選擇便于就地取材的實驗材料牛奶來驗證， 牛奶中含有蛋白質(zhì)、 糖類、 脂肪， 這樣實驗起來方便， 節(jié)省時間。具體的探究過程是： 材料為超市賣的純牛奶， 對比材料有葡萄糖溶液、 花生油、 雞蛋清溶液， 這三個材料不用制取而且方便取材。實驗過程如下。（一）、 驗證牛奶中含有還原糖1、取1支試管，向試管注入 2mL 的牛奶（用量筒量?。?、然后加入現(xiàn)配

38、現(xiàn)用的1 mL 斐林試劑， 搖勻后用酒精燈加熱， 觀察顏色的變化。通過對比實驗發(fā)現(xiàn)：1、用加熱的方法比溫水加熱的方法更省力省時， 而且可以看到顏色漸變的過程是藍綠色棕色磚紅色；2、在未加熱前牛奶滴入1mL斐林試劑搖勻后呈現(xiàn)藍紫色，有的學(xué)生提出這樣能不能說明牛奶中含有蛋白質(zhì)， 經(jīng)過討論和分析后認(rèn)為不能說明， 因為藍紫色的出現(xiàn)可能是 Cu（OH）2 的藍色加上少部分蛋白質(zhì)反應(yīng)生成的紫色混合而成藍紫色。結(jié)論： 牛奶加入斐林試劑后呈現(xiàn)磚紅色沉淀，說明牛奶中含有糖類。（二）、 驗證牛奶中含有脂肪1、取 2個試管， 一個試管注入2mL的花生油， 另一個試管注入2mL的牛奶。 2、然后分別加入3 滴蘇丹染液

39、， 觀察樣液被染色的情況。 （為了更好的顯示顏色的對比， 實驗多選了預(yù)先準(zhǔn)備好的花生漿的染色作對照。 ）通過實驗中顏色的對比發(fā)現(xiàn)： 蘇丹染液滴入到花生油中會呈現(xiàn)明顯的橘黃色， 但是滴入到花生漿和牛奶中都呈現(xiàn)淡粉色， 學(xué)生對此提出了疑問， 為什么牛奶和花生漿染色后不是橘黃色？經(jīng)過分析和討論認(rèn)為， 花生漿和牛奶中脂肪的純度遠不如花生油的脂肪的純度， 還有花生漿和牛奶都為白色液體， 對染色效果有影響， 這兩點原因?qū)е铝说凵某霈F(xiàn)。結(jié)論： 牛奶被蘇丹染液染成粉色， 說明牛奶中含有脂肪。（三）、 驗證牛奶中含有蛋白質(zhì)1、取2 個試管， 一個試管注入2mL的雞蛋清溶液（蛋清:10水=1:10）， 另一個

40、試管注入2mL 的牛奶。 2、然后向兩只試管分別加入雙縮脲試劑A 液1mL 搖勻后，再注入雙縮脲試劑B 液 4 滴， 搖勻后觀察顏色變化。通過實驗中顏色的對比發(fā)現(xiàn)，如果按著牛奶： 試劑=1： 1 或1： 2的比例混合， 紫色更明顯。結(jié)論： 雙縮脲試劑使牛奶呈現(xiàn)紫色， 說明牛奶中含有蛋白質(zhì)。四、探究性實驗新舊教材中都有檢測生物組織中的糖類、 脂肪和蛋白質(zhì)實驗， 但是在驗證生物組織中的糖類這個實驗， 新教材是要求把試管放入盛有5065溫水的大燒杯中加熱約2 min,而舊教材中則是要求沸水加熱2 分鐘， 針對教材要求的不同， 可以設(shè)計一個對比實驗進行對比。說明： 取5個試管， 每個試管各取2mL的蘋

41、果汁加2mL的斐林試劑， 搖勻后， 進行如下的試驗。結(jié)論： 通過實驗證明了用斐林試劑驗證還原糖時， 加熱只是為了讓實驗反應(yīng)的更快些， 而不是必要條件， 室溫下靜置仍可以使果汁變成磚紅色， 只是時間過長。本實驗替代方案中牛奶確實可以代替其它材料， 達到了省時省力的目的，但實驗要講求全面性，建議可以當(dāng)成演示實驗去做。教材中的實驗材料雖復(fù)雜， 但更能體現(xiàn)探究性的特點， 從培養(yǎng)學(xué)生興趣和探究能力的角度考慮， 本方案可以在課余的時間去完成。實驗操作改進（一）、生物組織中脂肪鑒定實驗操作的改進從實驗成功應(yīng)注意的問題中看出, 實驗材料浸泡時間及染色時間等容易控制, 操作中最難的是如何切出理想的薄片。 若按教

42、材方法做徒手切片, 一是學(xué)生操作不熟練, 二是學(xué)生有畏懼心理, 造成切下的材料較厚且不均勻, 不能滿足實驗的要求。 針對徒手切片難的問題, 實驗教學(xué)中作了如下改進: 將浸泡的花生種子去掉種皮, 用刀片將花生子葉削去一層, 形成平面, 取干凈的載玻片, 在載玻片中央, 適當(dāng)用力讓花生子葉的平面與載玻片之間進行摩擦, 使花生組織均勻涂抹在載玻片上, 進行染色、制片觀察。（二）、生物組織中還原糖鑒定實驗操作的改進斐林試劑的制?。?取小試管一支,向其里面滴2到3 滴10的硫酸銅溶液,再向其里面逐滴加入10的氫氧化鈉溶液,稍微振蕩,使其試管里面的藍色的氫化銅沉淀不再產(chǎn)生為止，氫氧化鈉稍微過量,這時的試管

43、里藍色的氫氧化銅呈果膠凍態(tài) 此時斐林試劑即配制而成。實驗時斐林和還原糖的組成樣液 ,分別一分為二,各自備份一份,向其中盛有一份斐林試劑的試管中加人約同樣體積的組織樣液 ,振蕩后 ,直接在酒精燈上加熱直到該試管里的混合液剛產(chǎn)生磚紅色即土紅色沉淀物為止。（三）、生物組織中蛋白質(zhì)定實驗操作的改進雙縮脲試劑的制備：取中等試管一支 ,向其里面滴 1到2滴的硫酸銅溶液,再向其里面加人約2到4滴的10氫氧化鈉溶液,邊加邊振蕩,使其試管里的氫氧化銅沉淀全部溶解為止。此時雙縮脲試劑配制而成（將其一分為二 ,備份一份）。向其中盛有一份雙縮脲試劑的試管中加入蛋白質(zhì)的組織樣液振蕩即可。七、注意事項1.雙縮脲試劑（A液

44、：0.1g/ml的NAOH；B液：0.01g/ml的CuSO4）先加A液1mL，再加B液4滴。B液要求量適中，否則多余的B液將會與A液發(fā)生反應(yīng)生成Cu（OH）2顯色而遮蓋原有的顏色。 2. 鑒定前，留出一部分組織樣液，以便對比。 3.用于蛋白質(zhì)鑒定的蛋清必須稀釋，以免實驗后粘住試管壁，不易洗刷。 4.由于菲林試劑中的CuSO4和NaOH會反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致試劑失效，所以必須現(xiàn)配現(xiàn)用，而且甲乙液必須等量混勻后再注入。 5.在使用顯微鏡觀察花生子葉組織中的脂肪粒時，成功的關(guān)鍵是花生子葉切片要切得夠薄，否則實驗效果很差。此外還可用壓片法，因為它不需要材料切的很薄，很容易將細胞分開。其步驟如下：用刀片

45、切取花生子葉一小片放在載玻片上蓋上另一載玻片，用鑷子頭部在相應(yīng)部位輕輕敲動，使花生組織分散 滴1 2 滴蘇丹 進行染色35 min用吸水紙吸去多余的染色劑用體積分?jǐn)?shù)為50%的酒精洗去浮色滴1 滴清水蓋上蓋玻片顯微鏡觀察。 6.教材中還原糖脂肪蛋白質(zhì)淀粉的檢測順序并不合理。其中脂肪的檢測需要制作徒手切片并鏡檢，難度大耗時長，應(yīng)該后置。因此實驗順序可以調(diào)整為還原糖蛋白質(zhì)脂肪， 而淀粉的檢測可以安排在對脂肪進行染色時同步進行。 7.由于本實驗中需要檢測的物質(zhì)種類多， 教師在講解檢測原理、方法和注意事項等所花費的時間較多，因此容易導(dǎo)致學(xué)生操作時間不足，無法完成規(guī)定檢測項目。對此， 教師必須強調(diào)課前要充

46、分預(yù)習(xí)，要求學(xué)生自主學(xué)習(xí)實驗原理，并以關(guān)鍵詞和箭頭的形式畫出各種物質(zhì)的檢測步驟。這樣不但節(jié)省教師講解的時間，而且學(xué)生操作時心中有數(shù)，保證實驗的順利進行。 8.IARC將蘇丹紅III列為三類致癌物，但將其初級代謝產(chǎn)物4-氨基偶氮苯（4-aminoazobenzene）列為二類致癌物，即對人可能致癌物。此外，在制作化生子葉臨時切片時，學(xué)生操作不當(dāng)很容易切傷手，因此老師必須強調(diào)實驗試劑的安全性和操作的規(guī)范性。八、思考題1蛋白質(zhì)雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)的原理是什么？答：雙縮脲是由兩分子尿素縮合而成的化合物，將尿素加熱到180度，則兩分子尿素縮合成一分子雙縮脲，并放出一分子氨。雙縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅

47、反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中含有很多和雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應(yīng)，形成紅紫色絡(luò)合物。2蘇丹染液，染色3min；再滴加1-2滴體積分?jǐn)?shù)為50%的酒精溶液，洗去浮色，為什么要用酒精洗去浮色？ 答：酒精可以溶解蘇丹染料染料，蘇丹是有顏色的，如果不洗浮色，那看上去只能是一片，而區(qū)分不出來，在給脂肪染色后為了不干擾實驗現(xiàn)象，就要洗去細胞表面的蘇丹（即浮色），我們用顯微鏡觀察到的橙黃色是脂肪被蘇丹染色后的顏色，它不會被洗去的。3. 雙縮脲試劑A和雙縮脲試劑B的用量及加入的順序可以改變嗎？答：加入的順序不可以改變，因為在雙縮脲反應(yīng)中，先加CuSO4溶液后加NaOH溶液，產(chǎn)生的Cu(OH)2的藍色會掩蓋紫色反應(yīng)。雙