分子生物學(xué)：第七章 蛋白質(zhì)變異效應(yīng)與短肽生物學(xué)效應(yīng)

1、第七章 蛋白質(zhì)變異效應(yīng)與短肽生物學(xué)效應(yīng) 當(dāng)組成蛋白質(zhì)的氨基酸發(fā)生不必要的修飾或改變，以及蛋白質(zhì)空間折疊發(fā)生錯誤，就會引起蛋白質(zhì)變異，引發(fā)生物體的性狀改變或是產(chǎn)生一些病理反應(yīng)。短肽在細胞功能的調(diào)控方面，有著一些重要的作用。 第一節(jié) 氨基酸突變引起的變異效應(yīng) 氨基酸發(fā)生突變將導(dǎo)致蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的變化，而一級結(jié)構(gòu)的變化往往導(dǎo)致蛋白質(zhì)生物功能的改變。 線粒體膜蛋白氨基酸突變引起一些疾病 人類有很多疾病諸如嗜鉻細胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤和李氏癥等均與線粒體復(fù)合物II的翻譯提前終止或氨基酸突變相關(guān)，這些疾病多表現(xiàn)為氧自由基引起的神經(jīng)性紊亂，而氧自由基的產(chǎn)生與電子在線粒體復(fù)合物II中傳遞中的泄漏有關(guān)。通過線粒體復(fù)合

2、物II的結(jié)構(gòu)，對已知的與人類疾病相關(guān)的該復(fù)合物的突變位點進行了精確定位，發(fā)現(xiàn)這些突變位點均位于電子傳遞體或醌結(jié)合位點的周圍，它們的突變或影響了電子傳遞體的結(jié)合，或影響了醌的結(jié)合，從而導(dǎo)致電子傳遞的中斷，逃逸到線粒體基質(zhì)中或線粒體內(nèi)膜中，產(chǎn)生大量氧自由基進而導(dǎo)致腫瘤。 線粒體呼吸鏈膜蛋白復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu) HIV-1亞型膜蛋白V3環(huán)的氨基酸變異引起的效應(yīng) 不同HIV-1亞型膜蛋白V3環(huán)的氨基酸序列特征及變異特點，病毒V3頂端的四肽特征主要為: AE亞型GPGQ 48% 、B亞型GPGR 36%、其他形式16% 。還發(fā)現(xiàn)DQDR、DQGQ等少見V3環(huán)頂端四肽組成形式。V3環(huán)發(fā)生與SI表型有關(guān)的氨基酸

3、突變形式高達80%。 禽流感病毒抗原變異產(chǎn)生的效應(yīng) 流感病毒的RNA復(fù)制酶缺乏校正閱讀能力,編碼HA和NA蛋白質(zhì)的基因非同義替換的積累，使其基因容易發(fā)生突變而發(fā)生抗原漂移。 A型流感病毒還是分節(jié)段、單股負鏈的RNA病毒,有8個基因片段。當(dāng)2個或2個以上的不同病毒粒子同時感染1個宿主細胞時,在病毒的增殖過程中,不同病毒粒子的8個基因組片段可以隨機相互交換,從而發(fā)生核酸片段水平上的重新組合,理論上通過基因片段的重排有可能產(chǎn)生256種遺傳不同的子代病毒。 HA的受體結(jié)合位點變異引起流感病毒與細胞受體的親和力改變切割位點附近的氨基酸變異引起病毒的毒力改變 HA切割位點附近的潛在糖基化位點變異也引起毒力

4、改變 第二節(jié) 氨基酸異常修飾引起的變異效應(yīng) 不同的修飾作用影響著蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、定位、功能和轉(zhuǎn)換。通常氨基酸的修飾作用有糖基化、磷酸化、硫酸化、?；⒍蜴I的形成、羧基化、羥基化等等。 如果氨基酸修飾發(fā)生異常，會引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。磷酸化可以使酶活化或失活、改變蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用和連接、改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、引起蛋白質(zhì)降解等功能。 舉例：tau蛋白異常修飾引起的效應(yīng) tau蛋白是一種低分子量含磷糖蛋白，分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，與神經(jīng)軸突內(nèi)的微管結(jié)合。正常功能是誘導(dǎo)和促進管蛋白和微管的組裝，防止微管解聚、維持微管功能的穩(wěn)定，參與維持細胞形態(tài)、信息傳遞、細胞分裂等重要生物學(xué)過程。當(dāng)tau蛋白發(fā)生高度

5、磷酸化、異常糖基化、異常截斷作用以及泛素蛋白化時，tau蛋白就失去對微管的穩(wěn)定作用，神經(jīng)纖維退化，功能喪失，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。 第三節(jié) 錯誤折疊蛋白質(zhì)引起的變異效應(yīng) 被細胞防御機制降解，導(dǎo)致功能缺失；發(fā)生錯誤定位，導(dǎo)致細胞功能紊亂；錯誤折疊蛋白質(zhì)相互聚集形成淀粉樣沉積物。 錯誤折疊蛋白質(zhì)通常產(chǎn)生三種效應(yīng)：原核細胞中質(zhì)量控制的“Triage Model”真核細胞中翻譯后質(zhì)量控制的“Triage Model”朊蛋白變異引起的效應(yīng) 朊蛋白的結(jié)構(gòu)特點 朊病毒蛋白質(zhì)（Prion Protein,PrP）是一種只含蛋白質(zhì)而不含有核酸的蛋白侵染顆粒，分子量在2.7萬3萬之間，有兩種構(gòu)象：細胞型（正常

6、型PrPc）和搔癢型（致病型PrPsc）。 PrPc的結(jié)構(gòu) PrPc(左)和PrPsc(右)的121230位的三級結(jié)構(gòu)朊病毒引起的一些疾病目前發(fā)現(xiàn)的疾病包括：羊搔癢癥、大耳鹿慢性消耗病(CWD)、牛海綿腦病(BSE)即瘋牛病、貓的海綿狀腦病(FSE)和傳染性雪貂白質(zhì)腦病(TME)等發(fā)生在動物體內(nèi)的疾病，以及人的朊病毒?。赫痤澆』蚍Q庫魯病(Kuru)、克雅氏綜合癥(CJD)或稱為早老性癡呆、吉斯特曼綜合癥（GSS）以及致死性家族失眠癥（FFI）。 第四節(jié) 蛋白質(zhì)序列缺失引起的效應(yīng) 當(dāng)運動神經(jīng)元遭受到諸如缺血、中風(fēng)等沉重“打擊”時，“運動神經(jīng)元存活蛋白” （SMN蛋白）就會發(fā)生突變，裂解成為兩部分

7、，其中的一個片段便能夠加速神經(jīng)元細胞的調(diào)亡。 第五節(jié) 未折疊蛋白應(yīng)答引起的效應(yīng) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可分為3種類型:(1) 未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蓄積引發(fā)的未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)(UPR)；(2) 正確折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度蓄積激活細胞核因子B(NF-B)引發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度負荷反應(yīng)(ER-overload response,EOR)；(3) 膽固醇缺乏引發(fā)的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白質(zhì)(sterol regulatory element binding protein,SREBP)通路調(diào)節(jié)的反應(yīng)。 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的機制第六節(jié) 短肽的效應(yīng) 短肽的來源分成二類，或是由2 個10個氨基酸通過蛋白質(zhì)合成組合而成的肽

8、，或者是由蛋白質(zhì)降解到2 個10 個氨基酸組成的肽，也稱之為小肽，寡肽。無論來源是什么，它們在細胞功能的調(diào)控方面，有著一些重要的作用。非核糖體合成的寡肽，以及環(huán)肽這些特殊的類型，豐富了分子生物學(xué)的知識內(nèi)涵。谷胱甘肽谷胱甘肽( Glutat hione , GSH) 是哺乳動物細胞中重要的非蛋白硫氫化合物,它具有許多重要的生理功能。其巰基在對內(nèi)源性和外源性化合物的排毒和抗氧化過程中起著非常重要的作用,從而維持細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)。 天然活性肽 目前，人體內(nèi)存在的活性肽有如下幾類: (1) 下丘腦多肽激素:包括嗎啡肽、內(nèi)啡肽等；(2) 人體多肽激素:胰島素、降鈣素等； (3) 神經(jīng)肽:如腦啡肽等；

9、 (4) 多肽生長因子:神經(jīng)生長因子、表皮生長因子等； (5) 心血管活性肽:血管緊張素、內(nèi)皮素等；(6) 免疫調(diào)節(jié)因子:白細胞介素、干擾素等；(7) 組織激肽:胸腺肽、腸肽等。RGD肽目前，人們對RGD肽的研究最多，也最深入。除FN外，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)LN、纖維蛋白、玻璃粘連蛋白(vitronectin,VN)、Von willebrand factor (VWF)、膠原、血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin, Tbn)以及一些生長因子也含有RGD序列。識別RGD序列的整合素有31、51、b/3等。1986年，Humphries等首次報道了含RGD肽甘氨酸精氨酸甘氨酸天冬氨酸絲氨酸(GRGD

10、S)能在體外抑制黑色素瘤(B16-F10)細胞與FN的粘附，在體內(nèi)減少B16-F10實驗性肺轉(zhuǎn)移的形成，而無RGD序列肽和R、G、D單個氨基酸則無此作用。由于RGD肽無免疫原性、無毒副作用成為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移研究的一個熱點。應(yīng)用精氨酸甘氨酸天冬氨酸絲氨酸(RGDS)后，黑色素瘤(B16F1)細胞在肝臟微血管內(nèi)運動速度加快，不易被捕獲。RGDS在體外能明顯抑制結(jié)腸癌(CT26，HCT8)細胞與血小板的粘附。GRGDS在500g*ml-1的濃度下能抑制骨肉瘤(Sao-2)細胞對血小板的聚集。血管生成對腫瘤轉(zhuǎn)移灶、原發(fā)灶的生長都很重要，靜注含RGD序列肽可干擾腫瘤血管生成，腫瘤灶生長緩慢，其機理為阻斷了

11、血管內(nèi)皮細胞表面整合素v3與ECM的聯(lián)系，血管內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡。由于RGD肽在體內(nèi)受酶的破壞以及經(jīng)腎臟排出，它在血漿中的半衰期極短，為此人們進行了不少研究，合成了多種結(jié)構(gòu)的RGD肽。RGD環(huán)肽Kumagai等人的研究認為，RGD環(huán)肽與線狀RGD肽相比，抑制黑色素瘤(B16-F10)細胞與FN粘附的作用強10倍，對黑色素瘤細胞與VN粘附的抑制作用更為明顯。不同環(huán)肽的活性順序為環(huán)GRGDSPA環(huán)GRGD環(huán)RGDS，環(huán)GRGDSP環(huán)GRGDS環(huán)RGDSP、環(huán)RGDPSPA。環(huán)GRGDSPA能在體內(nèi)明顯減少黑色素瘤(B16-FE7)肺轉(zhuǎn)移克隆的形成。RGD環(huán)肽作用強，原因可能是RGD環(huán)肽的構(gòu)象與RGD

12、環(huán)肽不同。RGD重復(fù)序列肽含RGD重復(fù)序列的多肽，在體外能明顯抑制黑色素瘤細胞的侵襲、遷移，而非重復(fù)的RGD肽作用較弱；在體內(nèi)抑制黑色素瘤的自發(fā)性和實驗性轉(zhuǎn)移的形成，作用較非重復(fù)的RGD肽強，且這種增強作用與RGD序列的重復(fù)次數(shù)有關(guān)，重復(fù)次數(shù)越多、抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用越強。RGD重復(fù)序列肽抑腫瘤轉(zhuǎn)移作用增強的原因可能是，(1)大分子肽在體內(nèi)經(jīng)腎臟排除慢；(2) RGD重復(fù)序列肽有較多的與細胞結(jié)合位點，能更有效地抑制血小板的聚集，抑制腫瘤細胞、血管內(nèi)皮細胞與ECM的結(jié)合。RGD肽綴合物Kawasaki等將多聚(乙烯乙二醇)與RGD、RGDS連接后用于B16-BL6在C57BL16鼠的實驗性肺轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)

13、RGD形成綴合物后抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用明顯增強，含RGD 100g的RGD綴合物作用與100g RGD相近。Maeda等人的研究結(jié)果亦發(fā)現(xiàn)RGD形成綴合物后在體內(nèi)存留時間延長，抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用增強。穿膜肽細胞穿膜肽是一類能攜帶大分子物質(zhì)進入細胞的短肽,其穿膜能力不依賴經(jīng)典的胞吞作用.經(jīng)過對天然存在的細胞穿膜肽的生物化學(xué)性質(zhì)研究,已經(jīng)逐漸掌握了細胞穿膜肽的一些共有特性,這類物質(zhì)均為帶有正電荷的長短不等的多肽片段,其中富含精氨酸發(fā)現(xiàn)了一類蛋白結(jié)構(gòu)域, 諸如:HIV-1 Tat (4860) 、ANTP (4358) 、VB22 (267300) 等,具有介導(dǎo)異源蛋白、寡聚核酸、金屬螯合物等極性大分子直接透

14、過細胞膜進入胞漿和核內(nèi)的功能,國內(nèi)有學(xué)者將其譯為蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域(PTD ,protein t ransduction domain)。為理解方便,我們將這一蛋白結(jié)構(gòu)域譯為穿膜肽(MPP ,membranepermeable peptide) 。 穿膜肽的結(jié)構(gòu)特點這些天然的或人工合成的多肽具有水溶性、低裂解性并通過非吞噬作用進入各種細胞膜，稱之為穿膜肽（penetratin, 也有很多文獻寫作Trojan peptide）。 這些多肽具有水溶性、低裂解性并通過非吞噬作用進入各種細胞膜，稱之為穿膜肽。穿膜肽是由16個氨基酸組成，其中有7個殘基為陽性基團，有兩個Trp殘基。穿膜肽的二級結(jié)構(gòu)并非原先的螺旋

15、結(jié)構(gòu)，而是隨周圍的環(huán)境變化而變化的。當(dāng)有帶電的脂質(zhì)體存在時，多肽則以折疊為主。穿肽膜的機制目前并不十分清楚，不同的穿肽膜的穿膜機制方面可能相差很遠。它可能是通過多肽上的2個Trp殘基及其他帶電殘基與細胞膜脂基質(zhì)的相互作用而引發(fā)的。穿膜肽的二級結(jié)構(gòu)在穿膜過程中起什么作用現(xiàn)在還不清楚，但是它一直被認為主要是在穿膜過程中與生物膜脂雙層相互作用。 穿膜肽細胞膜親和性高、穿膜速度快、可迅速被降解，最重要的是對細胞膜沒有破壞性。將它們作為細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運工具，應(yīng)用于細胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運、臨床藥效評價等領(lǐng)域，具有誘人的前景。研究發(fā)現(xiàn)穿膜肽可以雙向穿越細胞膜。它還可以介導(dǎo)如DNA、多胺類，甚至比自身分子量大很多倍的寡聚核苷酸進入細胞內(nèi)。值得一提的是，穿膜時，分子是作為一個整體插入，而不需要解折疊。該分子完全可以作為一種全新的載體，它不需要能量，可以掛載的分子的類型多，分子量大。穿膜機制 有很