生物制藥(工藝)學(xué)課件：第十三章 核酸類(lèi)藥物

1、第十三章第三節(jié) 核酸類(lèi)藥物 核酸類(lèi)藥物概況 多種疾病在某種程度上是缺乏或多產(chǎn)生某種蛋白引起的，因此通過(guò)蛋白或多肽類(lèi)藥物可解決部分問(wèn)題。利用核酸作為藥物可以達(dá)到常規(guī)藥物無(wú)法達(dá)到的效果。（第一個(gè)核酸藥物反義核酸藥物Formivisen) 根據(jù)核酸藥物的本質(zhì)和作用方式，可將其為四大類(lèi)： 反義類(lèi)核酸藥物 核酸免疫 RNA干擾 基因治療反義核酸藥物 概念：反義核酸是一些人工合成的單鏈反義分子，可以通 過(guò)堿基互補(bǔ)原則與被感染細(xì)胞內(nèi)部的某個(gè)靶標(biāo)mRNA或 DNA結(jié)合，抑制或封閉該基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，或切割 mRNA使其喪失功能。反義核酸參與基因表達(dá)在原核生物中是一種普遍的現(xiàn)象。意義：反義核酸對(duì)基因表達(dá)的有效調(diào)

2、控給人類(lèi)疾病治療帶來(lái)了新的希望，將反義核酸作為一種生化藥物，有希望在征服人類(lèi)的大敵如癌癥、病毒類(lèi)引起的疾病、艾滋病和遺傳性疾病中發(fā)揮重要作用。分類(lèi)：根據(jù)組成和特點(diǎn)可將其分為反義RNA（antisense RNA)、反義DNA（ antisense DNA）、肽核酸（peptide nucleis acid, PNA）和核酶（ribozyme）。核酸疫苗核酸疫苗的工作方式： 核酸疫苗（nucleic acid vaccine)又稱(chēng)基因疫苗（gene caccine)或DNA疫苗（DNA vaccine），是利用基因重組技術(shù)將編碼抗原的基因裝入載體，然后直接導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)機(jī)體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成

3、蛋白，產(chǎn)生的蛋白作為抗原誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，即通過(guò)細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，從而達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。免疫載體： 核酸疫苗是通過(guò)疫苗載體將抗原編碼基因?qū)霗C(jī)體而激發(fā)免疫的。 進(jìn)入體內(nèi)的核酸必須表達(dá)出相應(yīng)的蛋白抗原才能發(fā)揮疫苗的作用。為此，疫苗載體起著重要的作用。典型的核酸疫苗載體有pcDNA3.1，以及在此基礎(chǔ)上去掉病毒復(fù)制單位并用雙宿主可用的卡那霉素抗性基因替換氨芐青霉素抗性基因和新霉素抗性基因的改建載體Pvax1.核酸疫苗的優(yōu)點(diǎn)： 第一，安全性好，沒(méi)有感染的危險(xiǎn)； 第二，免疫效果好，核酸疫苗能在自身細(xì)胞中產(chǎn)生與自然 抗原接近的外源性蛋白，能誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)似自然抗原 的免疫應(yīng)答； 第

4、三，制備簡(jiǎn)單，只需對(duì)編碼抗原的基因進(jìn)行免疫克隆， 不需在體外表達(dá)和純化蛋白質(zhì)； 第四，核酸疫苗的本質(zhì)是核酸分子，因而不同于蛋白質(zhì)和 活疫苗，可以在室溫條件下保存，不存在疫苗的冷 藏和低溫運(yùn)輸問(wèn)題，從而保證DNA疫苗的高效接種 率； 第五，免疫應(yīng)答持久，外源基因的不斷表達(dá)可持續(xù)提供抗 原。RNA干擾 RNA干擾現(xiàn)象 RNA干擾（RNA interference,RNAi）是指對(duì)應(yīng)于某種Mrna的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA（ds RNA）分子使mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致其不能表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post transcriptional gene silencing,PTGS)現(xiàn)象。

5、 RNAi發(fā)揮作用的過(guò)程可分為兩個(gè)階段： 起始階段：雙鏈RNA分子進(jìn)入細(xì)胞后被Dicer的核酸酶切割為2123個(gè)核苷酸長(zhǎng)的小分子干擾RNA片段（small interfering RNA，siRNA).然后雙鏈siRNA與核酸酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（ RNA-induced silencing cimplex,RISC) 效應(yīng)階段: siRNA打開(kāi)雙鏈從而激活RISC，激活的RISC通過(guò)堿基配對(duì)與對(duì)應(yīng)的mRNA結(jié)合，并在距離siRNA3端12個(gè)堿基的位置切割mRNA。同時(shí)，siRNA可作為引物并以mRNA 為模板合成新的ds RNA。 RNA干擾的應(yīng)用基因治療基因治療的思想 基因治療（

6、gene therapy)是將目的基因放進(jìn)特定載體中導(dǎo)入靶細(xì)胞或組織，通過(guò)替換或補(bǔ)償引起疾病的基因，或者關(guān)閉或抑制異常表達(dá)的基因來(lái)克服疾病的治療方法。 基因治療策略：其一，通過(guò)導(dǎo)入正?；虻姆椒▉?lái)修復(fù)缺陷基因的功能或者加強(qiáng)某些原有基因的功能。其二，通過(guò)導(dǎo)入抗原、抗體或細(xì)胞因子的編碼基因到患者體內(nèi)，改變患者免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。基因治療的實(shí)踐基因治療的工作原理 目的基因?qū)肴梭w的方法 腺病毒載體重組人p53腺病毒基因治療藥物第一節(jié)、核酸類(lèi)物質(zhì)的分離提取及其發(fā)酵生產(chǎn)一、RNA 與DNA的提取與制備（一）RNA的提取與制備1、工業(yè)用RNA的提取（1）RNA及其工業(yè)來(lái)源 工業(yè)用RNA主要

7、是從微生物中提取的，如啤酒酵母、紙漿酵母、石油酵母、面包酵母、白地霉、多種抗菌素的菌絲體等； 不同微生物中RNA含量不盡相同，同種菌種在不同條件下，其RNA含量也不盡相同。（2）高RNA含量酵母菌株的篩選 主要有兩種篩選方法：自然篩選法和誘變篩選法（3）用工業(yè)廢水培養(yǎng)高含量RNA酵母 如用味精生產(chǎn)廢水就可以培養(yǎng)高RNA含量酵母菌種，然后制備RNA。（4）RNA提取實(shí)例 一般來(lái)說(shuō)，啤酒酵母是提取RNA很好的資源。提取過(guò)程（二）DNA的提取與制備1、工業(yè)用DNA的提取提取過(guò)程2、具有生物活性DNA的制備提取過(guò)程二、用酶解法、發(fā)酵法和半合成法制備核苷酸（一）酶解法及堿水解法制備核苷酸 1、酶解法制備

8、脫氧核苷酸制備過(guò)程2、酶解法制備核糖核苷酸3、雙酶法生產(chǎn)肌苷酸和鳥(niǎo)苷酸（I+G）4、菌體自溶法生產(chǎn)核苷酸（1）工藝流程（2）自溶工藝概要（pg443）5、堿水解法生產(chǎn)2,3-混合核苷酸（pg445）（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸1、發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸（IMP）（pg445）:肌苷酸鈉是增鮮劑發(fā)酵菌株：產(chǎn)氨短桿菌影響因素：培養(yǎng)基中的腺嘌呤（ATP）等嘌呤堿基 培養(yǎng)基中的Mn2+影響解決辦法：篩選腺嘌呤等缺陷型和Mn2+不敏感性菌株結(jié)果：篩選到的菌株的細(xì)胞膜的透性增加，不僅可以使胞內(nèi)合成的肌苷酸透過(guò)細(xì)胞膜到培養(yǎng)基中，而且可以使嘌呤核苷酸補(bǔ)救合成所需要的幾個(gè)酶和中間體核糖-5-磷酸也透過(guò)細(xì)胞膜，在胞外就可以大

9、量合成肌苷酸。2、發(fā)酵法生產(chǎn)黃苷酸（XMP）及酶法轉(zhuǎn)化成鳥(niǎo)苷酸：（pg447）（三）半合成法制備核苷酸（pg447）三、核苷的制備 核苷是多種核苷類(lèi)藥物的原料；許多核苷衍生物，在治療病毒性疾病、提高機(jī)體免疫功能、改善生物代謝等方面有重要功能。如：第一個(gè)抗愛(ài)滋病藥物AZT就是胸苷的衍生物疊氮胸苷；三氮唑核苷可以抗10多種RNA和DNA病毒，是肌苷、鳥(niǎo)苷的改造物；阿糖腺苷對(duì)腦膜炎、乙肝療效顯著，它是腺苷酸衍生物；阿糖胞苷、環(huán)胞苷主要用于各類(lèi)急性白血病、病毒性角膜炎、結(jié)膜炎的治療；它是胞苷的衍生物；5-氟尿嘧啶脫氧核苷及5-脫氧-5-氟尿嘧啶核苷可以治療消化道腫瘤及肝癌，是由尿苷合成的。 有關(guān)核苷類(lèi)

10、藥物是一個(gè)研究熱點(diǎn)。目前核苷的合成方法主要有化學(xué)法和發(fā)酵法兩類(lèi)。（一）RNA化學(xué)水解答制備核苷1、核苷生產(chǎn)工藝流程2、核苷產(chǎn)品質(zhì)量 根據(jù)幾種紫外吸收值的比值來(lái)判斷，見(jiàn)p449表13.153、工藝過(guò)程 RNA經(jīng)甲酰胺化學(xué)水解，經(jīng)過(guò)上述一系列過(guò)程，即得結(jié)晶的4種核苷。（二）發(fā)酵法生產(chǎn)核苷 發(fā)酵法生產(chǎn)核苷產(chǎn)率高、周期短、容易控制、產(chǎn)量大；發(fā)酵法生產(chǎn)各種核苷的菌株有許多共同點(diǎn)：A、誘變起始菌株相同，都是枯草芽孢桿菌或短小芽孢桿菌B、均有物理或化學(xué)手段誘變?yōu)榫哂刑囟?biāo)記的誘變菌C、發(fā)酵時(shí)必須限量提供生長(zhǎng)因素、而且好氧，在特定條件下才大量產(chǎn)生核苷。發(fā)酵法生產(chǎn)核苷菌種的選育： 對(duì)于枯草桿菌而言，在其嘌呤核苷

11、酸合成途徑中，其中的一系列合成酶會(huì)受到一系列產(chǎn)物的抑制，如：PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶受AMP、ADP的強(qiáng)烈抑制；IPM脫氫酶和SAMP合成酶分別受最終產(chǎn)物GMP和AMP的反饋抑制。因此，誘變菌枯草桿菌的腺嘌呤缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中限量提供腺嘌呤時(shí)，累積肌苷；而鳥(niǎo)嘌呤缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中限量提供鳥(niǎo)嘌呤時(shí)，累積黃苷；而腺嘌呤、黃嘌呤雙缺陷型，當(dāng)培養(yǎng)基中限量腺嘌呤時(shí)就會(huì)累積腺苷。1、發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷(pg450)2、發(fā)酵法生產(chǎn)鳥(niǎo)苷和黃苷(pg451)3、發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷(pg451) 第二節(jié)、核酸類(lèi)藥物核酸類(lèi)藥物可以分為兩大類(lèi)： 天然來(lái)源的核酸類(lèi)物質(zhì)制成的藥物；屬于這類(lèi)藥物的有：肌苷、ATP、輔酶A、脫氧核苷酸、肌苷

12、酸、鳥(niǎo)三磷（GTP）、胞三磷（CTP）、尿三磷（UTP）、腺嘌呤、腺苷、5-核苷酸混合物、2、3-核苷酸混合物、輔酶I、輔酶II等。 天然結(jié)構(gòu)堿基、核苷、核苷酸的類(lèi)似物或聚合物，這類(lèi)核酸類(lèi)藥物是當(dāng)今人類(lèi)治療病毒、腫瘤、愛(ài)滋病的重要手段，也是產(chǎn)生干擾素、免疫抑制的臨床藥物。至今已經(jīng)正式在臨床上應(yīng)用的有八個(gè)核苷類(lèi)似物。一、疊氮胸苷（AZT）（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)化學(xué)名：3-疊氮-2-脫氧胸腺嘧啶核苷；用于治療愛(ài)滋病。其藥理作用是在體內(nèi)經(jīng)磷酸化后生成3-疊氮-2-脫氧胸腺嘧啶核苷酸，替代了正常的胸腺嘧啶核苷酸參與病毒DNA的合成，而含有AZT成分的DNA不能繼續(xù)復(fù)制，從而阻斷病毒增殖。（二）生產(chǎn)工藝二、阿

13、糖腺苷（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)化學(xué)名：9-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤、或腺嘌呤阿拉伯糖苷；是廣譜DNA病毒抑制劑，用于治療皰疹病毒引起的疾病、乙型肝炎等。其藥理作用是在體內(nèi)生成阿糖腺三磷，起拮抗脫氧腺三磷（dATP）作用，從而阻止了病毒DNA的復(fù)制、阻斷病毒增殖。（二）生產(chǎn)工藝1、酶-化學(xué)合成法2、化學(xué)合成法（略）三、三氮唑核苷（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)商品名：病毒唑；對(duì)DNA、RNA病毒有廣泛作用，用于治療小兒呼吸系統(tǒng)疾病、猩紅熱、流感及愛(ài)滋病等。其藥理作用是在體內(nèi)經(jīng)磷酸化后生成三氮唑核苷酸，抑制肌苷酸脫氫酶阻斷鳥(niǎo)苷酸的生物合成，DNA合成。還可以是抗腫瘤藥。（二）生產(chǎn)工藝四、阿糖胞苷（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)化學(xué)名：1-D-呋喃阿糖胞嘧啶；用于治療急、慢性粒細(xì)胞白血病、頭頸部腫瘤、惡性淋巴瘤、皰疹病毒引起的疾病等。其藥理作用是進(jìn)入體內(nèi)后轉(zhuǎn)變?yōu)榘⑻前账?，抑制DNA聚合酶，阻止胞二磷轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗醢讖亩种艱NA合成，干擾DNA病毒繁殖和腫瘤細(xì)胞增殖。（二）生產(chǎn)工藝1、以5-CMP為原料的合成2、以葡萄糖酸鈣為原料的合成路線(xiàn)五、聚肌胞苷酸（聚肌胞）（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 主要用于抗病毒、抗腫瘤、