DNA重組技術(shù)的基本工具課件

1、專題一：專題一：生物生物1的基因（的基因（目的基因目的基因） 生物生物2 獲得新性狀獲得新性狀 導(dǎo)入導(dǎo)入第一至三步驟第一至三步驟第四步驟第四步驟一、限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”1 1名稱來源：名稱來源：限制性核酸內(nèi)切酶，又稱限制酶限制性核酸內(nèi)切酶，又稱限制酶主要從主要從原核生物原核生物中分離純化。中分離純化。2 2作用特點(diǎn)：作用特點(diǎn)：識(shí)別特定核苷酸序列，使每條鏈中識(shí)別特定核苷酸序列，使每條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵斷開。斷開。1. 種類與命名 現(xiàn)在已經(jīng)從約現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約種微生物中分離出了約4000 種限制性內(nèi)切酶種限制

2、性內(nèi)切酶(限制酶限制酶)。粘質(zhì)沙雷氏桿菌粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratia marcesens練習(xí)：練習(xí)：流感嗜血桿菌的流感嗜血桿菌的d d菌株菌株( Haemophilus ( Haemophilus influenzae d )influenzae d )中先后分離到中先后分離到3 3種限制酶，則分別種限制酶，則分別命名為命名為: :Hind、Hind和和Hind命名方法命名方法作用特點(diǎn)斷開磷酸二酯鍵斷開磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 T12345 A12345HHHHHO T12345 A12345HHHHOH2O +7仔細(xì)觀察各限制酶仔細(xì)觀察各限制酶 識(shí)別的特定序列有識(shí)別的特定序列有何何

3、 特點(diǎn)？特點(diǎn)？限制酶的識(shí)別序列限制酶的識(shí)別序列限制酶所識(shí)別的序列限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是互補(bǔ)對稱，無論是6個(gè)個(gè)堿基還是堿基還是4個(gè)堿基，都個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙線，中軸線兩側(cè)的雙鏈鏈DNA上的堿基是上的堿基是反反向?qū)ΨQ重復(fù)向?qū)ΨQ重復(fù)排列的排列的 ，稱為稱為回文序列回文序列作用特點(diǎn)斷開磷酸二酯鍵斷開磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端 作用特點(diǎn)斷開磷酸二酯鍵斷開磷酸二酯鍵平末端平末端 平末端平末端1011AATTGCCTTAAG切割特定的核苷酸序列切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵的磷酸二酯鍵將將DNAD

4、NA兩條鏈的氫鍵兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈打開形成兩條單鏈切割特定的核苷酸序列切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵，形成片的磷酸二酯鍵，形成片段的段的DNA.DNA.切割磷酸二酯鍵，形成切割磷酸二酯鍵，形成單個(gè)的脫氧核苷酸。單個(gè)的脫氧核苷酸。你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么嗎？什么嗎？原核生物易受自然界外源原核生物易受自然界外源DNA的入侵，的入侵，但生物但生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。制，以防止外來病原物的侵害。限制酶限制酶就是細(xì)就是細(xì)菌的一種菌的一種防御性工具，防

5、御性工具，當(dāng)外源當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶利用限制酶將外源將外源DNA切割掉，切割掉，以保證自身的以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源割外源DNA、使之失效，使之失效，從而達(dá)到從而達(dá)到保護(hù)自身保護(hù)自身的的目的。目的。尋根問底尋根問底為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其的細(xì)胞，其DNADNA分子中分子中不具備這種限制酶不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列的識(shí)別切割序列，或者，或者通過甲基化酶將甲通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移

6、到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的種限制酶也不會(huì)使自身的DNADNA被切斷，并被切斷，并且可以防止外源且可以防止外源DNADNA的入侵。的入侵。 二、“分子縫合針” DNA連接酶1 1種類種類 ： Ecoli DNA連接酶連接酶 T4 DNA連接酶連接酶2 2作用：作用：恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間 的的。3 3作用原理：作用原理：催化磷酸二酯鍵形成催化磷酸二酯鍵形成連接酶類型兩兩DNADNA片段要具有片段要具有互補(bǔ)互補(bǔ)的黏性末端的黏

7、性末端才能拼起來才能拼起來DNADNA連接酶的縫合作用連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的可把黏性末端之間的縫隙縫隙“縫合縫合”起來起來，注意：注意：DNADNA連接酶可連接雙鏈連接酶可連接雙鏈DNADNA中的中的DNADNA單鏈缺口，單鏈缺口，但不能連接單鏈但不能連接單鏈DNADNA！DNADNA連接酶與連接酶與DNADNA聚合酶是一回事嗎？聚合酶是一回事嗎？T4 DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低DNADNA連接酶的縫合作用連接酶的縫合作用都能催化形成都能催化形成磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)都是蛋白質(zhì)不需要不需要需要需要形成完整的重形成完整的重組組DNA分子分子形成

8、形成DNA的一條的一條鏈鏈基因工程基因工程DNA復(fù)制復(fù)制DNA連接酶與連接酶與DNA聚合酶的比較聚合酶的比較只能將只能將單個(gè)核苷單個(gè)核苷酸酸連接到已有的連接到已有的DNADNA片段上，形片段上，形成磷酸二酯鍵成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵A A T T GA A T T GC CA AA AT TT TA AA AT TT TDNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶的作用聚合酶的作用返回返回限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列和切點(diǎn)是的識(shí)別序列和切點(diǎn)是GGATCC，限制，限制性內(nèi)切酶性內(nèi)切酶的識(shí)別序列和切點(diǎn)是的識(shí)別序列

9、和切點(diǎn)是GATC。在質(zhì)粒上有。在質(zhì)粒上有酶酶的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有一個(gè)酶的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有一個(gè)酶的切點(diǎn)。的切點(diǎn)。（1）請畫出質(zhì)粒被限制酶）請畫出質(zhì)粒被限制酶切割后所形成的黏性末端。切割后所形成的黏性末端。（2）請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶）請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶切割后所形成的黏性切割后所形成的黏性末端。末端。（3）在）在DNA連接酶作用下，上述兩種不同限制酶切割后形連接酶作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接？為什么？成的黏性末端能否連接？為什么？可以連接。因?yàn)橛蓛煞N不同限制酶切割后形成的黏可以連接。因?yàn)橛蓛煞N不同限制酶切割后形成的黏性末端是相同的（或

10、是可以互補(bǔ)的）性末端是相同的（或是可以互補(bǔ)的） 小試身手小試身手基因工程基本操作的四個(gè)步驟基因工程基本操作的四個(gè)步驟1 1、目的基因的獲取、目的基因的獲取2 2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3 3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4 4、目的基因的檢測與鑒定、目的基因的檢測與鑒定無切割位點(diǎn)一個(gè)切割位點(diǎn)二個(gè)切割位點(diǎn)EcoREcoREcoREcoR載體的條件載體的條件 有1多個(gè)限制酶切點(diǎn)目的是形成重組DNA分子23用切目的基因相用切目的基因相同的限制性內(nèi)切同的限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒酶切割質(zhì)粒2425目的基因目的基因26載體的條件載體的條件 有1多個(gè)限制酶切點(diǎn)載體的條件載體的條

11、件對受體細(xì)胞無害 能在能在載體的條件載體的條件具有標(biāo)記基因 1 1載體需要的條件：載體需要的條件： 有1多個(gè)限制酶切點(diǎn) 對受體細(xì)胞無害 導(dǎo)入基因能在導(dǎo)入基因能在、表達(dá)、表達(dá) 有某些標(biāo)記基因，便于篩選有某些標(biāo)記基因，便于篩選三、“分子運(yùn)輸車” 載體2 2常用運(yùn)載體：常用運(yùn)載體：細(xì)菌的質(zhì)粒細(xì)菌的質(zhì)粒噬菌體衍生物或某些動(dòng)植物病毒。噬菌體衍生物或某些動(dòng)植物病毒。有標(biāo)記基因的存有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。素的培養(yǎng)基鑒別。有切割位點(diǎn)有切割位點(diǎn)能復(fù)制并帶著能復(fù)制并帶著插入的目的基插入的目的基因一起復(fù)制因一起復(fù)制裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體（即擬核裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體（即擬核DNA）之外，并具有）之外，并具有自我自我復(fù)制能力復(fù)制能力的的很小的很小的雙鏈環(huán)狀雙鏈環(huán)狀DNA分子。分子。最常用運(yùn)載體最常用運(yùn)載體質(zhì)粒質(zhì)粒 實(shí)際上在基因?qū)嶋H上在基因工程操作中，工程操作中，真正被用作載真正被用作載體的質(zhì)粒，都體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。過人工改造的。在基因工程中，切割運(yùn)載體和在基因工程中，切割運(yùn)載體和含有目的基因的含有目的基因的DNA片段，需片段，需使用（使用（ ）同種限制酶同種