我國(guó)菲牛蛭的研究概況

1、我國(guó)菲牛蛭的研究外表【摘要】綜述了我國(guó)菲牛蛭的地理漫衍、野生資源環(huán)境、生態(tài)習(xí)性和采收季候、化學(xué)身分、生物活性身分、藥理學(xué)作用、分散純化以及菲水蛭素基因的克隆和序列測(cè)定。以為菲牛蛭可作為一種新的藥用資源加以研究。【關(guān)鍵詞】菲牛蛭化學(xué)身分藥理學(xué)作用菲牛蛭Peilbdellaanillensis，俗名金邊螞蟥，別號(hào)為馬尼拉醫(yī)蛭，附屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)Annelida，蛭綱Hirudinea，無(wú)吻蛭目ArhynhbdellidaBlanhard，醫(yī)蛭科Hirudindaehitan，牛蛭屬PeilbdellaBlanhard。牛蛭屬種有菲牛蛭PeilbdellaanillensisLessn顆粒牛蛭Peil

2、bdellagranulsa，湖北牛蛭Peilbdella1hubEiensis和Peilbdellaviridis。1968年外洋Keegan1對(duì)東南亞的菲牛蛭生存風(fēng)俗舉行不雅察。1992年Steiner2從產(chǎn)自馬尼拉的菲牛蛭中分散純化新的水蛭素,測(cè)定其原始布局和成效表白有抗凝活性。1993年Saheri3從菲牛蛭中分散出2種水蛭素變異體,測(cè)定其氨基酸序列，DNA克隆和表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物有抗凝活性。2002年譚恩光等4從廣東產(chǎn)的菲牛蛭基因組中PR擴(kuò)增出水蛭素基因,并克隆和測(cè)序。在此，本文僅對(duì)我國(guó)菲牛蛭的一些研究舉行綜述，為開(kāi)拓菲牛蛭資源提供參考。1菲牛蛭地理漫衍、野生資源環(huán)境、生態(tài)習(xí)性和采收季候

3、菲牛蛭重要漫衍在菲律賓、泰國(guó)、越南等東南亞地域及中國(guó)的東南、中部和西南部地域。由于有關(guān)我國(guó)菲牛蛭地理漫衍、野生資源環(huán)境以及生態(tài)習(xí)性和采收季候相干報(bào)道很少，因此，我們對(duì)廣西區(qū)內(nèi)具有代表性的靈川、象州、岑溪、博白、防城、隆安、田東等15個(gè)縣市的菲牛蛭品種生物學(xué)特性、資源數(shù)目漫衍、生態(tài)習(xí)性和采收季候舉行視察，共網(wǎng)絡(luò)到水蛭樣品15份。經(jīng)外表與形態(tài)特性的開(kāi)端斷定，與我國(guó)水蛭分類學(xué)專家楊潼所形貌的菲牛蛭雷同，說(shuō)明區(qū)內(nèi)漫衍的水蛭以菲牛蛭品種為主。漫衍在區(qū)內(nèi)各地的菲牛蛭，經(jīng)體重測(cè)定差異不明顯，但在數(shù)目上桂東南地域顯著多于桂西北，欽州、防城野生資源比力富厚，羅城、巴馬等地野生資源稀疏。數(shù)目漫衍的多寡與溫度、雨量

4、、濕度等天氣因素有關(guān)，切合水蛭喜溫、濕、熱的特性。通過(guò)樣品的網(wǎng)絡(luò)為優(yōu)化種苗選擇提供了富厚的物質(zhì)基矗菲牛蛭生態(tài)環(huán)境要求和生態(tài)習(xí)性：按照田野的觀察表白，菲牛蛭愛(ài)好在泥土含鐵量較高、水體呈弱酸性pH值5.57.0的環(huán)境中繁衍。在田野多創(chuàng)造于荒涼的山塘和山?jīng)_田塊或濕草地，尤其是土層深沉、土質(zhì)疏松潮濕,種種水草生長(zhǎng)茂盛,而且常常有耕牛、人運(yùn)動(dòng)，呈土畦式水體相對(duì)結(jié)實(shí)的環(huán)境中多見(jiàn)，常年耕耘的田塊和已開(kāi)拓養(yǎng)殖的山塘或大面積連體的水體中很少創(chuàng)造。菲牛蛭的采收季候：經(jīng)視察創(chuàng)造，菲牛蛭對(duì)溫度反響敏感。水溫在2530時(shí)，運(yùn)動(dòng)最活潑，生長(zhǎng)最快，也是生殖的季候。在田野當(dāng)水溫低于15時(shí)便制止運(yùn)動(dòng)，因此，每年的11月前后到次

5、年的4月前后很少創(chuàng)造有菲牛蛭在水中運(yùn)動(dòng)，這時(shí)它們都進(jìn)入泥土里越冬，這與其為冷血變溫動(dòng)物，冬季具有蟄伏習(xí)性一樣等。如許菲牛蛭的采收時(shí)間宜選擇在910月份，此時(shí)，氣溫落落，菲牛蛭生長(zhǎng)速率減慢，但仍在水中，易于捕獲。2菲牛蛭的化學(xué)身分2.1菲牛蛭中脂肪酸闡發(fā)苗美麗等5對(duì)廣西產(chǎn)菲牛蛭脂肪酸提取液舉行氣相色譜/質(zhì)譜(G/S)闡發(fā),共分散出19個(gè)峰。與尺度譜庫(kù)比擬闡發(fā),斷定了16個(gè)組分,脂肪酸的相對(duì)含量接納總離子流各色譜峰面積歸一化法定量,結(jié)果見(jiàn)表1。實(shí)行共斷定了菲牛蛭中脂肪酸的16個(gè)組分,占脂肪酸總量的97.39%,此中飽和脂肪酸占63.34%，不飽和脂肪酸占34.05%。飽和脂肪酸重要有硬脂酸、棕櫚酸

6、、肉豆蔻酸等;不飽和脂肪酸重要包羅油酸、11-二十碳烯酸等。此中含量最多的是十六烷酸，到達(dá)23.78%，其次是9-十八碳烯酸,含量為12.53%；11-二十碳烯酸含量為11.75%。菲牛蛭中所含的單不飽和脂肪酸,如9-十八碳烯酸和11-二十碳烯酸的含量高于中藥螞蟥中的含量6。表1菲牛蛭中脂肪酸的構(gòu)成及含量2.2菲牛蛭中氨基酸的闡發(fā)苗美麗等5接納HPL法，測(cè)定廣西產(chǎn)菲牛蛭提取液中的氨基酸。并接納內(nèi)標(biāo)法舉行含量測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表2。測(cè)定結(jié)果表白菲牛蛭中含有18種氨基酸，甘氨酸的含量最高為5392.70g/g，其次是亮氨酸含量為2340.59g/g。此中含有人體必須的7種氨基酸,這7種必須氨基酸含量為5

7、536.28g/g，占氨基酸總量的28.16%；高于其他水蛭日本醫(yī)蛭為22.50%，螞蟥為21.40%7中必須氨基酸的含量。表2菲牛蛭中氨基酸的構(gòu)成及含量gg-1*為人體必須氨基酸；：為含量較高的氨基酸3菲牛蛭的生物活性身分及其藥理學(xué)作用3.1菲牛蛭素(Bufrudin)8菲牛蛭素是從菲牛蛭分出的一種多肽,由60多個(gè)氨基酸構(gòu)成,分子量7000D，序列闡發(fā)表白,此中50%60%的氨基酸殘基與水蛭素雷同。其立體布局和構(gòu)型有待進(jìn)一步研究。它的作用機(jī)理與水蛭素(Hirudin)、叢林山蛭素(Haeadin)雷同，都是按捺凝血酶9。黃愛(ài)民等10從廣西產(chǎn)菲牛蛭消化液中分散出兩種特異凝血酶按捺劑-菲牛蛭素A

8、BufrudinA,BDA、菲牛蛭素BBufrudinB,BDB。BDA分子量約為15.2KD，等電點(diǎn)為3.97；BDB分子量為14.6KD，等電點(diǎn)為4.61。紫外掃描創(chuàng)造，BDA在230n處有最大汲取，而B(niǎo)DB的最大汲取那么在200210n之間。每1000l水蛭消化液可以分散出菲牛蛭素A630g,菲牛蛭素B615g，收率菲牛蛭素A約為0.303；菲牛蛭素B約為0.300%。別的，李文等12用7種水蛭舉行全血與血漿復(fù)鈣時(shí)間試驗(yàn)，證明日本醫(yī)蛭與菲牛蛭都表示了強(qiáng)盛的抗凝血作用(樣品在10in測(cè)試時(shí)間內(nèi)不凝)。湖北牛蛭的抗凝結(jié)果也非常突出。黎淵弘等14用廣西菲牛蛭提取物對(duì)家兔體外血栓、動(dòng)脈血栓及大鼠

9、靜脈血栓舉行抗血栓研究,結(jié)果表白，大(1.5ATU),中(0.75ATU)，小(0.5ATU)劑量組與比擬組比擬，菲牛蛭提取物對(duì)家兔體外血栓形成有明顯性差異P0.05,血栓按捺率為24.3%100%。與比擬組比力，給藥組藥后10，15in對(duì)大鼠半體內(nèi)血栓形成影響有明顯性差異(P0.05),血栓的濕重顯著減小或完全消散。大鼠靜注菲牛蛭提取物60ATU/kg后,大鼠靜脈血栓形成率為0，血栓干濕重為0,與比擬組比力有非常明顯性差異(P0.01)。家兔靜注菲牛蛭提取物60ATU/kg前和給藥后15，30，45in，家兔動(dòng)脈血栓干濕重有明顯性差異(P0.05)，藥物作用時(shí)間為1h。3.2纖維卵白溶解酶筆

10、者接納纖維卵白平板法15定性測(cè)定廣西產(chǎn)菲牛蛭唾液提取液纖維卵白溶解酶。結(jié)果表白：在尺度平板和加熱平板上參加廣西產(chǎn)菲牛蛭唾液提取液20l后，溶圈直徑為0.6，表白能溶解纖維卵白。而尿激酶20l在尺度平板上有較強(qiáng)的纖溶作用溶圈直徑為1.3，在加熱平板上無(wú)纖溶作用溶圈直徑為0。說(shuō)明菲牛蛭唾液提取液的纖溶機(jī)制與尿激酶差異，是以直接纖溶為主。菲牛蛭唾液提取液顛末10%100%硫酸銨處置懲罰，部門(mén)卵白被沉淀，由于硫酸銨的量差異，溶圈巨細(xì)也差異。10%硫酸銨處置懲罰樣品上清液的溶圈直徑最大，80%硫酸銨處置懲罰樣品上清液的溶圈直徑最校3.3抗血小板聚攏活性身分李文等12從7種水蛭對(duì)抗ADP或膠原誘導(dǎo)的血小板

11、聚攏的結(jié)果表白：日本醫(yī)蛭、菲牛蛭和湖北牛蛭都表示了抗血小板聚攏的作用。此中以日本醫(yī)蛭的結(jié)果最正確。在3.08g/l濃度下已表示按捺ADP誘導(dǎo)聚攏的作用；其次為菲牛蛭，在9.23g/l時(shí)對(duì)血小板最大聚攏率PA，%和1in時(shí)血小板聚攏率Par，%都表示了明顯按捺；湖北牛蛭的按捺ADP誘導(dǎo)血小板聚攏作用那么必要較高濃度。筆者也創(chuàng)造，25l廣西產(chǎn)菲牛蛭唾液提取液對(duì)ADP誘導(dǎo)的聚攏表示90%的按捺。3.4抑菌活性身分廣西菲牛蛭唾液粗提液未創(chuàng)造抑菌活性，但是顛末離心處置懲罰，對(duì)金色葡萄球菌有按捺作用，抑菌圈直徑為1.0。大概是由于粗樣中身分多而雜，舉行抑菌檢測(cè)時(shí)滋擾大，而導(dǎo)致陰性結(jié)果。顛末離心，滋擾卵白被

12、沉淀分散，表現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。4菲牛蛭粗品和菲牛蛭素佳構(gòu)的制備114.1提取粗品先配制提取液，然后讓菲牛蛭吸吮，待菲牛蛭充實(shí)吸飽后，再將其擠壓，網(wǎng)絡(luò)唾液水蛭素粗品，每隔3周可提取1次，每條可以重復(fù)提取56次，末了還可將團(tuán)體凍干后破壞作末了的提齲4.2廣西菲牛蛭素佳構(gòu)的分散純化5菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列測(cè)定譚恩光等4以我國(guó)廣東菲牛蛭為質(zhì)料，研究地理因素對(duì)菲牛蛭水蛭素基因布局變異的影響。研究表白：廣東菲牛蛭水蛭素基因Hg全長(zhǎng)642bp，與馬尼拉的菲牛蛭水蛭素基因H1和H2同源性別離為9和88.6。從整個(gè)多肽鏈看來(lái)，廣東菲牛蛭水蛭素基因序列，也具有如下特性：Hg的N端第6，13，15，21，27和36

13、位為半胱氨酸，推測(cè)這6個(gè)半胱氨酸將形成3對(duì)二硫鍵，對(duì)分子構(gòu)型起不變作用；Hg亦含1個(gè)富酸性羧基末了片斷。此片斷中有7個(gè)酸性氨基酸，為別離位于50、54、55、59的谷氨酸和位于52，58，60的天冬氨酸。酸性羧基末了片斷與凝血酶的識(shí)別部位結(jié)合，即帶負(fù)電的羧基末了氨基酸殘基和凝血酶分子布局中帶正電氨基酸形成的凹槽離子鍵彼此作用是復(fù)合物形成關(guān)鍵一步，也是發(fā)揮成效的緊張一步；肽鏈中部另有一個(gè)由Pr-Lys44Pr構(gòu)成的特別序列，此3個(gè)殘基與凝血酶活性部位縫隙彼此作用，按捺了此酶的成效1618。別的廣東菲牛蛭水蛭素羧基端不存在來(lái)自醫(yī)蛭素中的磺酸化修飾的Tyr，代之是He，這表白水蛭差異科之間，蛭素基因

14、的翻譯后修飾進(jìn)化方法差異。6菲牛蛭中有害物質(zhì)含量和急性毒性吳志軍等13測(cè)定了菲牛蛭中有害物質(zhì)含量和急性毒性試驗(yàn)。結(jié)果表白：3批差異批號(hào)菲牛蛭樣品中銅、鉻、砷、汞、鉛5種有害重金屬元素含量總和20g/kg，砷元素含量2kg，有機(jī)氯類和有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留量均很低。急性毒性：LD10g/kg。菲牛蛭中重金屬含量和有機(jī)氯以及有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量均切合國(guó)度有關(guān)要求，菲牛蛭可思量作為一種新的藥用資源加以研究。我國(guó)有水蛭近百種，但?中國(guó)藥典?(1995年版)只收載3種，而市場(chǎng)上出售的水蛭藥材現(xiàn)實(shí)只有寬體金線蛭一種。筆者以為，對(duì)別的品種的水蛭尤其是吸血水蛭比方菲牛蛭等，有需要舉行多學(xué)科的綜合研究，以擴(kuò)大入藥水蛭的品

15、種，造福于人類?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1KeeganHL,TshikaS,SuzukiH.Bld-sukingAsialeehesffailiesHirudidaeandHaeadipsidaeR.Japan:USAryedialand,July,1968.2StEinerV.PriarystrutureandfuntinfnvelglysylatedhirudinsfrtheleehHirudinariaanillensisJ.Biheistry,1992,31:2294.3SaheriE.NvelhirudinvariantsfrtheleehHirudinariaanillensis,ainaid

16、sequene,DNAlningandgenirganizatinJ.EurJBihe,1993,214:295.4譚恩光，劉秀平.廣東菲牛蛭水蛭素基因的克隆和序列測(cè)定J.中山醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，23(2)：84.5苗美麗，宋文東.菲牛蛭中脂肪酸和氨基酸的闡發(fā)J.福建闡發(fā)測(cè)試研究簡(jiǎn)報(bào)，2022，16(2)：49.6劉君，王淳，張穎，等.G/S闡發(fā)中藥螞蟥脂肪酸的構(gòu)成J.闡發(fā)儀器,2022,2:37.7郭文菊,李長(zhǎng)安.水蛭的氨基酸及微量元素闡發(fā)J.中醫(yī)藥研究,1997,13(2):46.8歐興長(zhǎng).水蛭活血有用身分研究外表R.中國(guó)中醫(yī)底子醫(yī)學(xué)雜志1997，42：60.9EletrialaA.I

17、slatinfthrbininhibitrfrtheLeehHirudinariaanillenaiaJ.BldagulatinandFibrinlysis，1991，2:83.10黃愛(ài)民，黎肇炎，廖共山，等.廣西菲牛蛭消化液中抗凝物質(zhì)的分散純化J.中國(guó)生化藥物雜志，2022，275：273.11黃愛(ài)民，黎肇炎，廖共山，等.菲牛蛭素體表里抗凝實(shí)行研究J.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，23(1):30.12李文，歐長(zhǎng)興.七種水蛭抗血小板聚攏與抗凝血研究J.中藥藥理與臨床，1997，135：32.13吳志軍，于立華.菲牛蛭及其成品的抗血栓、溶血栓作用J.中成藥，2022，29(4)：591.14黎淵弘，楊洋，黎肇炎.廣西菲牛蛭提取物抗動(dòng)物血栓形成的作用J.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，23(6)：901.15AstrupT,llerts.Thefibrinpl