生物化學與分子生物學實驗：4-分光光度法

1、分光光度法內(nèi)容3分光光度法的原理1如何求被測組分的含量2分光光度計的基本結(jié)構(gòu)分光光度計的使用與注意事項43分光光度法概念：是利用物質(zhì)所特有的吸收光譜來鑒別物質(zhì)或測定其含量的一項技術(shù)。特點：靈敏度高、精確度高、操作簡便、快速。對于復(fù)雜的組分系統(tǒng)，無須分離即可檢測出其中所含的微量組分的特點。分光光度法分類紫外分光光度法（200400nm）可見分光光度法（400760nm）紅外分光光度法（76010000nm）分光光度法的原理-1Lambert-Beer定律即：I0=IA+IR+IT（所用比色皿同質(zhì)料同規(guī)格，反射光強度為一定值） 故：I0 =IA+ ITI0IT入射光強度透過光強度LC液層厚度溶液濃

2、度IA反射光強度IR吸收光強度分光光度法的原理-2由式中可知：當入射光強度I0為一定時，被吸收光強度IA愈大，則透過光強度IT愈小。即透過光強度減弱僅與有色溶液對光線的吸收有關(guān)。實驗證明：溶液質(zhì)量濃度C愈大，深層厚度L愈厚，則溶液對光線吸收得愈多。分光光度法的原理-3它們之間的關(guān)系是：分光光度法的原理-4分光光度法的原理-5如何求被測組分的含量1.利用標準管計算測定物的含量2.利用標準曲線計算測定物含量3.利用標準系數(shù)法求出待測溶液的濃度4.利用消光系數(shù)法求出待測溶液的濃度利用標準管計算測定物的含量 在相同條件下測定同種已知濃度（CS）標準液的吸光度（AS），同時也測定末知濃度（CU）的吸光度

3、（AU），利用標準曲線計算測定物含量 先配制一系列濃度由小到大的標準溶液，分別測出它們的吸光度。然后以各管吸光度（A）為縱坐標，各管的濃度（C）為橫坐標，在方格坐標紙上作圖。 若被測物質(zhì)對光的吸收符合光的吸收定律，則必然得到一條通過原點的直線，即標準曲線，亦稱工作曲線。以后對末知濃度物質(zhì)測定時，無需再作標準管，據(jù)測定管吸光度從標準曲線上即可求得測定物的濃度。 標準曲線(濃度-吸光度曲線）0.20.80.40.6A 0 1 2 3 4 5根據(jù)測定管吸光度從標準曲線上即可求得測定物的濃度。 C分光光度計的基本結(jié)構(gòu)光源單色光器吸收池檢測器顯示鎢絲燈可見光源3501000nm氫燈氘燈紫外光源 2003

4、60nm棱鏡衍射光柵玻璃比色杯石英比色杯硒光電池光電管光電倍增管玻璃能吸收UV光，僅適用于可見光區(qū)。石英不吸收紫外光，適于紫外和可見光區(qū)。將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柕难b置。記錄裝置：訊號處理和顯示系統(tǒng)。V-1100型可見光分光光度計 0.000ATCFMODEPRINT0%T100%TA：吸光度T：透射比C：濃 度F：斜 率MODEATCF切換鍵PRINT確認鍵0%T100%T校零、下降鍵校100、上升鍵V-1100分光光度計鍵盤控制的使用說明 V-1100分光光度計操作步驟開機，預(yù)熱30分鐘。轉(zhuǎn)動波長旋鈕，調(diào)所需波長。按 鍵切換到T檔。將黑體放入光路中，合上蓋，按 鍵校零,T=000.0。開蓋，將

5、參比液按空白液、標準液、待測液順序放入比色杯架上，拉動比色架拉桿，將空白液放入光路中，合上蓋，按 鍵校T=100.0合上蓋，按 鍵切換到A檔 拉動拉桿，將標準、待測液依次放入光路中 ，即可讀取其吸光度A值。重復(fù)3次，記錄3組數(shù)據(jù)。讀數(shù)后，將黑體放入光路中，開蓋取出比色杯。將參比液倒回原試管中，清洗比色杯并倒扣在濾紙上晾干關(guān)機，蓋上防塵蓋，登記儀器使用登記本。MODE 0%MODE 100%V-1100分光光度計 使用注意事項注意防震、防潮、防光和防腐蝕。每臺儀器所配套的比色皿不能與其他儀器的比色皿單個調(diào)換。不可用手指或毛刷摩擦比色杯的透光面。盛裝參比液時，達到比色杯的3/4即可，不宜過多，以防溶液溢出。比色杯外壁如有液體，只能用濾紙沾去水份，再用擦鏡紙拭凈。注意比色杯的清潔，用后應(yīng)先用自來水沖洗，再用蒸餾水清洗。測試結(jié)束要及時登記，儀器有問題及時報告。操作練習實驗材料試劑： CuSO4標準液 （8mg/ml） 待測CuSO4溶液 蒸餾水器材：加樣槍、刻度吸管、試管、試管架 V-1100型可見光分光光度計操作練習步驟加入物 B S U蒸餾水 3ml CuSO4標準液 3ml CuSO4待測液 3ml分別取3支試管，做好標記，按下表操作： 以空白管B調(diào)零，在690nm處，讀取標準管S和待測管U吸光度A值，記錄3組數(shù)據(jù)，取平均A值，代入公式計算。數(shù)