《基因工程》課件第七章 基因工程應用

1、第七章 基因工程應用基因工程藥物轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因動物基因治療基因芯片技術(shù)基因工程的應用抗體疫苗激素寡核苷酸藥物細胞因子基因工程藥物7.1 基因工程藥物7.1.1 基因工程激素類藥物激素：是一類由生物體內(nèi)分泌腺或特異性細胞產(chǎn)生的微量有機化合物，通過體液或細胞外液運送到特定的作用部位，能引起特殊的生理效應。激素（按化學性質(zhì)分）多肽蛋白類激素甾醇類激素脂肪酸類激素基因工程類激素：主要指通過基因工程方法合成的蛋白多肽類激素。胰島素胰島素是最早從動物胰臟中分離出來的多肽蛋白類激素。胰島素的合成胰臟胰島的細胞前胰島素原胰島素原成熟的胰島素跨膜運輸切除前導肽在高爾基體內(nèi)形成二硫鍵切除C肽合成用基因工程生產(chǎn)人

2、胰島素的兩種主要途徑：用發(fā)酵的方法生產(chǎn)胰島素原，在體外將胰島素原轉(zhuǎn)變成胰島素。（主要方法）先分別發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素的A鏈和B鏈，純化后再在體外重組產(chǎn)生完整的人胰島素。生長激素1985年，美國的FDA批準了第一代重組人生長激素上市。第一代重組人生長激素在大腸桿菌中表達，蛋白質(zhì)的N端比天然的人生長激素多了一個甲硫氨酸。目前生產(chǎn)和使用的是第二代生物工程生長激素。第二代生物工程生長激素是以分泌蛋白的形式表達的，信號肽在分泌的過程中被自動切除而產(chǎn)生與天然蛋白完全一致的序列。生長激素：是由動物腦垂體前葉分泌的一種能促進生長的蛋白類激素。7.1.2 基因工程細胞因子類藥物細胞因子（Cytokine）：是由細胞

3、分泌的能調(diào)節(jié)生物有機體生理功能，參與細胞的增殖、分化和凋亡的小分子多肽類物質(zhì)。1957年Isaacs和Indenmann發(fā)現(xiàn)了第一種細胞因子干擾素（IFN）。細胞因子（按功能分）干擾素（IFN）集落刺激因子（CSF）白細胞介素（IL）腫瘤壞死因子（TNF）趨化因子（chemokine）生長因子（GF）大多數(shù)細胞因子是分泌型小分子多肽，少數(shù)細胞因子結(jié)合在細胞膜的表面。細胞因子通過與靶細胞表面的特異性受體結(jié)合后發(fā)揮作用。作用特點：多相性、網(wǎng)絡(luò)性、高效性。生物學功能：調(diào)節(jié)免疫應答、抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)機體造血功能、促進炎癥反應。干擾素（interferon，IFN）干擾素：是一類多功能細胞因子，按結(jié)

4、構(gòu)和來源可分為、三種。IFN -主要由白細胞產(chǎn)生，IFN -由成纖維細胞產(chǎn)生，IFN -主要由T細胞和NK細胞產(chǎn)生。抗病毒感染調(diào)控細胞的生長調(diào)節(jié)免疫細胞發(fā)揮生理效應干擾素的主要生理作用臨床應用：治療白血病、乙型肝炎、丙型肝炎、多發(fā)性硬化癥和類風濕關(guān)節(jié)炎等多種疾病。紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）紅細胞生成素：又稱促紅細胞生成素或紅細胞生產(chǎn)刺激因子，是一種集落刺激因子。它由腎臟和肝臟產(chǎn)生，其主要功能是刺激造血始細胞分化為紅細胞，維持外周血中紅細胞的正常水平。1988年瑞士的Cilag公司上市了基因工程EPO。中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）生產(chǎn)的重組人EPO于1989年被美國F

5、DA批準上市，現(xiàn)已在全世界年銷售額達數(shù)十億美元，成為開發(fā)最成功的基因工程藥物之一。生產(chǎn)EPO的關(guān)鍵是建立高表達工程細胞，由于蛋白質(zhì)的糖基化對其生物學活性很重要，因此以基因工程途徑生產(chǎn)EPO不能利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，只能利用哺乳動物表達系統(tǒng)進行生產(chǎn)。EPO的臨床應用：腎功能衰竭導致的貧血；腫瘤及腫瘤放化療所導致的貧血；骨髓增生異常綜合癥貧血；類風濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼瘡所致貧血；艾滋病人因使用疊氮胸苷（AZT）治療所致貧血。干細胞因子（stem cell factor，SCF）對骨髓造血干細胞和造血始細胞具有刺激效應。目前人重組SCF已完成臨床實驗并申請上市。SCF也可與其它細胞因子聯(lián)合使用，以發(fā)揮

6、不同的生理作用。人表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）人表皮生長因子，因其可抑制胃酸的分泌，故又稱抑胃素。它由53個氨基酸殘基組成，廣泛存在與人的各種體液中。功能：對多種細胞具有刺激效應。臨床應用：治療外傷、潰瘍、燒傷等。白細胞介素（interleukin，IL）簡稱白介素，是由多種免疫細胞產(chǎn)生的細胞因子，它是一類重要的免疫調(diào)節(jié)因子。1972年這個家族的第一個成員IL-1被發(fā)現(xiàn)，它介導淋巴細胞的增值反應。1983年發(fā)現(xiàn)了IL-2，它在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮核心調(diào)節(jié)作用。到目前已發(fā)現(xiàn)20多種白介素，分別以IL-1IL-20表示。臨床應用：治療腫瘤及某些感染性疾病如結(jié)核桿

7、菌感染等，還可用于治療艾滋病?；蚬こ蘄L-2于1992年由美國的Chiron公司生產(chǎn)并上市。 7.1.3 基因工程抗體抗體：是在抗原物質(zhì)刺激下產(chǎn)生的，能與相應抗原發(fā)生特異性免疫反應的蛋白質(zhì)分子?？贵w的生理功能：與特異性抗原結(jié)合發(fā)生免疫反應，活化補體，通過與不同的受體結(jié)合而介導型變態(tài)反應調(diào)節(jié)吞噬細胞的吞噬功能?？贵w的臨床應用：抗腫瘤、抗感染、防止器官移植中的排斥反應、抗血栓的形成、解毒等。鼠源單克隆基因工程抗體單克隆抗體：是由識別一種抗原決定簇的細胞產(chǎn)生的均一性抗體，它反應的特異性高、親和力強、效價高、血清交叉反應少。解決措施：通過基因工程將鼠源單克隆抗體進行改進，構(gòu)建人鼠嵌合抗體或人源化抗體

8、?；蚬こ炭贵w的臨床應用：用于抗腫瘤、抗病毒、抗移植排斥反應和抗過敏反應。缺點：鼠源單克隆抗體在重復用藥時會產(chǎn)生抗鼠抗體導致療效降低。小分子抗體小分子抗體是針對完整抗體的分子量較大、不易透過血管壁等不足而進行改進的。小分子抗體（按構(gòu)建方法分）Fab抗體單鏈抗體單域抗體超變區(qū)多肽抗體人源單克隆抗體是針對鼠源單克隆抗體存在抗鼠免疫反應的缺陷而發(fā)展起來的。制備人源單克隆抗體的兩種方法通過噬菌體通過小鼠7.1.4 基因工程受體受體：是指細胞表面與各種配體如抗體等進行特異性結(jié)合的大分子物質(zhì)，它一般為糖蛋白。受體的主要功能：接受并傳遞信號，將信號傳遞到細胞內(nèi)后，引發(fā)細胞的調(diào)控系統(tǒng)并產(chǎn)生一系列生理變化。受體

9、（根據(jù)與受體結(jié)合的配體種類不同）細胞因子受體免疫球蛋白受體補體受體抗原受體7.1.5 基因工程疫苗基因工程疫苗基因工程細菌疫苗基因工程病毒疫苗核酸疫苗其它基因工程疫苗7.1.5.1 基因工程細菌疫苗基因工程細菌疫苗基因工程痢疾菌疫苗基因工程霍亂菌疫苗基因工程結(jié)核菌疫苗基因工程傷寒菌疫苗7.1.5.2 基因工程病毒疫苗基因工程病毒疫苗基因工程亞單位疫苗基因工程載體疫苗基因缺失活疫苗7.1.5.3 核酸疫苗核酸作為疫苗的優(yōu)點：其誘生的免疫應答不僅針對特異表位的抗體，還可以針對特異表位的殺傷性T細胞；能擴大抗原的免疫原性；誘生殺傷性T細胞，清除病毒感染細胞和腫瘤細胞；可與其它免疫因子聯(lián)合使用。7.1

10、.5.4 其它基因工程疫苗艾滋病疫苗寄生蟲疫苗其它基因工程疫苗7.2 轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物抗病蟲害轉(zhuǎn)基因植物抗逆轉(zhuǎn)基因植物藥用轉(zhuǎn)基因植物轉(zhuǎn)基因植物食品其它轉(zhuǎn)基因植物7.2.1 抗病蟲害轉(zhuǎn)基因植物抗病蟲害轉(zhuǎn)基因植物抗蟲轉(zhuǎn)基因植物抗病毒轉(zhuǎn)基因植物抗真菌轉(zhuǎn)基因植物7.2.1.1 抗蟲轉(zhuǎn)基因植物抗蟲轉(zhuǎn)基因植物蘇云金桿菌毒素轉(zhuǎn)基因植物蛋白酶抑制劑轉(zhuǎn)基因植物植物凝集素轉(zhuǎn)基因植物淀粉酶抑制劑轉(zhuǎn)基因植物7.2.1.2 抗病毒轉(zhuǎn)基因植物抗病毒轉(zhuǎn)基因植物利用植物自身編碼的抗病毒基因培育抗病毒植株病毒外殼蛋白轉(zhuǎn)基因植物病毒復制酶轉(zhuǎn)基因植物移動蛋白轉(zhuǎn)基因植物核糖體失活蛋白轉(zhuǎn)基因植物病毒衛(wèi)星RNA轉(zhuǎn)基因植物反義RNA轉(zhuǎn)

11、基因植物（補）7.2.1.3 抗真菌轉(zhuǎn)基因植物植物對真菌等病害微生物的防御主要包括兩個方面：當致病菌入侵植物時，植物細胞壁的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，細胞壁的強度和硬度增加。機械防護：生物學保護：植物細胞被誘導合成多種活性物質(zhì)如硫堇、抗毒素和幾丁質(zhì)酶等，以抑制真菌的生長和入侵。抗真菌轉(zhuǎn)基因植物幾丁質(zhì)酶轉(zhuǎn)基因植物植物抗毒素轉(zhuǎn)基因植物7.2.2 抗逆轉(zhuǎn)基因植物逆境（stress）：是指使植物產(chǎn)生傷害的環(huán)境，又稱脅迫。如寒冷、冰凍、炎熱、干旱、鹽漬等。脅迫分為生物脅迫和非生物脅迫兩大類。生物脅迫是指病害、蟲害和雜草等；非生物脅迫則指不利的理化因子，其詳細分類見下圖：抗逆轉(zhuǎn)基因植物抗鹽轉(zhuǎn)基因植物抗旱轉(zhuǎn)基因植物抗凍

12、轉(zhuǎn)基因植物抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物7.2.3 藥用轉(zhuǎn)基因植物與原核生物表達系統(tǒng)和動物表達系統(tǒng)相比，轉(zhuǎn)基因植物醫(yī)藥生物反應器生產(chǎn)重組蛋白具有六大優(yōu)點：植物細胞的全能性。植物種植是最經(jīng)濟的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)。植物是能夠大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)系統(tǒng)。用植物生產(chǎn)疫苗簡單、方便。植物具有完整的真核細胞表達系統(tǒng)。表達產(chǎn)物無毒性和副作用，安全可靠，無殘存DNA和潛在致病、致癌性。藥用轉(zhuǎn)基因植物（表現(xiàn)在三方面）轉(zhuǎn)基因植物表達抗體轉(zhuǎn)基因植物表達疫苗轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白7.2.4 轉(zhuǎn)基因植物食品利用植物基因工程提高作物的產(chǎn)量利用植物基因工程改良作物的品質(zhì)7.2.5 其它轉(zhuǎn)基因植物抗早衰轉(zhuǎn)基因植物改變花色、花型的轉(zhuǎn)基因植物利

13、用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)可降解塑料7.3 轉(zhuǎn)基因動物轉(zhuǎn)基因動物：是指人類按照自己的意愿有目的、有計劃、有根據(jù)、有預見地將外源基因?qū)雱游锛毎麅?nèi)，通過與染色體基因組進行穩(wěn)定的整合，將生物性狀傳遞給后代動物。轉(zhuǎn)基因動物的應用利用轉(zhuǎn)基因動物改良動物品種轉(zhuǎn)基因動物作為生物反應器轉(zhuǎn)基因動物篩選藥物7.3.1 利用轉(zhuǎn)基因動物改良動物品種利用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)提高動物的繁育速度利用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)改善動物品質(zhì)利用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)培育抗病害動物品系7.3.2 轉(zhuǎn)基因動物作為生物反應器轉(zhuǎn)基因動物生物反應器動物乳腺生物反應器動物血液生物反應器哺乳動物分泌腺體生物反應器7.3.3 轉(zhuǎn)基因動物篩選藥物（自學）利用轉(zhuǎn)基因動物篩選抗腫瘤

14、藥物利用轉(zhuǎn)基因動物篩選抗艾滋病藥物利用轉(zhuǎn)基因動物篩選抗抗其他疾病藥物7.3.4 轉(zhuǎn)基因動物應用于人體器官移植（自學）7.4 基因治療基因治療：是指以正常的基因替代或修補病人細胞中的缺陷基因從而達到治療疾病的目的，它是治療分子疾病最有效的手段之一?；蛑委燇w細胞基因治療生殖細胞基因治療1990年9月14日，美國年僅4歲的女孩阿尚蒂接受了世界上第一例基因治療臨床試驗。基因治療的策略補充內(nèi)容：補充策略糾正策略限制策略無中生有基因治療活體直接轉(zhuǎn)移（in vivo）：將外源基因通過載體直接注射到肌肉、血管等靶組織或通過口服、噴霧、皮下涂抹等方式直接被試驗個體的靶部位吸收。該法操作簡便，易于推廣，但目前尚

15、未成熟，存在療效短、免疫排斥及基因轉(zhuǎn)移載體在體內(nèi)隨機分布等安全性等問題。該法雖有種種缺陷，仍不失為基因治療發(fā)展的最終趨勢。離體轉(zhuǎn)移（ex vivo）：將試驗對象的靶細胞取出，體外培養(yǎng)導入基因后再重新輸回試驗者體內(nèi)。該法比較經(jīng)典，安全有效且易控制，但是步驟多、操作復雜，患者接受程度低，難以大規(guī)模推廣。基因治療體內(nèi)基因治療：將含外源基因的真核細胞表達載體直接導入人體內(nèi)。體外基因治療：將含有外源基因的表達載體導入人體自身或異體細胞，經(jīng)體外細胞擴增后輸回人體。基因治療技術(shù)的四個環(huán)節(jié)基因診斷基因分離載體構(gòu)建基因轉(zhuǎn)移用于治療的基因正?；蚍戳x基因自殺基因基因診斷：是指利用多種基因檢測技術(shù)對人體病變基因進行

16、定位分析。基因分離：是指利用DNA重組技術(shù)克隆、鑒定、擴增和純化用于治療的基因，并根據(jù)病變基因的定位，與特異性整合序列和基因表達調(diào)控元件進行體外重組。體內(nèi)療法體外療法表達載體的構(gòu)建是基因治療成功與否的關(guān)鍵。病毒型載體非病毒型載體目前基因治療中使用的載體基因轉(zhuǎn)移方法7.4.1 腫瘤的基因治療7.4.1.1 抑癌基因治療通過向患者導入抑癌基因、恢復人體抑制腫瘤的功能，從而達到治愈腫瘤的目的。人P53基因RB基因P16基因反義癌基因治療7.4.1.2 基因修飾瘤苗瘤苗：以外源基因修飾的腫瘤細胞。目前采用的外源基因多數(shù)是細胞因子基因（包括白介素系列基因、干擾素基因、集落刺激因子基因等）。細胞因子基因修

17、飾人腫瘤細胞的過程：細胞因子基因的克隆構(gòu)建重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體缺陷型重組反轉(zhuǎn)錄病毒的包裝腫瘤細胞的轉(zhuǎn)染及檢測7.4.1.3 腫瘤的免疫基因治療腫瘤的免疫基因治療：是指利用免疫基因?qū)δ[瘤進行治療的方法。腫瘤的細胞因子基因治療腫瘤的MHC基因治療腫瘤抗原靶向的基因治療腫瘤的共刺激分子基因治療抗體介導的腫瘤免疫基因治療綜合性腫瘤免疫基因治療主要包括7.4.1.4 自殺基因治療腫瘤自殺基因：是一類前體藥物酶轉(zhuǎn)化基因、藥物敏感基因或酶前體藥物激活基因。該類基因主要存在于病毒、細菌或真菌等微生物細胞中。自殺基因系統(tǒng)包括一種酶和一種前體藥物，通過酶活性的表達將對人體細胞無毒性的前體藥物轉(zhuǎn)化為對細胞有很高毒性的

18、物質(zhì)。目前在基因治療中常用的自殺基因系統(tǒng)有tk-GCV系統(tǒng)、CD-5-FC系統(tǒng)等。凡是能將前體藥物轉(zhuǎn)化為細胞毒性產(chǎn)物的酶，如果在哺乳動物體內(nèi)不存在，就可以用于自殺基因系統(tǒng)。7.4.2 分子遺傳病的基因治療（自學）7.4.3 心血管病的基因治療（自學）7.4.4 艾滋病的基因治療（自學）7.5 基因芯片生物芯片基因芯片細胞芯片蛋白質(zhì)芯片組織芯片生物芯片（biochip）：主要指通過平面微細加工技術(shù)在固體芯片表面構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。何為生物芯片?它是繼大規(guī)模集成電路之后的又一次具有深遠意義的科學技術(shù)革命。7.5.1 基因芯片原理及技術(shù)基因芯片（gene chip）：又稱DNA芯片、DNA微陣列（DNA microarray），它是指采用原位合成或顯微