化學(xué)修飾木瓜蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1、 PAGE 14作者簡介：熊亞紅(1976-)，女，講師，博士， HYPERLINK mailto: xiongyahong基金項(xiàng)目：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)“211工程”重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2009B010100001)；國家自然科學(xué)基金（青年科學(xué)基金項(xiàng)目）(20906034B0604)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2008B080701011)化學(xué)修飾木瓜蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)研究熊亞紅 吳巧兒 蘇健鴻（華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院生物材料研究所，廣東 廣州 510642）摘 要采用鄰苯二甲酸酐（PA）對木瓜蛋白酶進(jìn)行了化學(xué)修飾，通過三硝基苯磺酸法、紫外光譜、熒光光譜及FT-IR光譜對修飾效果進(jìn)行了初步表征，采用動(dòng)力學(xué)方法考

2、察了pH和溫度對修飾酶水解活性和穩(wěn)定性的影響，并計(jì)算了一系列動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： PA對木瓜蛋白酶的平均氨基修飾度為43%，未對酶的活性基團(tuán)-SH發(fā)生修飾，修飾酶較原酶的紫外吸收峰和最大熒光發(fā)射峰均發(fā)生藍(lán)移，紫外吸收強(qiáng)度降低、熒光強(qiáng)度增大；PA修飾未改變木瓜蛋白酶的最適反應(yīng)溫度，但將其最適反應(yīng)pH由7.0提高到8.5，且酶活力也提高了約20%；PA修飾有效提高了酶的催化水解效率和酶與底物的親和力，如40 、最適pH條件下修飾酶的轉(zhuǎn)化數(shù)kcat（3.03 s-1）和親和力kcat/Km（1.70 sLg-1）均較原酶的（2.28 s-1、1.15 sLg-1）高，修飾酶催化水解反應(yīng)

3、的活化能Ea（25.4 kJmol-1）較原酶的（29.3 kJmol-1）低；PA修飾還明顯提高了酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，半衰期t1/2延長，酶分子的熱變性活化能Ea,d由77.0 kJmol-1提高到94.5 kJmol-1?？梢奝A化學(xué)修飾法是一種有效改善木瓜蛋白酶的催化性質(zhì)和穩(wěn)定性的方法。關(guān)鍵詞：木瓜蛋白酶；化學(xué)修飾；穩(wěn)定性；動(dòng)力學(xué)；熱力學(xué)參數(shù)中圖分類號(hào)：Q55；O643.32文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：AStudy on the Enzymatic Property of Chemical Modification Papain XIONG Ya-hong WU Qiao-er SU Jian-h

4、ong (Institute of Biomaterial, College of Science, South China Agricultural University, guangzhou 510642, China)Abstract: Papain was modified with phthalic anhydride (PA). The modification effect was characterized by trinitrobenzene sulfonic acid method and ultra violet spectrum and fluroscence spec

5、trum and FT-IR spectrum. Effects of pH and temperature on hydrolysis activities and stabilities of modified papain were studied by kinetic method and series of kinetic and thermodynamic parameters were calculated. The experimental results showed that the average amino modification yield was 43% and

6、sulphydryl as an active group of papain werent modified. Compared with native papain, modified papain engendered blue shift of ultraviolet peak and fluroscence emission peak and decrease in ultraviolet absorbance and increase in fluroscence intensity. Although PA modification didnt change the optima

7、l temperature for catalysis of papain, its optimal pH for catalysis was enhanced from 7.0 to 8.5 and enzymatic activity also increased by 20%. PA modification of papain caused that catalysis efficence and substrate affinity were promoted. For example, turnover number kcat (3.03 s-1) and substrate af

8、finity kcat/Km (1.70 sLg-1) of modified papain were higher than those of native papain (2.28 s-1, 1.15 sLg-1) and activation energy (Ea) for catalysis of modified papain (25.4 kJmol-1) were lower than that of native papain (29.3 kJmol-1). pH and thermal stability of papain were enhanced obviously an

9、d the half-life time (t1/2) of papain became longer and activation energy (Ea,d) for denaturation raised from 77.0 kJmol-1 to 94.5 kJmol-1 after native papain was modified by PA. So chemical modification by PA was an effective method to reform catalysis and stability of papain.Keywords: Papain；Chemi

10、cal modification；Stability； Kinetics；Activation Energy木瓜蛋白酶（papain，EC ）又稱木瓜酶，其分子量為23 000Da，等電點(diǎn)為9.5，由212個(gè)氨基酸殘基組成的單肽鏈形成，分子中含有11個(gè)賴氨酸（lysine, Lys）殘基 1-2。木瓜蛋白酶在未成熟的番木瓜果（Carica papaya）表皮的白色乳汁中含量豐富3，是一種含巰基（-SH）的肽鏈內(nèi)切酶，它具有廣泛的底物專一性、良好的熱穩(wěn)定性及價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、紡織及染料等工業(yè)。由于天然木瓜蛋白酶作為一種天然酶劑在一些非溫和條件下（如高溫、高酸堿性、重金屬

11、離子等）其結(jié)構(gòu)容易受到破壞而導(dǎo)致活性降低、甚至完全喪失，而人們對木瓜蛋白酶的催化活性、穩(wěn)定性、底物選擇性及pH適應(yīng)范圍等各種性能提出更高的要求，因此對木瓜蛋白酶進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)改造以改善和提高其酶學(xué)性能，已經(jīng)越來越引起人們的重視4-6。酶的表面有許多游離的羥基、酚羥基、巰基、羧基、氨基等官能團(tuán)，可與一些化合物發(fā)生烷基化、?；?、醚化等反應(yīng)7。目前，文獻(xiàn)報(bào)道已有多種酶經(jīng)小分子修飾后，其催化活性或穩(wěn)定性得到了不同程度的提高，研究結(jié)果表明酶化學(xué)修飾是改善酶學(xué)性質(zhì)和提高其應(yīng)用價(jià)值的一種非常有效的措施8。由于賴氨酸（lysine, lys）殘基末端的-NH2具有較強(qiáng)的親核性，能夠與許多親電試劑在溫和的條件下發(fā)

12、生反應(yīng)，有利于修飾過程中保持酶的活性、減少酶活損失，因此，-NH2成為化學(xué)修飾的首選官能團(tuán)。鄰苯二甲酸酐（phthalic anhydride，PA）是lys的一種專一性修飾劑，能夠有效地改善天然酶的多種性能9-12。由于lys殘基不是木瓜蛋白酶的活性中心部分，因此可以采用PA來對木瓜蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾2,5。酶催化反應(yīng)的一些動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)對于研究酶的催化反應(yīng)是非常必要的。動(dòng)力學(xué)參數(shù)可提供一些酶催化反應(yīng)機(jī)理方面的信息，而熱力學(xué)參數(shù)可提供一些酶變性機(jī)理方面的信息。人們通常采用微量量熱法研究酶的熱變性、采用尿素法或鹽酸胍法研究酶的溶劑變性，但近年來有人嘗試用動(dòng)力學(xué)方法研究酶的穩(wěn)定性，該方法簡單

13、、且不需使用價(jià)格昂貴的微量量熱儀13。作者曾采用動(dòng)力學(xué)方法研究了一種新型核糖核酸酶14和PA修飾豬胰脂肪酶（PA-PPL）12的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，得到了一些有價(jià)值的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)數(shù)據(jù)，但目前尚未見到關(guān)于木瓜蛋白酶變性的熱力學(xué)研究。本文采用PA對木瓜蛋白酶的lys殘基進(jìn)行了化學(xué)修飾，并進(jìn)行了初步表征，首次采用動(dòng)力學(xué)方法研究了木瓜蛋白酶及其PA修飾酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，并計(jì)算出了一系列動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)參數(shù)，得到了較好的修飾效果，為拓展木瓜蛋白酶的應(yīng)用提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 試劑與儀器試劑：木瓜蛋白酶，水解活力為6 000U/mg，E. Merck公司；牛血清白蛋白，

14、生化試劑，上海伯奧生物科技有限公司；酪蛋白，生化試劑，廣東環(huán)凱微生物科技公司；其它試劑為國產(chǎn)分析純試劑；實(shí)驗(yàn)所用的水為二次蒸餾水。儀器：紫外-可見分光光度計(jì)（UV-4000型，日本Shimadzu公司）、熒光分光光度計(jì)（RF-5301PC，日本Shimadzu公司）、可見光分光光度計(jì)（721型，上海精密科學(xué)儀器有限公司）、恒溫磁力攪拌器（JB-3，上海雷磁儀器廠新涇分廠）、電熱恒溫水浴鍋（DK-S26，蘇州三發(fā)電子有限公司）、數(shù)顯pH計(jì)（pHS-25，上海雷磁儀器廠新涇分廠）。1.2 木瓜蛋白酶的PA修飾將20 mL 5 mgmL-1的木瓜蛋白酶原酶（native papain，NP）溶液與1

15、0 mL 0.020 molL-1的鄰苯二甲酸酐溶液混和，4 下磁力攪拌反應(yīng)1 h，上述溶液均用pH7.0、0.025 molL-1磷酸鹽緩沖液配制。反應(yīng)結(jié)束后，將上述溶液轉(zhuǎn)入預(yù)先處理好的透析袋中， 4 下在pH7.0、0.025 molL-1磷酸鹽緩沖液中透析48 h，多次更換透析液以除掉多余的修飾劑，得到木瓜蛋白酶修飾酶（modified papain，MP）溶液，定容到100.0 mL，使用時(shí)作適當(dāng)稀釋供實(shí)驗(yàn)使用。1.3平均氨基修飾度測定采用三硝基苯磺酸（TNBS）分光光度法測定15，以不加蛋白的溶液做參比。修飾度的計(jì)算公式為 (ANP-AMP) /ANP100%。其中ANP和AMP分別

16、為420 nm處的NP體系和MP體系的吸光度值。1.4 木瓜蛋白酶活力的測定參照文獻(xiàn)16方法測定木瓜蛋白酶的活力，即以干酪素為底物，在40 、pH7.0的條件下反應(yīng)10 min，以福林試劑顯色，測定680 nm的吸光度，通過實(shí)驗(yàn)測得的酪氨酸t(yī)yr的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算出反應(yīng)產(chǎn)生的酪氨酸的量。將每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 g酪氨酸定義為1個(gè)蛋白酶活力單位（U）。酶的相對活力是以同組實(shí)驗(yàn)中原酶NP的最高酶活力為100%，依此其它酶活力數(shù)據(jù)以百分?jǐn)?shù)表示。本文以10 min反應(yīng)時(shí)間內(nèi)的平均反應(yīng)速率代替反應(yīng)初速率。蛋白質(zhì)含量的測定采用Lowry法17，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。1.5 最適反應(yīng)pH、最適反應(yīng)溫度及酶

17、的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定通過改變相應(yīng)物理量，固定其它物理量不變的方法測定NP和MP的最適pH、最適溫度及酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km值和Vm值。通過固定反應(yīng)溫度為40 ，分別測定NP和MP在pH6.010.0范圍的酶活力來測定它們的最適反應(yīng)pH；通過固定反應(yīng)pH為最適值，分別測定NP和MP在反應(yīng)溫度為3095 范圍的酶活力來測定它們的最適溫度；固定反應(yīng)pH為最適值、反應(yīng)溫度為40 ，分別測定NP和MP在初始底物濃度為2.5 gL-125 gL-1的反應(yīng)初速率v，然后分別采用Hanes-Woolf作圖法（見式(1)）求出NP和MP的Km值和Vm值。 (1)1.6 酶的pH穩(wěn)定性測定參照文獻(xiàn)18的方法測定酶的pH穩(wěn)

18、定性的變化。具體如下：將NP和MP酶液分別在pH5.0（0.10 molL-1乙酸乙酸鈉緩沖液）、pH7. 0（0.10 molL-1磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉緩沖液）、pH 9.0和10.0（0.10 molL-1甘氨酸氫氧化鈉緩沖液）體系中于室溫25 下放置，每隔一段時(shí)間分別取樣將pH調(diào)至它們的最適反應(yīng)pH值以測定酶活力。1.7 酶的熱穩(wěn)定性測定將酶液（pH7.0）分別在60 、70 、80 、90 水浴中保溫，每隔一段時(shí)間取樣，冰水浴冷卻至0 ，然后按上述方法測定最適反應(yīng)pH時(shí)的不同底物濃度下的反應(yīng)初速率。1.8 理論計(jì)算由式(2)計(jì)算出轉(zhuǎn)化數(shù)kcat，其中E0為酶的總濃度。式(3)為Arrh

19、enius方程，以lnkcat對1/T作圖得一直線，由斜率-Ea/R可求得催化反應(yīng)活化能Ea。式中R和A分別為氣體摩爾常數(shù)和頻率系數(shù)。 (2) (3)酶的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中最大初速率Vm與熱變性時(shí)間td之間存在半對數(shù)關(guān)系13，見式(4)，由此可求出不同溫度下酶變性的一級速率常數(shù)kd。類似式(3)，由ln(kd)對1/T作圖得到的直線斜率(- Ea,d /R)可求得變性活化能Ea,d；由式(5)得出酶的半衰期t1/2。 (4) (5)2 結(jié)果與討論2.1 修飾酶MP的初步表征本文實(shí)驗(yàn)測得PA對木瓜蛋白酶的平均氨基修飾度為43%，由于一個(gè)木瓜蛋白酶分子中含有11個(gè)lys殘基，因此每分子木瓜蛋白酶中有約

20、5個(gè)lys殘基被PA修飾。與文獻(xiàn)報(bào)道的50%4、55%5的平均氨基修飾度相比，本文的結(jié)果雖然稍微偏低，但相差不大，這可能是由于實(shí)驗(yàn)誤差、修飾過程中pH值控制的差異等因素導(dǎo)致的。我們知道，當(dāng)酶分子發(fā)生化學(xué)修飾后的空間構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，通常會(huì)導(dǎo)致酶蛋白分子中的phe、tyr及trp三種氨基酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生變化，反映到酶蛋白溶液的紫外光譜和熒光光譜也會(huì)發(fā)生不同程度的變化。為了進(jìn)一步證明PA對PPL發(fā)生了化學(xué)修飾，本文采用紫外光譜（圖1a）、熒光光譜（圖1b）及FT-IR光譜（圖1c）驗(yàn)證了PA對木瓜蛋白酶發(fā)生修飾。從圖1a中木瓜蛋白酶修飾前后的紫外光譜的吸收峰的峰位和峰強(qiáng)可以看出，原酶NP在27

21、8 nm和205 nm處有吸收峰，而修飾酶MP在274 nm和203 nm處有吸收峰，均較原酶的峰位發(fā)生一定的藍(lán)移，且吸收強(qiáng)度有所減小。文獻(xiàn)中報(bào)道了木瓜蛋白酶經(jīng)化學(xué)修飾后280 nm附近處的吸收峰發(fā)生藍(lán)移，但未對205 nm附近的峰作報(bào)道4。這些細(xì)小的差異說明PA修飾已導(dǎo)致木瓜蛋白酶分子的個(gè)別共價(jià)鍵發(fā)生變化，酶分子的構(gòu)型已經(jīng)發(fā)生一定程度的改變。從圖1b中可以看出木瓜蛋白酶經(jīng)PA修飾前后熒光發(fā)射譜圖也出現(xiàn)細(xì)微差異，修飾后最大熒光發(fā)射波長由342 nm位移到339 nm，且熒光發(fā)射強(qiáng)度有所增加，目前未見文獻(xiàn)報(bào)道木瓜蛋白酶經(jīng)小分子化學(xué)修飾后熒光光譜的變化。由于tyr和trp殘基是主要的熒光基團(tuán)，根據(jù)

22、蛋白質(zhì)trp殘基不連續(xù)態(tài)模型，位于疏水內(nèi)核的trp殘基峰在310 nm附近，位于表面的trp殘基峰在350 nm附近、tyr殘基峰在300 nm附近19，因此推測木瓜蛋白酶的內(nèi)源熒光主要是由位于酶分子表面的trp殘基貢獻(xiàn)的。PA修飾導(dǎo)致木瓜蛋白酶的紫外光譜和熒光光譜發(fā)生上述變化的原因可能是因?yàn)槟竟系鞍酌附?jīng)PA修飾后分子構(gòu)象發(fā)生一定的變化導(dǎo)致部分位于酶分子表面的trp殘基由分子表面轉(zhuǎn)向?yàn)槁癫赜诜肿觾?nèi)部。將木瓜蛋白酶原酶和修飾酶均經(jīng)pH7.0、0.025 molL-1磷酸鹽緩沖液透析后冷凍干燥得到粉末，采用KBr壓片法得到它們的FT-IR光譜圖，見圖1c。木瓜蛋白酶經(jīng)PA修飾后，歸屬于仲酰胺基團(tuán)（

23、-CONH-）的N-H峰由3386 cm-1藍(lán)移到3361 cm-1，位于1658 cm-1處的C=O峰未發(fā)生明顯位移，但在1564 cm-1處出現(xiàn)一個(gè)新的C=O峰，該峰應(yīng)歸屬于PA對lys殘基上的-NH2修飾生成的仲酰胺基團(tuán)，證明修飾劑PA引入到木瓜蛋白酶上。另外由于巰基基團(tuán)（-SH）的S-H峰應(yīng)出現(xiàn)26002550 cm-1范圍，圖1c中木瓜蛋白酶經(jīng)PA修飾前后該范圍內(nèi)譜圖未發(fā)生變化，說明活性基團(tuán)-SH未被修飾。可見PA化學(xué)修飾并不涉及活性場面，只是部分改變了酶分子的外部基團(tuán)，即lys殘基上的-NH2，這與薛勇等報(bào)道的結(jié)果一致4。(a)(b) (c)圖1 原酶和修飾酶的紫外光譜、熒光光譜及

24、FT-IR光譜圖Fig1 UV spectrum (a) and fluroscence spectrum (b) and FT-IR spectrum (c) of native and modified papain2.2 原酶和修飾酶最適反應(yīng)pH值和最適反應(yīng)溫度的比較本文在不同pH值的緩沖液（pH6.08.0、 0.10 molL-1磷酸鹽緩沖液；pH8.510.0、0.10 molL-1甘氨酸氫氧化鈉緩沖液）中測定了PA修飾前后木瓜蛋白酶酶活的變化，結(jié)果如圖2a所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，修飾酶MP的最適反應(yīng)pH值為8.5，較原酶NP的最適反應(yīng)pH值7.0向堿性方向偏移了1.5個(gè)pH單位。薛勇

25、等4、Sangeetha等5用多種酸酐修飾木瓜蛋白酶使得最適反應(yīng)pH值由7.0偏移至9.0，Khaparde等6采用琥珀酸酐（SA）修飾木瓜蛋白酶導(dǎo)最適反應(yīng)pH值由6.0偏移至7.5。人們普遍認(rèn)為這可能是由于酸酐（如PA）與lys殘基上帶正電荷的氨基反應(yīng)后，在酶分子中引入了帶負(fù)電荷的羧基，使得最適pH值向堿性方向偏移。最適反應(yīng)pH值的提高有利于增強(qiáng)木瓜蛋白酶的耐堿能力，從而拓寬木瓜蛋白酶應(yīng)用的pH范圍。從相對酶活的數(shù)據(jù)來看，木瓜蛋白酶經(jīng)PA修飾后酶活力有所增大，修飾酶MP在最適pH下的酶活較原酶NP在最適pH下的酶活約高20%，這與Khaparde等6報(bào)道木瓜蛋白酶經(jīng)SA修飾后，最適反應(yīng)pH下

26、的酶活升高約29%的結(jié)果一致，而與薛勇等4、Sangeetha等5報(bào)道的木瓜蛋白酶經(jīng)多種酸酐修飾后酶活力降低的結(jié)果不同。由于酶活力的改變與酶分子構(gòu)象的變化有密切的聯(lián)系，本文修飾酶MP的酶活力明顯增大，這說明木瓜蛋白酶經(jīng)PA修飾后酶分子構(gòu)象是朝著有利于活性中心與底物結(jié)合的方向發(fā)生變化。木瓜蛋白酶原酶NP和修飾酶MP在各自最適反應(yīng)pH條件下的酶活力隨反應(yīng)溫度的變化見圖2b。由圖2b可以看出，PA修飾并未改變木瓜蛋白酶的最適反應(yīng)溫度，原酶NP和修飾酶MP的最適反應(yīng)溫度均為75 ，但在同一溫度下修飾酶MP的酶活力明顯高于原酶NP的，而且當(dāng)催化反應(yīng)溫度高于75 時(shí)，由于高溫破壞了酶的結(jié)構(gòu)引起部分酶活喪失

27、，但修飾酶MP的酶活力降低的幅度明顯低于原酶NP的，由此可見PA修飾可有效提高木瓜蛋白酶的熱穩(wěn)定性。文獻(xiàn)4-6也報(bào)道了一些酸酐類化學(xué)修飾劑未改變木瓜蛋白酶的最適反應(yīng)溫度的結(jié)果，但文獻(xiàn)報(bào)道的木瓜蛋白酶的最適反應(yīng)溫度有60 5、70 6,18、80 4，這些數(shù)值與本文測得的75之間存在一定差異，可能與酶的純度有關(guān)。 (a)(b)圖2 反應(yīng)pH值和反應(yīng)溫度對原酶和修飾酶活力的影響Fig2 Effects of reaction pH (a) and reaction temperature (b) on enzymatic activities of native and modified papa

28、in2.3原酶和修飾酶的Vmax和Km值的比較分別測定了原酶NP和修飾酶MP在最適反應(yīng)pH條件下，不同溫度、不同底物濃度S時(shí)的初始反應(yīng)速率v，根據(jù)式（1）以S/v對S作圖得到原酶NP和修飾酶MP的Hanes-Woolf圖，圖中直線的縱軸截距為Km/Vm、斜率為1/Vm。圖3為40下原酶NP和修飾酶MP的Hanes-Woolf圖，其中NP的直線斜率和截距分別為0.586和1.16、MP的直線斜率和截距分別為0.441和0.783，由此計(jì)算得到原酶NP和修飾酶MP的Vm、Km、kcat及kcat/Km列于表1。同樣，30 、50 、60 、70 下的相應(yīng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)也列于表1中。轉(zhuǎn)化數(shù)kcat反映酶

29、催化中間復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的能力或效率，kcat越大表示酶的催化效率越高；通常采用kcat / Km 值來反映酶與底物的親和力大小，該值越大表示酶與底物的親和力越大。從表1可以看出，在3070 范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)溫度的升高，原酶NP和修飾酶MP修飾酶催化底物（酪蛋白）水解的效率逐漸升高，它們與底物的親和力也逐漸增大，在同一反應(yīng)溫度下，修飾酶MP催化水解的效率（kcat）和酶與底物的親和力（kcat/Km）均比原酶NP的高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，采用PA化學(xué)修飾木瓜蛋白酶可有效提高酶的水解活力，這同酶與底物的親和力的增大有直接關(guān)系。圖3 原酶和修飾酶的Hanes-Woolf曲線 Fig3 Hanes-Woo

30、lf plots of native and modified papainE0= 1.2510-7 molL-1表1 不同溫度下原酶和修飾酶催化水解反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab2 Kinetic parameters for hydrolysis catalyzed by PPL and PA-PPL at different temperatureT/KNPMPKm/ (gL-1)Vm /(10-5molL-1min-1)kcat/(s-1)kcat/Km/(sLg-1)Km/ (gL-1)Vm /(10-5molL-1min-1)kcat /(s-1)kcat/Km /(sLg-1)3032.

31、641.041.390.531.891.562.081.103131.981.712.281.151.782.273.031.703231.582.323.092.131.363.254.333.193331.243.144.193.381.123.945.254.693431.044.175.565.350.975.136.847.05E0= 1.2510-7 molL-1圖4為原酶NP和修飾酶MP失活前催化底物水解的Arrhenius圖，圖中它們的直線斜率分別為-3525和-3056 K-1，根據(jù)式(3)可計(jì)算出它們催化水解反應(yīng)的活化能Ea分別為29.3 kJmol-1和25.4 kJmo

32、l-1，這說明PA修飾可有效降低木瓜蛋白酶催化水解反應(yīng)的活化能，有利于酶與底物的結(jié)合，從而有利于酶的催化反應(yīng)的發(fā)生，因此酶活提高。作者曾研究PPL經(jīng)PA修飾后催化水解反應(yīng)的活化能的變化時(shí)得到了類似的結(jié)果12。圖4 原酶和修飾酶催化水解反應(yīng)的Arrhenius圖 Fig4. Arrhenius plot for hydrolysis catalyzed by native and modified papain2.4 原酶和修飾酶的pH穩(wěn)定性的比較通常，酶分子經(jīng)小分子化學(xué)修飾后，其耐酸或堿的能力會(huì)發(fā)生變化。圖5反應(yīng)了PA修飾前后木瓜蛋白酶耐酸、堿能力的差別?？梢钥闯觯窷P和修飾酶MP在pH7

33、.0條件下的酶活力都較穩(wěn)定，在3 h內(nèi)酶活力未發(fā)生明顯變化；而在pH5.0條件下放置時(shí)，原酶NP和修飾酶MP的酶活力隨著放置時(shí)間的延長急劇降低，50 min時(shí)NP的酶活損失了約一半，100 min時(shí)MP的酶活減少約一半，顯然修飾酶MP在弱酸性條件下的穩(wěn)定性高于原酶NP的；在弱堿性條件下，修飾酶MP的酶活力比原酶NP的降低速度要慢得多，如pH9.0時(shí)原酶NP和修飾酶MP在3 h內(nèi)酶活力分別降低36.5%和11.7%，pH10.0時(shí)原酶NP和修飾酶MP在3 h內(nèi)酶活力分別降低56.5%和15.2%，可見原酶NP和修飾酶MP在pH10.0時(shí)的降低速度明顯快于pH9.0時(shí)的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明木瓜蛋白酶經(jīng)P

34、A修飾后pH穩(wěn)定性明顯得到提高。圖5 原酶和修飾酶的pH穩(wěn)定性Fig5 pH stability of native and modified papain2.5 原酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性的比較本文從動(dòng)力學(xué)的角度考察了原酶NP和修飾酶MP的熱穩(wěn)定性差異，它們的熱變性和溫度之間的關(guān)系見圖6，根據(jù)式(4)得知該圖中直線的斜率為酶變性的一級速率常數(shù)kd，根據(jù)式(5)可計(jì)算出的半衰期t1/2值，這些數(shù)據(jù)列于表2。從表中的kd值可以看出隨著溫度的升高，酶變性的速率也隨之迅速加快，但在同一溫度下修飾酶MP的熱變性速率明顯低于原酶NP的，因此它們的半衰期t1/2值有明顯差別，如60時(shí)原酶NP和修飾酶MP的t1

35、/2值分別為31.5和65.4 min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明修飾酶MP的熱穩(wěn)定性較原酶NP的得到了有效的提高，這與薛勇等4、Sangeetha等5報(bào)道的結(jié)果一致。作者曾用PA修飾辣根過氧化物酶10和PPL12也均能有效提高它們的熱穩(wěn)定性。關(guān)于化學(xué)修飾酶熱穩(wěn)定性提高的原因，不同學(xué)者從不同角度給出了一定的解釋，但都圍繞著酶分子被修飾后結(jié)構(gòu)發(fā)生變化作討論。如Baek等20認(rèn)為可能是由于酶分子與修飾劑分子發(fā)生共價(jià)連接后其天然構(gòu)象產(chǎn)生一定的“剛性”，不易伸展失活，并且減少了酶分子內(nèi)部基團(tuán)的熱振動(dòng)，從而使得沒的熱穩(wěn)定性提高；Gouda等21認(rèn)為酶分子與修飾劑分子發(fā)生共價(jià)連接后其分子結(jié)構(gòu)變得更加有序和致密，使酶分子

36、內(nèi)部的作用力增強(qiáng)，從而導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性提高。圖6 pH7.0時(shí)原酶和修飾酶熱變性的一級速率圖 Fig6 First-order plot of thermal denaturation of native and modified papain at pH7.0表2 原酶和修飾酶的熱變性參數(shù)Tab2 Parameters for denaturation of native and modified papain T/KNPMP/(min-1)/min/(min-1)/min3330.022031.50.010665.43430.040517.10.023329.73530.09407.40.0

37、63011.03630.2153.20.1744.0E0= 1.2510-7 molL-1，pH=7.0盡管圖6顯示原酶NP和修飾酶MP在60 以上的熱穩(wěn)定性明顯較差，易失活，但由于底物分子與酶分子的結(jié)合有利于提高酶蛋白的熱穩(wěn)定性14，因此原酶NP和修飾酶MP在高溫下仍有很高的活力，且它們的最適反應(yīng)溫度高達(dá)75 （見圖2b）。變性活化能Ea,d可以從熱力學(xué)的角度來揭示溫度對酶的變性速率的影響。圖7為原酶NP和修飾酶MP熱變性的Arrhenius圖，由圖中直線的斜率（-9265 K-1、-11369 K-1）可得到原酶NP和修飾酶MP的熱變性活化能Ea,d分別為77.0 kJmol-1和94.5

38、 kJmol-1，這說明修飾酶MP發(fā)生變性需要的能量較原酶NP的高，這從熱力學(xué)的角度進(jìn)一步解釋了修飾酶MP的熱穩(wěn)定性較高的原因。作者曾報(bào)道PPL經(jīng)PA修飾后熱變性活化能Ea,d增大的類似結(jié)果12。圖7 pH7.0時(shí)原酶和修飾酶熱變性的Arrhenius圖 Fig7. Arrhenius plot for thermal denaturation of native and modified papain at pH7.03. 結(jié)論木瓜蛋白酶經(jīng)PA化學(xué)修飾后，酶分子中約有5個(gè)lys殘基被修飾，這種小分子化學(xué)修飾引起了酶分子構(gòu)象發(fā)生了一定的變化，并且是朝著有利于酶與底物結(jié)合的方向變化。動(dòng)力學(xué)和熱力

39、學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明木瓜蛋白酶經(jīng)PA化學(xué)修飾后各種性質(zhì)得到了明顯的改善，如最適反應(yīng)pH提高了1.5個(gè)pH單位、酶的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性都得到了有效的提高，而這些性能的改善有利于拓寬木瓜蛋白酶的應(yīng)用范圍。由此可見，采用PA對木瓜蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾是一種改善木瓜蛋白酶性質(zhì)的溫和的、有效的方法。由于木瓜蛋白酶分子中有11個(gè)lys殘基，這5個(gè)被PA修飾的lys殘基的具體位點(diǎn)暫不清楚，另外PA修飾導(dǎo)致酶分子構(gòu)象變化的研究也比較籠統(tǒng)，這些都有待后續(xù)更深入研究。參考文獻(xiàn)1 Mitchell R E J, Chaiken I M, Smith E L. J. Biol. Chem.J, 1970, 245 (14)

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