16-2 NASBA檢測(cè)新技術(shù)簡(jiǎn)介

1、NASBA 檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)介高榮保中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所國(guó)家流感中心快速靈敏特異自動(dòng)化背 景 什么是 NASBA?核酸依賴(lài)性擴(kuò)增Nuclear acid sequence-based amplification，NASBA檢測(cè)技術(shù)是一項(xiàng)以RNA為模板進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增并能實(shí)時(shí)觀測(cè)結(jié)果的檢測(cè)方法，該技術(shù)的檢測(cè)反響有賴(lài)于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、噬菌體T7 RNA多聚酶、核糖核酸酶H、兩種特別設(shè)計(jì)的特異性寡核苷酸引物和分子信標(biāo)探針共同協(xié)作而完成。 酶混合物 Enzyme Cocktail逆轉(zhuǎn)錄酶核糖核酸酶HT7 RNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄酶: AMV 鳥(niǎo)骨髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶Avian Myeloblast

2、osis Virus Reverse Transcriptase ，AMV RT)，其具有以RNA，DNA或者RNA/DNA為模板合成DNA的功能。核糖核酸酶H (RNase H): RNase H (Ribonuclease H ) 能夠特異性降解DNA/RNA雜合子中RNA的磷酸二酯鍵，從而使DNA/RNA雜合子中的RNA降解。T7 RNA 聚合酶 T7 RNA 聚合酶是一種以DNA為模板合成RNA的聚合酶，其只有在有特異性的啟動(dòng)子序列存在的情況下才能發(fā)揮作用。引物和探針引物 1 (P1): 用于靶基因正義RNA)的特異性的反轉(zhuǎn)錄。其5端帶有一段T7啟動(dòng)子序列. 引物 2 (P2):用于靶

3、基因反義RNA)的特異性的反轉(zhuǎn)錄。探針: 一種分子信標(biāo)探針，其使檢測(cè)結(jié)果能過(guò)被實(shí)時(shí)觀察。FQGQF分子信標(biāo)探針作用原理Molecular beaconDNA probeNASBA RNAIsothermal amplificationHybridization促滅基團(tuán)熒光基團(tuán)LoopStem帶有頸環(huán)結(jié)構(gòu)兩端被修飾熒光基團(tuán)和熒光促滅基團(tuán)的雙鏈DNA探針特異性檢測(cè)序列l(wèi)oop長(zhǎng)度 為20-25bp6-7 bp頸部stem互補(bǔ)序列針對(duì)不同的靶基因可以使用不同的熒光標(biāo)記 GQF什么是分子信標(biāo)探針?反響分為兩個(gè)局部進(jìn)行 非循環(huán)相: RNADNA/RNA雜合體P1P2雙鏈DNAcDNARNARNA聚合酶A

4、MVRNaseHAMVP2循環(huán)相RNADNA/RNA雜合體P1P2雙鏈DNAcDNARNARNA聚合酶AMVRNaseHAMVP2RNA聚合酶RNA聚合酶FQNASBA反響原理oligo P2RTRTT7 RNAPanti-sense RNARNase Holigo P1oligo P1RNase H &oligo P2sense RNAT7 RNA polymeraseTarget specific molecular beaconsReverse TranscriptaseReverse TranscriptaseQFQFMolecular beacon hybridizationFQ非循

5、環(huán)相循環(huán)相FQF0102030405060Time (minutes)Normalized fluorescenceQFQFFQFQFFQWTICFluorescent signal (real-time)實(shí)時(shí)檢測(cè)分子信標(biāo)探針NASBARNA 為模板等溫持續(xù)擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物為單鏈RNA終產(chǎn)物中不含引物序列PCRDNA為模板不同溫度循環(huán)擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物為雙鏈DNA終產(chǎn)物中含有引物序列NASBA & PCRH5N1 NASBA特異性分析VirusesH5 N1H1N1(23)-H3N2(23)-Flu B(10)-H9N2(1)-ANHUI/1/2005/H5N1+GUANGDONG/1/2005/H5N

6、1+XINJIANG/1/2006/H5N1+臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果臨床標(biāo)本H5N1 NASBA檢測(cè)結(jié)果圖靈敏度分析樣本H5N110-1HA+10-2HA+10-3HA+10-4HA-100TCID50+10TCID50+10-1TCID50+10-2TCID50-NC-PC+Water-與Real-time RT-PCR比較 圖1: Real-time RT-PCR和H5N1 NASBA靈敏度分析結(jié)果圖Note：H5-10: 10TCID50; H5-1: 1TCID50; H5-10EXP1: 10-1 TCID50; H5-10EXP2: 10-2TCID50; NC: 陰性對(duì)照; PC:

7、陽(yáng)性對(duì)照H5N1 NASBA可信度分析SamplesCollecting timeH5 NASBA resultsN1 NASBA resultsVirus isolationNO.Contents1Throat swab08-11-2005+2Throat swab09-11-2005+3Throat swab07-01-20064Lung tissue12-01-2006+5Throat secretion12-01-2006+6Throat swab12-01-20067Tracheal Secretion12-01-2006+8Mouth washed liquid16-12-2006

8、+9Throat swab16-12-2006+10Tracheal Secretion19-01-2006+11Tracheal Secretion19-01-2006+12Lower respiratory extraction22-02-2006+13Throat swab25-01-200614Throat swab25-01-200615Tracheal Secretion22-02-2006+ND+16Throat swab22-02-2006+ND+17Throat swab22-02-2006+核酸提取局部：同RT-PCR梅里埃公司 NucliSense Basic Kit梅里

9、埃公司 H5N1 Reagent 梅里埃公司 Nulisens EasyQ 檢測(cè)分析系統(tǒng)主要試劑及耗材質(zhì)控設(shè)置陰性對(duì)照：同樣本同時(shí)提取樣本水陽(yáng)性對(duì)照：H5N1病毒核酸或試劑盒提供的體外轉(zhuǎn)錄RNA?？瞻讓?duì)照：RNase-free Water。酶Enzyme mix的稀釋?zhuān)好總€(gè)酶球共可檢測(cè)8個(gè)樣品，按照45L/酶球的酶稀釋液Enzdil buffer，用手指輕彈混勻不可用Votex劇烈振蕩，室溫放置待其溶解成無(wú)色透明液體。試劑名稱(chēng)體積/數(shù)量（8個(gè)反應(yīng)量）體積/數(shù)量（16個(gè)反應(yīng)量）Reagdil64L128LWater11L22LKCl13L26LPrimer/probe mix8L18LReagent1顆2顆反響體系反響檢測(cè)41 90min65 2min41 2min短暫離心混勻檢測(cè)儀EasyQ 分析儀Real-time PCR儀結(jié)果分析樣品檢測(cè)信號(hào)值WT signal：在擴(kuò)增過(guò)程中分子信標(biāo)探針與靶基因發(fā)生特異性結(jié)合后，產(chǎn)生熒光信號(hào)的熒光信號(hào)被收集經(jīng)軟件轉(zhuǎn)換后的強(qiáng)度值，即WT signal。閾值threshold：在NASBA 反響過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，閾值是判斷陰性或陽(yáng)性結(jié)果的熒光信號(hào)界線值，樣本熒光信號(hào)閾值者為陽(yáng)性，反之為陰性。 結(jié)果分析結(jié)果判斷：以倍的陰性對(duì)照熒光信號(hào)值作為陰性判斷的閾值，首先是質(zhì)控系統(tǒng)判斷，即陽(yáng)性對(duì)照WT Signal必須要大于閾值，空