藥物分析學：藥物的含量測定

1、第六章 藥物的含量測定第一節(jié) 概述1、藥物的含量是藥物質(zhì)量的主要指標含量測定（assay）理化方法測定 效價測定（assay of potency）生物學方法或酶學方法測定 2、化學原料藥的含量測定：強調(diào)測定結(jié)果的精密度 3、制劑的含量測定：偏重方法的選擇性4、藥典對藥物的含量限度的表示方法原料藥：以%表示（一般以干燥品或無水物計）凡未規(guī)定上限的，藥典凡例中規(guī)定，其含量上限不得超過101.0%按原料藥本身形式計算其含量由于藥物組成不定，需以另一種穩(wěn)定形式計算含量舉例地塞米松磷酸鈉 按干燥品計算，含C22H28FNaO8P應(yīng)為96.0%-102.0%硫酸慶大霉素 按無水物計算，每1mg的效價不得

2、少于590慶大霉素單位阿司匹林含C9H6O4不得少于99.5% 氫氧化鋁含氫氧化鋁按Al2O3計算，不得少于48.0%5、制劑的含量限度表示方法：按標示量計算標示量=規(guī)格量=處方量例：維生素B1注射液含維生素B1應(yīng)為標示量的95.0%105.0%直接用%含量規(guī)定范圍例：復方碘溶液 含 I 應(yīng)為4.50% 5.50% 含 KI 應(yīng)為9.5% 10.5%以重量規(guī)定含量范圍例：復方磺胺甲噁唑片磺胺甲噁唑 0.3600.440g /片 甲氧芐氨嘧啶72.088.0mg /片常用含量測定方法(2005年版ChP）第二節(jié) 容量分析法一、含量計算1、原料藥及以%表示的制劑（1）直接滴定法 樣品%=VFT/

3、W100%濃度校正因子 F=N實/N理滴定度T與1ml規(guī)定（理論）濃度的標準溶液所相當?shù)谋粶y物的mg數(shù)T=（M被測物 /a ） mol/L標準液（理論）a為與1摩爾被測物相當?shù)臉藴室耗枖?shù)。（2）剩余滴定法樣品%=（V空白 V樣 ) FT/ W100%方法：樣品 + 標準液1（過量定量）剩余的標準液1 + 標準液2回滴定 V2樣空白 + 標準液1（同樣量）剩余的標準液1 + 標準液2回滴定 V2空白2、相當于標示量%的計算公式（1）片劑：W為片粉重（2）針劑：W為注射液體積3、以重量/片計的計算公式例1 異煙肼含量測定稱取異煙肼約0.25g，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精

4、密量取25mL，加水50 mL與鹽酸20 mL，加甲基橙指示液1滴，用溴酸鉀滴定液(0.01667mol/L)緩緩滴定至粉紅色消失。已知：異煙肼取樣0.2545g ， 消耗溴酸鉀滴定液(F=1.005) 18.30mL，每1mL溴酸鉀滴定液（0.01667 mol/L）相當于3.429mg異煙肼。例2 司可巴比妥鈉的含量測定：取本品約0.1g, 精密稱定（0.1022g)，置250ml碘量瓶中，加水10mL，振搖使溶解，精密加溴滴定液（0.05mol/L）25 mL，再加鹽酸5 mL，立即密塞并振搖1分鐘，暗處靜置15分鐘后，微開瓶塞，加碘化鉀試液10 mL，立即密塞，搖勻，用硫代硫酸鈉滴定液

5、（0.1mol/L）滴定，至近終點時加淀粉指示液，繼續(xù)滴定至藍色消失，并將滴定結(jié)果用空白試驗校正。已知：樣品消耗硫代硫酸鈉滴定液（0.1mol/L）15.73 mL，空白試驗消耗23.21 mL，每1mL溴滴定液（0.05mol/L）相當于13.01mg的司可巴比妥鈉，硫代硫酸鈉滴定液F=1.038。例3 葡萄糖酸鈣片含量測定取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于葡萄糖酸鈣1g），置100ml量瓶中加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，加水75ml, 加氫氧化鈉試液15ml，用EDTA滴定液（0.05mol/L）滴定。每1mLEDTA滴定液（0.05mol/L

6、）相當于22.42mg的C12H22CaO14H2O。已知：20片重12.0640g，取片粉1.2058g，消耗EDTA滴定液(0.0501 mol/L)11.22mL，規(guī)格0.5g/片二、酸堿滴定法滴定類型多為強酸強堿滴定弱堿弱酸藥物，以鹽酸、硫酸、氫氧化鈉為滴定劑溶劑根據(jù)藥物的酸堿性、溶解度、穩(wěn)定性等性質(zhì)，選用水、中性乙醇等為溶劑 應(yīng)用以水為溶劑：枸櫞酸以中性乙醇為溶劑：芳酸類、磺酰胺類藥物指示劑、滴定劑酚酞，氫氧化鈉滴定液三、非水溶液滴定法本法主要用于測定有機堿及其氫鹵酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽或有機酸鹽，以及有機酸堿金屬鹽類藥物的含量，也用于測定某些有機弱酸的含量藥典收載了兩種方法：第一法為

7、測定有機弱堿及其鹽類第二法為測定有機弱酸及其鹽類常用非水溶劑種類第一法（非水堿量法）精密稱取供試品適量約消耗高氯酸滴定液（0.1mol/L）8mL，加冰醋酸1030mL使溶解，加各藥品項下規(guī)定的指示液12滴，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定。終點顏色應(yīng)以電位滴定時的突躍點為準，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正 1、影響因素：溫度、水分、溶劑的選擇、指示終點方法以及被測物酸根等（1）溫度影響滴定與標定時的溫度差別：超過10，則應(yīng)重新標定若未超過10，根據(jù)公式校正（2）水分影響反應(yīng)體系中不應(yīng)有水，因為水既是質(zhì)子的受體，又是質(zhì)子的供體，可與弱酸弱堿發(fā)生競爭，影響終點判斷（3）溶劑選擇對于不同堿性的

8、雜環(huán)類藥物只有選擇合適的溶劑和指示終點方法才能獲得滿意的滴定結(jié)果冰醋酸中加入不同量甲酸也能增大突躍范圍 （4）常用指示劑（結(jié)晶紫）結(jié)晶紫為多元弱堿，在不同pH中顯示不同的顏色變化，滴定不同強度的堿性藥物時終點顏色不同滴定堿性較強的藥物時，終點以藍色或藍綠色為主滴定堿性較弱的藥物時，一般以綠色為終點滴定更弱的堿性藥物時，終點顏色為黃色在確定指示劑的終點顏色變化時應(yīng)以電位法為對照（5）各種酸根的影響冰醋酸溶液中各酸根的酸性強弱如下： 高氯酸氫溴酸硫酸鹽酸硫酸氫根硝酸磷酸、有機酸采取措施：HX加 HgAc2 HgX2 H2SO4生物堿的硫酸鹽通常為2分子生物堿與1分 子硫酸成鹽,可直接滴定至HSO-

9、4 （注意摩爾比）HNO3 可氧化指示劑，改用電位法磷酸、有機酸無需處理，直接滴定2、應(yīng)用胺類藥物：鹽酸利多卡因，重酒石酸去甲腎上腺素，鹽酸克侖特羅、硫酸沙丁胺醇等含氮雜環(huán)類藥物：氫溴酸東莨菪堿、硫酸奎寧、硝酸毛果蕓香堿、馬來酸氯苯那敏等；維生素類藥物：維生素B1第二法 （酸量法）滴定液甲醇鈉、甲醇鋰、氫氧化四丁基胺溶劑二甲基甲酰胺 注意滴定過程中應(yīng)防止溶劑和堿滴定液吸收大氣中的二氧化碳和水蒸氣，以及滴定液中溶劑的揮發(fā)應(yīng)用異維A酸、芐氟噻嗪、環(huán)吡酮等 四、其他方法銀量法、碘量法和溴量法（直接滴定、剩余滴定、置換滴定）、亞硝酸鈉法、絡(luò)合滴定法費休氏水分測定法（Karl Fischer Titra

10、tion）1、本法為非水氧化還原滴定反應(yīng)，采用的滴定液稱費休氏試液，由碘、二氧化硫、吡啶和無水甲醇組成。利用碘氧化二氧化硫時需要一定的水分參加反應(yīng)2、反應(yīng)可逆，用吡啶吸收生成的HI和SO3，形成氫碘酸吡啶和硫酸酐吡啶。但硫酸酐吡啶不穩(wěn)定，無水甲醇可使其轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定的甲基硫酸氫吡啶 3、方法與計算測定方法：精密稱取供試品適量（約消耗費休氏試液15ml），除另有規(guī)定外，溶劑為無水甲醇，用水分測定儀直接測定?；?qū)⒐┰嚻分酶稍锏木呷Ｆ恐?，加溶?5ml，在不斷振搖（或攪拌）下用費休氏試液滴定至溶液由淺黃色變?yōu)榧t棕色，或用永停滴定法指示終點，另作空白試驗，按下式計算本法專屬性強，準確度高，適用于受熱易被

11、破壞的藥物的水分測定，如抗生素類藥物的水分測定4、注意事項：（1）每1ml新配的費休氏試液約相當于5mg的水，由于試液不穩(wěn)定，逐漸變質(zhì)，因此費休氏試液需在臨用前1h內(nèi)標定。一般F值應(yīng)在4.0mg/ml以上，當F值降低到3.0mg/ml以下時，滴定終點不敏銳，不宜再用。（2）本法測定結(jié)果的精確度取決于多種因素，如試劑成分的相對濃度、溶解樣品的溶劑性質(zhì)、操作技術(shù)、空氣濕度等，尤其是測定系統(tǒng)中的水分。因此必須嚴格規(guī)范操作，所用儀器必須干燥，并能避免空氣中水分的侵入，操作宜在干燥處進行，并注意避光，整個操作應(yīng)迅速，不應(yīng)在陰雨天或空氣濕度太大時進行測定。第三節(jié) 光譜分析一、紫外分光光度法（一）儀器校正與

12、檢定 1、波長校正：用汞燈中的較強譜線或儀器中氚燈的486.02nm、656.10nm譜線進行校正2、吸收度的準確度檢定：測定重鉻酸鉀的硫酸溶液在規(guī)定波長處的吸收系數(shù)進行檢定 3、雜散光的檢查：用碘化鈉，亞硝酸鈉溶液測定規(guī)定波長處的透光率（二）對溶劑的要求以空氣為空白（空白光路中不置任何物質(zhì)）測定溶劑的吸光度（使用波長附近應(yīng)符合規(guī)定）（三）測定法1、測定波長核對 （規(guī)定波長2 nm內(nèi)），并以吸光度最大波長為測定波長2、吸收度讀數(shù)范圍（0.3-0.7） 3、同批溶劑為空白試驗（校正比色皿和空白溶劑的吸收）4、測定方法：吸收系數(shù)法、對照品比較法、計算分光光度法、比色法（1）百分吸收系數(shù)法E值的大小

13、反映了藥物對某一波長光的吸收能力，也反映了測定反應(yīng)的靈敏度。采用E法測定含量時，一般取三位有效數(shù)字表示，E值小于100的一般不宜采用例1：己酸孕酮稱取己酸孕酮0.0105g, 加無水乙醇溶解后，置10ml容量瓶中,稀釋至刻度,搖勻。吸取1.00ml, 置100ml容量瓶中, 加無水乙醇稀釋至刻度, 置1cm吸收池內(nèi)進行測定, 根據(jù)下列已知條件, 求出按干燥品計算的己酸孕酮百分含量。A=0.390，E1%1cm=393吸收系數(shù)（E1%cm）測定方法：精密稱取被測物對照品適量（雙份），加溶劑制成一定濃度的溶液使吸光度在0.60.8之間精密吸取適量，用同批溶劑將溶液稀釋一倍在規(guī)定波長分別測定高低濃度

14、的溶液，計算吸收系數(shù)（E）值，要求：在五種不同型號的紫外儀上測定同一臺儀器測定二份間結(jié)果的偏差應(yīng)不超過1.0%各臺儀器測得的E值，RSD應(yīng)不超過1.5%取平均值為該藥物的吸收系數(shù)（注明測定時溫度）（2）對照品比較法雙波長法，差示法，熒光法，均可應(yīng)用此公式，以A，熒光強度代替吸收度A例2：鹽酸嗎啡片與注射液本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于鹽酸嗎啡10mg)置100ml量瓶中，加水溶解至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液15ml，置50ml量瓶中，加0.2mol/L氫氧化鈉25ml，用水稀釋至刻度，搖勻，UV法測定。另取嗎啡對照品適量，精密稱定，用0.2mol/L氫氧化鈉稀釋至每m

15、l中約含20ug的溶液，同法測定。計算，結(jié)果乘以1.317，即得C17H19NO3HCl3H2O的含量.(規(guī)格5mg)1.317=M3H2O/M=375.85/285.34方法的特點與影響因素：特點：簡便、快速、靈敏（10-410-7 g/ml）、有一定專屬性和準確度（相對誤差2%左右），應(yīng)用范圍廣（制劑含量、溶出度、含量均勻度測定），儀器價廉易普及影響因素：溶劑、溶液pH值（3）計算分光光度法雙波長分光光度法（復方磺胺類藥物的測定）三點校正法（維生素A的）解線性方程組法等使用時應(yīng)注意，當在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定吸光度時，波長的微小變化可對測定結(jié)果造成顯著影響（4）比色法在藥物分析

16、中應(yīng)用的比色法：酸性染料比色法（含氮堿性藥物如：硫酸阿托品片、氫溴酸東莨菪堿片的測定）四氮唑比色法、異煙肼比色法和Kober反應(yīng)法（甾體激素類藥物）蛋白質(zhì)的雙縮脲反應(yīng)（硫酸軟骨素的測定）總黃酮、總生物堿的測定（中藥制劑）二、熒光分光光度法（Fluorescence Spectrophotometry）熒光法測定的是物質(zhì)分子的發(fā)射光譜。在一定條件下，物質(zhì)的濃度與其熒光（也稱發(fā)射光）強度成正比關(guān)系，可用于定量分析 1、測定方法 對照品對照法熒光分析中，藥物的濃度與相應(yīng)的熒光讀數(shù)之間的線性范圍較窄，故(RxRxb)/(RrRrb)應(yīng)在0.52，如超出此范圍，應(yīng)調(diào)節(jié)溶液濃度后再測定 2、熒光分析法的特

17、點靈敏（檢測限可達10-1010-12g/ml）專屬（ex和em）適于低濃度溶液分析。濃度過大，熒光會發(fā)生“自熄滅”現(xiàn)象，導致熒光強度與溶液濃度不成正比 干擾因素多，如溶劑種類與純度、溶液pH、溫度，共存物質(zhì)、溶液中的懸浮物、玻璃儀器的潔凈度等，因此必須做空白試驗常用基準溶液校正儀器，如：硫酸奎寧的稀硫酸溶液（藍色熒光）熒光素鈉水溶液（黃綠色熒光）羅丹明B水溶液（紅色熒光）三、原子吸收分光光度法（Atomic Absorption Spectrophotometry，AAS）1、原理由待測元素作為陰極的空心陰極燈發(fā)出的特征譜線，通過供試品經(jīng)原子化產(chǎn)生的原子蒸氣時，被蒸氣中待測元素的基態(tài)原子所吸

18、收，測定該特征譜線輻射光強度減弱的程度，求出供試品中待測元素的含量2、遵循一般分光光度法的吸收定律。用于呈原子狀態(tài)的金屬元素和部分非金屬元素的測定3、含量測定方法采用標準曲線法和標準加入法（1）標準曲線法制備含待測元素的對照品溶液至少3份，濃度依次遞增，并分別加入各品種項下制備供試品溶液的相應(yīng)試劑，同時以相應(yīng)試劑制備空白對照液依次測定空白對照液和各濃度對照品溶液的吸光度，記錄讀數(shù)（3次），繪制標準曲線制備供試品溶液，測定吸光度，取3次讀數(shù)的平均值，從標準曲線上查得相應(yīng)的濃度，計算元素的含量 （2）標準加入法取同體積按規(guī)定制備的供試品溶液4份，分別置4個同體積的量瓶中除1號量瓶外，其他量瓶分別精

19、密加入不同濃度的待測元素對照品溶液,分別用去離子水稀釋至刻度制成從零開始遞增的一系列溶液4、AAS法的局限性主要是工作曲線的線性范圍較窄，一般為1個數(shù)量級；每測一種元素需要更換1個燈，對于多種元素同時測定時非常不便第四節(jié) 色譜分析一、HPLC法根據(jù)固定相與流動相的極性大小，分為： NP-HPLC以吸附機理為主 RP-HPLC以分配機理為主RP-HPLC法適合于中等極性或非極性的弱酸、弱堿和中性化合物的分離分析絕大部分藥物均可用RP-HPLC法進行分析1、RP-HPLC（1）色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠（ODS或C18、C8柱、氨基柱、氰基柱等（2）流動相：甲醇-水（或緩沖鹽）、乙腈-水（或緩沖

20、鹽）、四氫呋喃-水（或緩沖鹽）（過濾脫氣） （用過緩沖鹽或酸堿流動相后，色譜柱必須用低濃度甲醇液沖洗，以除去酸堿鹽，然后再用甲醇沖洗）洗脫力強弱依次為四氫呋喃乙腈甲醇水 （3）化學鍵合固定相適用pH2-8的流動相；C18 鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展狀態(tài)，故流動相中有機溶劑的比例應(yīng)不低于5%，否則C18鏈的隨機卷曲將導致組分保留值的變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定（4）色譜條件選擇調(diào)節(jié)流動相中有機溶劑比例可調(diào)整被測物的保留時間，近似規(guī)則：流動相中有機溶劑降低10%，溶質(zhì)的容量因子約增加3倍40%甲醇的強度33%乙腈23%四氫呋喃也可用三種、四種混合溶劑作為流動相 2、NP-HPLCNP-HPLC硅膠柱流

21、動相溶劑有：正己烷-異丙醇；正己烷-乙醇；正己烷-二氯甲烷等洗脫力強弱依次為乙醇異丙醇二氯甲烷正己烷正反相色譜相互轉(zhuǎn)換時，須用過渡溶劑依次沖洗如由反相正相時，依次用甲醇異丙醇正己烷沖洗而由正相反相時，則以反方向進行沖洗 3、檢測器（1）選擇性檢測器紫外、二極管陣列（DAD）、熒光、電化學響應(yīng)值與待測液濃度有關(guān)，還與化合物結(jié)構(gòu)有關(guān)（2）通用型檢測器示差折光、蒸發(fā)光散射檢測器對所有的化合物均有響應(yīng)更專屬、更靈敏的檢測器質(zhì)譜不同檢測器對流動相的要求不同，如紫外檢測器應(yīng)考慮有機溶劑的截止使用波長蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相4、系統(tǒng)適用性試驗（1）柱效： （2）分離度：

22、（3）拖尾因子： (T=0.951.05)（4）重復性：取對照溶液，連續(xù)進樣5次，測得峰面積相對標準差RSD應(yīng)小于2.0%系統(tǒng)的精密度：每次開機后，首先要做的日常工作，不能作為分析方法學研究中的精密度試驗5、色譜參數(shù)測量為滿足系統(tǒng)適用性試驗要求，可以改變一些條件，如色譜柱內(nèi)徑、長度、牌號、載體粒度、流動相流速、組成比例、柱溫等，但不能改變固定相種類， 流動相組成和檢測器類型6、測定方法與應(yīng)用定量方法內(nèi)標法和外標法HPLC法是藥物制劑、多組分樣品分析的首選方法，是各國藥典收載的方法中應(yīng)用最廣的方法在原料藥的含量測定中，HPLC法主要用于多組分抗生素或生化藥品，或因所含雜質(zhì)的干擾測定，而常規(guī)方法又

23、難以分離或分離手段繁雜的化學品種。如：慶大霉素的組分測定，-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類等抗生素的含量測定甾體激素類藥物的含量測定 例：醋酸氫化可的松的含量測定取對照品適量，精密稱定，加甲醇定量稀釋成每1mL中約含0.35mg的溶液。精密量取該溶液和內(nèi)標溶液（0.30mg/mL炔諾酮甲醇溶液）各5mL，置25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，取10L注入液相色譜儀。另取本品適量，同法測定，按內(nèi)標法計算含量。已知：對照品取樣36.2mg，樣品取樣35.5mg，測得對照液中醋酸氫化可的松和內(nèi)標的峰面積分別為5467824和6125843，樣品液中兩者的峰面積分別為5221345和6122845，求本品含量？二、GC法1、色譜柱分為填充柱和毛細管柱2、載氣有氮氣、氦氣和氫氣由高純度氣體發(fā)生器或高壓鋼瓶提供，經(jīng)過適當減壓、除濕和純