一、二、三代測(cè)序技術(shù)

1、一代、二代、三代測(cè)序技術(shù)第一代測(cè)序技術(shù)-Sanger鏈終止法一代測(cè)序技術(shù)是20世紀(jì)70年代中期由Fred Sanger及其同事首先發(fā)明。其基 本原理是，聚丙烯酰胺凝膠電泳能夠把長(zhǎng)度只差一個(gè)核苷酸的單鏈DNA分子區(qū) 分開來。一代測(cè)序?qū)嶒?yàn)的起始材料是均一的單鏈DNA分子。第一步是短寡聚核 苷酸在每個(gè)分子的相同位置上退火，然后該寡聚核苷酸就充當(dāng)弓物來合成與模板 互補(bǔ)的新的DNA鏈。用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑（雙脫氧核苷酸在脫氧核 糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3-OH基團(tuán)，所以可被用作鏈終止試劑）通過 聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子后再進(jìn)行分離的方法。測(cè)序引物與 單鏈DNA模板分子結(jié)合后，

2、DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應(yīng)分四組 進(jìn)行，每一組分別用四種ddNTP （雙脫氧核苷酸）中的一種來進(jìn)行終止，再用 PAGE分析四組樣品。從得到的PAGE膠上可以讀出我們需要的序列。第二代測(cè)序技術(shù)-大規(guī)模平行測(cè)序大規(guī)模平行測(cè)序平臺(tái)（massively parallel DNA sequencing platform ）的出 現(xiàn)不僅令DNA測(cè)序費(fèi)用降到了以前的百分之一，還讓基因組測(cè)序這項(xiàng)以前專屬 于大型測(cè)序中心的“特權(quán)”能夠被眾多研究人員分享。新一代DNA測(cè)序技術(shù)有 助于人們以更低廉的價(jià)格，更全面、更深入地分析基因組、轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)之間 交互作用組的各項(xiàng)數(shù)據(jù)。市面上出現(xiàn)了很多新一代測(cè)序儀

3、產(chǎn)品，例如美國(guó)RocheApplied Science公司的454基因組測(cè)序儀、美國(guó)Illumina公司和英國(guó)Solexa technology公司合作開發(fā)的Illumina測(cè)序儀、美國(guó)Applied Biosystems公司 的SOLiD測(cè)序儀。Illumina/Solexa Genome Analyzer測(cè)序的基本原理是邊合 成邊測(cè)序。在Sanger等測(cè)序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光 標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì) 釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲 得待測(cè)DNA的序列信息。以Illumina測(cè)

4、序儀說明二代測(cè)序的一般流程，（1） 文庫(kù)制備，將DNA用霧化或超聲波隨機(jī)片段化成幾百堿基或更短的小片段。用 聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化并增加一個(gè)核苷酸 黏性末端。然后將Illumina測(cè)序接頭與片段連接。（2）簇的創(chuàng)建，將模板分子 加入芯片用于產(chǎn)生克隆簇和測(cè)序循環(huán)。芯片有8個(gè)縱向泳道的硅基片。每個(gè)泳道 內(nèi)芯片表面有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA片段變 性成單鏈后與測(cè)序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。 通過不斷循環(huán)獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測(cè)片段。（3）測(cè)序，分三步：DNA 聚合酶結(jié)合熒光可逆終止子，熒光標(biāo)記簇成像，在下

5、一個(gè)循環(huán)開始前將結(jié)合的核 苷酸剪切并分解。（4）數(shù)據(jù)分析第三代測(cè)序技術(shù)-高通量、單分子測(cè)序被稱為第三代的測(cè)序的He-licos單分子測(cè)序儀，PacificBioscience的SMRT技 術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)正向 著高通量低成本長(zhǎng)讀取長(zhǎng)度的方向發(fā)展。不同于第二代測(cè)序依賴于DNA模板 與固體表面相結(jié)合然后邊合成邊測(cè)序，第三代分子測(cè)序，不需要進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(1)Helico BioScience單分子測(cè)序技術(shù)。該測(cè)序是基于邊合成邊測(cè)序的思想， 將待測(cè)序列隨機(jī)打斷成小分子片段并用末端轉(zhuǎn)移酶在3末端加上poly(A)，以 及在

6、poly(A)的末端進(jìn)行熒光標(biāo)記和阻斷，把這些小片段與帶有poly(T)的平板 雜交成像來獲得已經(jīng)雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測(cè)序的位點(diǎn)加入聚合 酶和被Cy3熒光標(biāo)記脫氧核苷酸進(jìn)行DNA合成，每次只加入一種脫氧核苷酸， 然后將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對(duì)Cy3成像，觀測(cè)模板 位點(diǎn)上是否有熒光信號(hào)，然后化學(xué)裂解核苷酸上的燃料并釋放加入下一種脫氧 核苷酸和聚合酶的混合物，進(jìn)行下一輪反應(yīng)。(2)Pacific BioscienceSMRTT技 術(shù)。該測(cè)序也是基于邊合成邊測(cè)序的原理，這項(xiàng)技于使用了 Zero-ModeWaveguide(ZMW)(零級(jí)波導(dǎo))。測(cè)序的過程：被熒光標(biāo)記

7、磷酸集團(tuán) 的核苷酸在聚合酶活性位點(diǎn)上與模板鏈結(jié)合(每種脫氧核苷酸被不用顏色的染料 標(biāo)記)，被激發(fā)出熒光，在熒光脈沖結(jié)束后，被標(biāo)記的磷酸集團(tuán)被切割并釋放，聚 合酶轉(zhuǎn)移到下一個(gè)位置，下一個(gè)脫氧核苷酸連接到位點(diǎn)上開始釋放熒光脈沖，進(jìn) 行下一個(gè)循環(huán)。(3)Oxford Nanopore Technologies的納米孔單分子測(cè)序 技術(shù)。大多數(shù)納米孔測(cè)序技術(shù)的基本原理是當(dāng)DNA分子或者它的組成堿基從一 個(gè)孔洞經(jīng)過時(shí)而檢測(cè)到被影響的電流或光信號(hào)。OxfordNanopore測(cè)序技術(shù)是 以a-溶血素來構(gòu)建生物納米孔，核酸外切酶依附在孔一側(cè)的夕卜表面，一種合成 的環(huán)糊精做為傳感器共價(jià)結(jié)合到納米孔的內(nèi)表面。這個(gè)系統(tǒng)被鑲嵌在一個(gè)脂雙分 子層內(nèi)，為了提供既符合堿基區(qū)分檢測(cè)又滿足外切酶活性的物理?xiàng)l件，脂雙分子 層兩側(cè)為不同的鹽濃度在適合的電壓下，核酸外切酶消化單鏈DNA，單個(gè)堿 基落入孔中，并與孔內(nèi)的環(huán)糊精短暫的相互作用，影響了流過納米孔原本的電流， 腺嘌呤與胸腺嘧啶的電信號(hào)大小很相近，但胸腺嘧啶在環(huán)糊精停留是時(shí)間是其他 核苷酸的2-3倍所以每個(gè)堿基都因其產(chǎn)生電流干擾振幅是特有的而被區(qū)分開來。總結(jié)：第一代指雙脫氧末端終止法，擴(kuò)增后通過毛細(xì)管電泳讀取序列，每次獲取數(shù)據(jù)量 少第二代為高通量測(cè)序，采用微珠或高密度芯片邊合成邊測(cè)序，代表有454，solexa， s