土壤中微生物的分離純化(課堂PPT)課件

1、實(shí)驗(yàn)十二 土壤中微生物的分離及純化 （設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)）1一、目的要求 1、掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化微生物的基本操作技術(shù)；2、初步觀察來(lái)自土壤中的三大類(lèi)群微生物的菌落形態(tài)特征；3、學(xué)習(xí)平板菌落計(jì)數(shù)的基本原理和方法，并掌握其基本技能。 2二、基本原理（一）土壤是微生物生存的大本營(yíng)，所含微生物無(wú)論是數(shù)量還是種類(lèi)都是極其豐富的，原因是什么？ 由于土壤具備了各種微生物生長(zhǎng)發(fā)育所需要的營(yíng)養(yǎng)、水分、空氣、酸堿度、滲透壓和溫度等條件，所以成了微生物生活的良好環(huán)境?？梢哉f(shuō)，土壤是微生物的“天然培養(yǎng)基”，也是它們的“大本營(yíng)”因此，土壤是微生物多樣性的重要場(chǎng)所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，人們可與從中分離、

2、純化獲得許多有價(jià)值的菌株。 3（二）如何分離？ 在土壤、水、空氣或人及動(dòng)、植物體中，不同種類(lèi)的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類(lèi)群中分離它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱(chēng)為微生物的分離與純化。 為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長(zhǎng)，而抑制其他菌生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或平板劃線分離法等分離、純化該微生物，直至得到純菌株。 從微生物群體中經(jīng)分離、生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是

3、純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征等綜合考慮。有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過(guò)一系列的分離與純化過(guò)程和多種特征（產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況、染色情況、營(yíng)養(yǎng)要求、氧氣需求、酸堿度、滲透壓和溫度等）鑒定方能得到。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物的分離與純化。 4（三）平板菌落計(jì)數(shù)法的原理 將待測(cè)菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋?zhuān)坎荚谄桨迳?，?jīng)過(guò)培養(yǎng)后在平板上形成肉眼可見(jiàn)的菌落。統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量計(jì)算出樣品中細(xì)胞密度（一般選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有50-200個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的含菌量較為合適）。 由于待測(cè)樣品往往不易完全分散成單個(gè)細(xì)胞，平板上形成的

4、每個(gè)菌落不一定是單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖而成，有的可能來(lái)自兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。因此，平板菌落記數(shù)的結(jié)果往往比樣品中實(shí)際細(xì)胞數(shù)低，這就是現(xiàn)在使用菌落形成單位取代以前用絕對(duì)菌落數(shù)來(lái)表示樣品活菌含量的原因。 該法雖然操作較繁瑣，結(jié)果需要培養(yǎng)一段時(shí)間才能獲得，而且測(cè)定結(jié)果易受多種因素的影響，但是，由于該方法能直接反映樣品中活細(xì)胞數(shù)量，所以被廣泛用于生物制品（如活菌制劑）、食品、飲料、水（包括水源水）以及多類(lèi)產(chǎn)品等質(zhì)量檢測(cè)與控制的標(biāo)準(zhǔn)方法。快速細(xì)菌自動(dòng)稀釋儀和自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀則提供快速準(zhǔn)確的結(jié)果。 5培養(yǎng)基的類(lèi)型？6三、實(shí)驗(yàn)器材1、土壤樣品（自帶）2、培養(yǎng)基：淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏號(hào)培養(yǎng)基），牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，馬

5、丁氏瓊脂培養(yǎng)基。3、溶液和試劑：10酚，鏈霉素，盛9ml無(wú)菌水的試管，盛99ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶。4、儀器和其他用品：無(wú)菌玻璃涂棒，無(wú)菌吸管，無(wú)菌培養(yǎng)皿等。 7四、操作步驟 1、倒平板 標(biāo)記，最好寫(xiě)在皿底邊上，以防蓋子蓋錯(cuò)； 加熱熔化三種培養(yǎng)基，冷至5560時(shí)，在高氏號(hào)培養(yǎng)基中加入10酚數(shù)滴，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基中加入鏈霉素溶液（終質(zhì)量濃度為30ul/mg），混勻后看清標(biāo)記分別倒平板，在火焰附近，每皿倒1520ml，靜置凝固后備用；(若皿蓋上冷凝水過(guò)多，最好用滅菌棉花或滅菌紙擦后再涂布)82、稀釋土樣 制備土壤稀釋液稱(chēng)取土樣10g，放入盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約2

6、0分鐘，使土樣與水充分混合，將菌分散。用一支1ml無(wú)菌吸管從中吸取1ml土壤懸液注入盛有9ml無(wú)菌水的試管中，吹吸三次，使充分混勻。然后再用一支1ml無(wú)菌吸管從此試管中吸取1ml注入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，以此類(lèi)推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各種稀釋度的土壤溶液。 減小誤差應(yīng)注意的方面： 稱(chēng)量準(zhǔn)確； 土樣與水混合，一定要搖勻； 每次稀釋取液應(yīng)換一支新的吸管； 每次取液時(shí)應(yīng)先混勻試管中的溶液； 9各培養(yǎng)基涂布菌液時(shí)對(duì)稀釋度的選擇： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基10-4、10-5、10-6； 高氏一號(hào)培養(yǎng)基： 10-3、10-4、10-5； 馬鈴薯培養(yǎng)基： 10-2、

7、10-3、10-4； 平板菌落計(jì)數(shù)法，所選擇倒平板的稀釋度是很重要的。一般以三個(gè)連續(xù)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度倒平板培養(yǎng)后所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為好，否則要適當(dāng)增加或減少稀釋度加以調(diào)整。10平板分離113、涂布： 標(biāo)記：選擇3個(gè)稀釋度寫(xiě)在平板底部； 取樣：每皿準(zhǔn)確取懸液0.2ml，放于平板中央；（注意每次取液時(shí)應(yīng)先混勻試管中的溶液） 涂布：在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，其方法是將菌液先沿一條直線輕輕地來(lái)回推動(dòng)，使之分布均勻，然后改變方向90沿另一垂直線來(lái)回推動(dòng)，平板內(nèi)緣處可改變方向用涂棒再涂布幾次，室溫下靜置510分鐘； 注意涂棒的正確使用。 124、培養(yǎng)： 將含高氏號(hào)培養(yǎng)基和馬丁氏瓊脂培養(yǎng)

8、基的平板倒置于28溫室中培養(yǎng)35天，牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板倒置于37溫室中培養(yǎng)12天。5、記數(shù)： 培養(yǎng)48h后，取出培養(yǎng)平板，算出同一稀釋度三個(gè)平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算， 每毫升中菌落形成單位(cfu) =同一稀釋度三次重復(fù)的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)56、鏡檢純培養(yǎng)：挑菌落將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取接種到上述三種培養(yǎng)基的斜面上，分別置28和37溫室中培養(yǎng)，待菌苔長(zhǎng)出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其他雜菌混雜，就要再一次進(jìn)行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。 13五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告、將培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果填入表格（實(shí)驗(yàn)教材P34表II-5）、你所做的涂布平板法是否較好地得到了單菌落？如果不是，請(qǐng)分析其原因。、在種不同的平板上你分離得到那些類(lèi)群的微生物？簡(jiǎn)述它們的菌落形態(tài)特征。 14六、思考題1、如何確定平板上單個(gè)菌落是否為純培養(yǎng)？請(qǐng)寫(xiě)出實(shí)驗(yàn)的主要步驟。2、如果要分離得到極端嗜鹽細(xì)菌，在什么地方取樣，分離培養(yǎng)基有何特點(diǎn)？說(shuō)明理由。3、怎樣判斷稀釋涂布平板計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)是否可靠