唐山師范學院綜合性

1、唐山師范學院綜合性-設計性實驗項目申報表作者:日期:唐山師范學院綜合性、設計性實驗項目申報表申報單位名稱：生命科學系2007年月曰實驗項目名稱唾液淀粉酶活性分析實驗項目性質V綜合性設計性所屬課程生物化學實驗開設學期第3學期綜合/設計性實驗學時數(shù)5實驗室名稱生物化學及植物生理學實驗室地點5401每組人數(shù)4項目負責人李春香聯(lián)系電話經(jīng)費預算（兀）500詳細說明該實驗涉及哪些知識點1、唾液淀粉酶的制備2、環(huán)境條件對唾液淀粉酶活性的影響3、唾液淀粉酶的專一性4、唾液淀粉酶活性的測定參加實驗指導人員李春香、張淑紅、咼鳳菊實驗項目建設進度安排2007年6月：申報實驗項目2007年6月2007年9月：準備試驗

2、材料及儀器，完善各項準備工作2007年10月：首次開設試驗項目，進行效果分析主要儀器設備分光光度計恒溫水浴鍋電爐實驗內容及擬達到的培養(yǎng)目標實驗內容：學生自制唾液淀粉酶，分析影響唾液淀粉酶活性的環(huán)境條件，并在得出的最適條件下測定唾液淀粉酶的活性。培養(yǎng)目標：通過實驗內容的學習，使學生從整體掌握酶學的基本知識以及測定酶活性的基本思路和方法；通過實驗結果的分析，培養(yǎng)學生獨立分析問題的能力。系論證意見系主任簽名：（蓋章）年月日主管部門意見（蓋章）年月日綜合性、設計性實驗項目指導書生物化學實驗實驗項目：唾液淀粉酶活性分析張淑紅編寫適用專業(yè)：生物科學生物技術唐山師范學院生命科學系2007年5月實驗學時：5學

3、時實驗類型：綜合性每組人數(shù)：_5_人/組一、實驗目的1、通過本實驗的學習，使學生掌握酶學的基本知識，特別是唾液淀粉酶酶活性的測定方法。2、通過實驗結果的分析，培養(yǎng)學生獨立分析問題的能力，為今后的學習和科研工作奠定基礎。二、實驗原理1、影響酶促反應的因素淀粉受唾液淀粉酶的作用水解成麥芽糖和少量葡萄糖。通常以測定淀粉水解的程度（底物減少）或麥芽糖生成的數(shù)量（產(chǎn)物增加）來衡量淀粉酶的活性。淀粉經(jīng)淀粉酶水解后得到分子大小不相同的糊精，糊精遇碘生成不同的顏色。隨著糊精分子量的降低依次為藍色、紫色、暗褐色或紅色、無色。酶的活性受溫度的雙重影響。低溫時酶活性表現(xiàn)較低，在一定范圍內，酶活性隨溫度上升而增高。通

4、常每升高10C，反應速度增加一倍左右；另一方面，溫度越高使酶蛋白變性越快，致使酶活性隨溫度上升而降低，以致完全喪失活性。當酶促反應速度達到最大值時的溫度，稱為酶作用的最適溫度。本實驗以唾液淀粉酶對淀粉的水解作用為例，觀察0C、37C和100C三種溫度對酶活性的影響。實驗中各管除溫度外，其它反應條件皆相同。唾液淀粉酶可催化淀粉逐步水解成各種不同大小的糊精及麥芽糖。它們遇碘呈現(xiàn)不同的顏色反應，故可利用碘反應的顏色對比來判定不同溫度下酶活性的大小。酶的活性受環(huán)境pH的影響極為顯著。因pH影響酶蛋白和底物的解離狀態(tài)，從而明顯改變酶與底物的結合和催化作用。每一種酶在一定的條件下都有它發(fā)揮作用的最適pH，

5、此時酶的活性最大。當其它條件相同時，離最適pH越近，其活性越大，即所催化的反應速度越快。本實驗利用唾液淀粉酶對淀粉的水解作用，在其它條件相同時，對比觀察pH變化對酶活性的影響，用碘反應判斷結果。另外激活劑和抑制劑對酶活也具有一定的影響，能增高酶活性的物質稱為酶的激活劑，能降低酶活性卻又不使酶變性的物質叫酶的抑制劑。2、酶作用的專一性2+麥芽糖和葡萄糖都具有還原性，能使班氏試劑中的二價銅離子（Cu）還原成一價銅離子（Cu+）生成磚紅色的氧化亞銅沉淀。而蔗糖不能被水解也不具有還原性，故不能被班氏試劑還原。利用此性質可以檢測唾液淀粉酶的專一性。3、酶活性的測定酶活力也稱酶活性，是以在最適溫度、最適p

6、H等條件下，催化一定的化學反應的初速度來表示。本實驗是以一定量的唾液淀粉酶液在實驗得出的最佳條件下，在一定的初始時間里將淀粉還原為還原糖，然后通過與DNS試劑作用，比色測定，求得還原糖的生成量，從而計算出酶反應的初速度，即酶的活力。這里規(guī)定，在最佳實驗條件下每分鐘水解淀粉生成1mg還原糖作為一個淀粉酶活力單位，記為1U。在NaOH和丙三醇存在下，3,5-二硝基水楊酸（DNS）與還原糖共熱后被還原生成氨基化合物。在過量的NaOH堿性溶液中此化合物呈桔紅色，在540nm波長處有最大吸收，在一定的濃度范圍內，還原糖的量與光吸收值呈線性關系，利用比色法可測定樣品中的含糖量。三、實驗方案（一）唾液淀粉酶

7、的制備1、每人取一個干凈的飲水杯，裝上蒸餾水。2、先用蒸餾水漱口，將口腔內的食物殘渣清除干凈。3、口含約5mL蒸餾水，做咀嚼動作12min，以分泌較多的唾液。然后將口腔中的唾液吐入一個干凈的小燒杯中。稀釋至100mL，備用。（二）溫度對酶活性的影響1、準備好37C水浴、冰水浴及沸水浴，白瓷板中加碘液備用。2、取小試管4支，編號，各加1%淀粉溶液30滴，pH6.8緩沖液10滴。1號管做對照，2號管放37C水浴，3號管放冰水浴，4號管放沸水浴中，各預溫10min3、向1號管加蒸餾水10滴，向2、3和4號管各加稀釋唾液10滴，混勻，仍放原水浴中。4、5min后由2號管每隔一定時間（1或2min），取

8、液一滴于白瓷凹板上做碘反應，觀察并記錄顏色變化情況，到碘反應接近淺紅色時，取出各管，包括1號管，分別各取1滴做碘反應，觀察對比結果。5、把4支試管均放入37E水浴中，510min后取出，向各管內加碘液2滴，混勻，觀察結果。綜合分析所測三種溫度下的酶活性情況，并以1號管為對照說明冰水浴及沸水浴兩溫度對酶活性影響的異同，得出唾液淀粉酶的最適反應溫度。（三）pH對酶活性的影響1、白瓷板中加碘液備用，準備好37C水浴。2、取小試管4支，編號，按下表加入試劑，混勻。AvV口呂號12341%淀粉（d）303030300.1mol/L磷酸鹽緩沖液（d）10101010(pH5.0)(pH6.8)(pH8)(

9、pH6.8)3、4號管加稀釋唾液10滴,放37E水浴中，記時，每隔1由第4號試管中取出1滴溶液做碘反應，待碘反應呈淺紅色或橙黃色時，取出試管，記錄保溫時間。4、13號試管放入37E水浴中，以1min間隔，并記錄時間，依次向1至3號管中加入稀釋唾液10滴，搖勻，按照4號管的保溫時間，以1min間隔，依次取出各管，并立即加碘液2滴，混勻。觀察各管呈現(xiàn)的顏色，判斷在不同pH下淀粉被水解的程度，分析pH對淀粉酶活性的影響，并確定其最適pH。（四）取4支試管，按下表編號后進行實驗。AvV口呂號12340.1%淀粉溶液（d）30303030稀釋的新鮮唾液（d）101010101%NaCI溶液（d）101%

10、CuS04溶液（d）一10一一1%Na2SO4溶液（d）一一10一蒸餾水（d）一一一1037C恒溫水浴中保溫10minKI12溶液（d）23232323現(xiàn)象）酶的專一性取試管3支，編號，按下表操作：AvV口呂號1231%淀粉（d）1010一1%蔗糖（d）一一10pH6.8緩沖液（d）101010稀釋唾液（d）5一5煮沸的唾液（d）5班氏試劑（202020各管混勻后，置37C水浴中保溫10min將上述各管放沸水浴中煮沸35分鐘，觀察結果。（六）唾液淀粉酶活性的測定1、標準曲線的制備取6支試管，按下表加入1.0mg/mL葡萄糖標準液和蒸餾水項目空白12345葡萄糖溶液（mL）00.20.30.40

11、.50.6蒸餾水（mL）32.82.72.62.52.4葡萄糖的濃度（mg/mL）01/151/102/151/63/15加熱沸水浴加熱5分鐘冷卻立即用冷水冷卻光密度（OD540）取出后用流動水迅速冷卻，在540nm波長處測定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標，光吸收值為縱坐標，繪制標準曲線2、唾液淀粉酶活性的測定1234最適pH值緩沖液（mL）11111%淀粉溶液0.3%NaCI(mL)1111唾液淀粉酶（mL）1110蒸餾水（mL）0001酶促反應搖勻，最適溫度下水浴5minDNS試齊U(mL)2222顯色反應沸水浴5min取出后用流動水迅速冷卻，稀釋一定倍數(shù)，搖勻，在540nm

12、波長處測定光吸收值。測定后，取樣品的光吸收平均值在標準曲線上查出相應的糖含量，計算酶的活性。四、主要儀器及試劑（一）試劑1、1%淀粉2、0.1mol/LpH5-8磷酸鹽緩沖液：分別配制下列二液，再按下表混合后加水稀釋一倍即可。（1）0.2mol/LNaH2PO4液：稱取NaH2PO4-2H2O31.2g，加水準確定溶至1000mL。（2）0.2mol/LNa2HPO412H2O71.64g，加水準確定溶至1000mL。pH0.2moI/LNaH2PO4(mL)0.2moI/LNa2HPO4(mL)598.11.96.851.049.085.394.73、碘液：碘化鉀1g加少許水溶解后，再加碘0

13、.5g，溶后加水至100mL，混勻。用時加水稀釋10倍。4、0.1%淀粉溶液5、1%NaCI溶液6、1%CuSCh溶液7、1%Na?SO4溶液81%蔗糖9、班氏試劑：檸檬酸鈉173g和碳酸鈉100g溶于約700mL水中，另將硫酸銅17.3g溶于100mL水中?？煞謩e加熱助溶。冷卻后將兩液混合，再加水至1000mL混勻。10、3,5二硝基水楊酸（DNS）試劑：稱取6.5gDNS溶于少量熱蒸餾水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氫氧化鈉溶液325mL,再加入45g丙三醇，搖勻，冷卻后定容至1000mL。11、葡萄糖標準溶液：準確稱取干燥恒重的葡萄糖100mg，加少量蒸餾水溶解后，以蒸餾水定容至100mL，即含葡萄糖為1.0mg/mL。12、1%淀粉0.3%NaCl（二）儀器水浴鍋；電爐；分光光度計五、實驗要求要求學生預習生物化學教材中酶學一章的內容，特別是影響酶促反應因素一節(jié)。并且查閱資料了解DNS法測定還原糖的原理。六、思考題1、比色時為什么要設計空白管？2、進行酶學實驗必須注意控制哪些條件？為什么？七、實驗報告實驗報告是實驗的總結和匯報，通過實驗報告的寫作可以分析總結實驗的經(jīng)驗和問題，學會處理各種實驗數(shù)據(jù)的方法，加深對生物化學實驗的理解和掌握，同時也是學習撰寫科學研究論文的過程。實驗報告的格式應為：1、實驗目