基因診斷(1)ppt課件

1、基因診斷Gene Diagnosis . 20世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)DNA是遺傳物質(zhì)以及50年代DNA的雙螺旋構(gòu)造被發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步從本質(zhì)上證明基因是決議人類(lèi)一切生命景象的物質(zhì)根底。 在第18屆國(guó)際遺傳學(xué)大會(huì)上，全世界3000名科學(xué)家對(duì)人類(lèi)的生老病死做了新詮釋“不論是器質(zhì)性疾病還是功能性疾病，都有必要在基因程度上去探求病因。除此之外，人類(lèi)正常的發(fā)育、衰老和死亡，當(dāng)然也受基因的調(diào)控。 如今，人們?cè)?jīng)從分子程度上認(rèn)識(shí)到基因是一段可以編碼一條到多條肽鏈氨基酸順序的DNA。.傳統(tǒng)的診斷、問(wèn)、望、聽(tīng)、觸閱歷型判別的方法。、化驗(yàn)/檢驗(yàn)細(xì)胞、組織、大分子、小分子、酶、代謝物；微生物、免疫學(xué)、生物化學(xué)、病理學(xué)等。、影像

2、學(xué)X線、B超、CT、核磁共振、內(nèi)窺鏡等。、特殊檢查染色體檢查、肌電/腦電/心電、骨密度、原子吸收光譜等。 隨著技術(shù)程度的開(kāi)展，這些診斷方法也在不斷的提高和完善，在醫(yī)學(xué)實(shí)際中發(fā)揚(yáng)了宏大的作用。并還將有更先進(jìn)的方法問(wèn)世。 但這些方法大多存在一個(gè)無(wú)法抑制的缺陷：不可預(yù)先診斷。. 隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的開(kāi)展，越來(lái)越多的證聽(tīng)闡明，絕大多數(shù)疾病的發(fā)生和開(kāi)展都與患者的遺傳物質(zhì)構(gòu)造和功能改動(dòng)有關(guān)，所以遺傳物質(zhì)的檢查越來(lái)越顯得必要?；蛟\斷的定義 運(yùn)用分子生物學(xué)方法檢測(cè)患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的構(gòu)造和功能變化而作出的或輔助臨床診斷的技術(shù)，稱(chēng)為基因診斷。 基因診斷具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、費(fèi)用低，并對(duì)許多疾病特別是遺

3、傳性疾病做出預(yù)先診斷的優(yōu)點(diǎn)。它是一種極具開(kāi)展?jié)摿Φ脑\斷方法。 由于基因診斷開(kāi)展的時(shí)間不長(zhǎng)，人們對(duì)于基因，特別是致病基因的了解還有許多空白，因此許多疾病的診斷還主要依托其他方法。此外，基因診斷的開(kāi)展并非取代和丟棄其他方法，而是相互補(bǔ)充，共同開(kāi)展。. 長(zhǎng)期以來(lái)，單基因遺傳病的診斷主要靠臨床察看和一系列生化檢查，但生化學(xué)檢查要求有相應(yīng)基因表達(dá)產(chǎn)物的體液或細(xì)胞，并對(duì)基因產(chǎn)物或代謝異常機(jī)理有所了解。 但對(duì)絕大多數(shù)遺傳病而言，目前還遠(yuǎn)未到達(dá)這種認(rèn)識(shí)。 理想的診斷方法是對(duì)患者基因或DNA本身直接進(jìn)展分析，由于這種分析擺脫了上述各種限制。機(jī)體各種組織的核細(xì)胞均有全套基因組DNA，可以作為分析的資料，而不用思索

4、表達(dá)問(wèn)題，是目前診斷技術(shù)中最具開(kāi)展出路的技術(shù)。診斷方法的變卦.基因診斷的對(duì)象1. 病原生物的侵入，如肝炎、艾滋病、支原體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)。2. 先天遺傳性疾患， 如苯丙酮尿癥、無(wú)丙種球蛋白血癥。3. 后天基因突變引起的疾病，如腫瘤。4. 其它，如親子鑒定、個(gè)體識(shí)別、法醫(yī)人證。. 與疾病相關(guān)的遺傳物質(zhì)改動(dòng)主要有兩類(lèi)，1. 遺傳物質(zhì)，即DNA或RNA的程度的變化。如病毒感染時(shí)病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在人體內(nèi)的從無(wú)到有，某些腫瘤中癌基因表達(dá)程度的從低到高。2. 遺傳物質(zhì)的構(gòu)造變化，即基因突變。如點(diǎn)突變引起的基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起的基因激活或滅活等等。 因此，從實(shí)際上說(shuō)，一切涉及基因構(gòu)造和功能變化的檢測(cè)都

5、屬于基因診斷?；蛟\斷的內(nèi)容.常用基因診斷的技術(shù)1. Hybridization2. PCR3. RFLP4. AFLP5. ASO6. SSCP . 每個(gè)人的DNA是不完全一樣的，普通每100500bp就有一個(gè)是不一樣的，即多態(tài)性。在兩套基因組DNA中平均有1000萬(wàn)處不同，它們多位于內(nèi)含子序列中。堿基的變異就能夠?qū)е旅盖悬c(diǎn)的消逝或新的切點(diǎn)出現(xiàn)，當(dāng)運(yùn)用同一限制酶切割不同個(gè)體基因組DNA時(shí)，DNA片段長(zhǎng)度出現(xiàn)差別，這種由于內(nèi)切酶切點(diǎn)變化所導(dǎo)致的DNA片段長(zhǎng)度的差別，稱(chēng)為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性restriction fragment length polymorphism, RFLP。 RFLP反

6、映了常見(jiàn)的個(gè)體間DNA核苷酸的可遺傳性變異，它按照孟德?tīng)柗绞竭z傳。RFLP可用Southern印跡雜交法檢出。 1. RFLP (restriction fragment length polymorphism).等位基因2由于出現(xiàn)新的切點(diǎn)，DNA片段縮至8kb。 DNA片段電泳后雜交圖.RFLP的檢出等位基因1因有額外切點(diǎn)而導(dǎo)致產(chǎn)生兩個(gè)長(zhǎng)短不同的DNA片段3kb及5kb且均能與探針雜交。. 在人類(lèi)基因組中還存在一類(lèi)DNA反復(fù)序列，稱(chēng)為小衛(wèi)星DNA。它們分布非常廣泛，每個(gè)反復(fù)單位通常只需幾幾十個(gè)堿基對(duì)，但其反復(fù)次數(shù)在人群中是高度變異的，又叫數(shù)目變異的串聯(lián)反復(fù)variable number ta

7、ndem repeats,VNTR。當(dāng)用限制酶切割VNTR區(qū)時(shí)，只需酶切點(diǎn)不在反復(fù)區(qū)內(nèi)，就能夠得到各種長(zhǎng)度不同的片段，可用于致病基因的連鎖分析。. 串聯(lián)反復(fù)的短片段的長(zhǎng)度多態(tài)性可以經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后電泳來(lái)檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱(chēng)為擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性AFLP連鎖分析法。 PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時(shí)只需幾個(gè)核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分別鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析。2. AFLP amplified fragment length polymorphism. 當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時(shí)，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針allele-sp

8、ecific oligonucleotide，ASO用同位素或非同位素標(biāo)志進(jìn)展診斷。探針通常為長(zhǎng)20bp左右的核苷酸。用于探測(cè)點(diǎn)突變時(shí)需求合成兩種或兩種以上的探針，一種與正?；蛐蛄型耆恢?，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只需一個(gè)堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開(kāi)來(lái). PCR可結(jié)合ASO，即PCRASO技術(shù)，即先將含有突變點(diǎn)的基因有關(guān)片段進(jìn)展體外擴(kuò)增，然后再與ASO探針作點(diǎn)雜交，這樣大大簡(jiǎn)化了方法，節(jié)約了時(shí)間，而且只需極少量的基因組DNA就可進(jìn)展。3. ASOallele-specific o

9、ligonucleotide. 異常探針 T A G正常人 患者 DNA DNA正常人 患者 DNA DNA雜交結(jié)果點(diǎn)雜交 正常探針 G A G 正常人 患者 DNA DNA雜交結(jié)果 正常人 患者 DNA DNA點(diǎn)雜交 等位基因特異的寡核苷酸探針(ASO)檢測(cè)點(diǎn)突變.基因診斷的臨床檢測(cè)運(yùn)用.1. 基因診斷在感染性疾病檢測(cè)中的運(yùn)用乙型肝炎病毒HBV、人乳頭瘤病毒HPV：其DNA可以運(yùn)用點(diǎn)雜交、PCR方法直接檢出。丙型肝炎病毒HCV、人免疫缺陷病毒HIV：其RNA可以運(yùn)用RT-PCR方法直接檢出。結(jié)核桿菌和瘧原蟲(chóng)的分型可以運(yùn)用探針雜交和PCR方法檢出。.丙型肝炎(HCV)基因診斷實(shí)例丙型肝炎為RN

10、A病毒，9500mer，編碼3011-3033個(gè)氨基酸，具有高變異性?；蚪M組成：E1NS2NS3NS43-NCRCNS1/E2NS15-NCR高變異區(qū)編碼衣殼和包膜蛋白NCR: 非編碼區(qū) 5-NCR為保守的區(qū)域，將引物設(shè)計(jì)在該區(qū)域，進(jìn)展RT-PCR, 可特異性的擴(kuò)增HCV。PCR引物：+: 5-GATTCTCGAGGCGACACTCCACCATAGAT-: 5-ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACCTPCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為322bp.2. 基因診斷在遺傳病檢測(cè)中的運(yùn)用鐮狀細(xì)胞貧血癥 globin，6 ，其GAGGTG的突變，可用RFLPMst II，CCTNAGG或PCR-SSCP檢出。甲型血友病FVIII，XR