基因診斷(1)ppt課件

1、基因診斷Gene Diagnosis . 20世紀40年代發(fā)現(xiàn)DNA是遺傳物質(zhì)以及50年代DNA的雙螺旋構(gòu)造被發(fā)現(xiàn)，進一步從本質(zhì)上證明基因是決議人類一切生命景象的物質(zhì)根底。 在第18屆國際遺傳學大會上，全世界3000名科學家對人類的生老病死做了新詮釋“不論是器質(zhì)性疾病還是功能性疾病，都有必要在基因程度上去探求病因。除此之外，人類正常的發(fā)育、衰老和死亡，當然也受基因的調(diào)控。 如今，人們曾經(jīng)從分子程度上認識到基因是一段可以編碼一條到多條肽鏈氨基酸順序的DNA。.傳統(tǒng)的診斷、問、望、聽、觸閱歷型判別的方法。、化驗/檢驗細胞、組織、大分子、小分子、酶、代謝物；微生物、免疫學、生物化學、病理學等。、影像

2、學X線、B超、CT、核磁共振、內(nèi)窺鏡等。、特殊檢查染色體檢查、肌電/腦電/心電、骨密度、原子吸收光譜等。 隨著技術(shù)程度的開展，這些診斷方法也在不斷的提高和完善，在醫(yī)學實際中發(fā)揚了宏大的作用。并還將有更先進的方法問世。 但這些方法大多存在一個無法抑制的缺陷：不可預先診斷。. 隨著分子生物學和分子遺傳學的開展，越來越多的證聽闡明，絕大多數(shù)疾病的發(fā)生和開展都與患者的遺傳物質(zhì)構(gòu)造和功能改動有關(guān)，所以遺傳物質(zhì)的檢查越來越顯得必要?；蛟\斷的定義 運用分子生物學方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的構(gòu)造和功能變化而作出的或輔助臨床診斷的技術(shù)，稱為基因診斷。 基因診斷具有靈敏度高、特異性強、費用低，并對許多疾病特別是遺

3、傳性疾病做出預先診斷的優(yōu)點。它是一種極具開展?jié)摿Φ脑\斷方法。 由于基因診斷開展的時間不長，人們對于基因，特別是致病基因的了解還有許多空白，因此許多疾病的診斷還主要依托其他方法。此外，基因診斷的開展并非取代和丟棄其他方法，而是相互補充，共同開展。. 長期以來，單基因遺傳病的診斷主要靠臨床察看和一系列生化檢查，但生化學檢查要求有相應基因表達產(chǎn)物的體液或細胞，并對基因產(chǎn)物或代謝異常機理有所了解。 但對絕大多數(shù)遺傳病而言，目前還遠未到達這種認識。 理想的診斷方法是對患者基因或DNA本身直接進展分析，由于這種分析擺脫了上述各種限制。機體各種組織的核細胞均有全套基因組DNA，可以作為分析的資料，而不用思索

4、表達問題，是目前診斷技術(shù)中最具開展出路的技術(shù)。診斷方法的變卦.基因診斷的對象1. 病原生物的侵入，如肝炎、艾滋病、支原體、細菌、寄生蟲。2. 先天遺傳性疾患， 如苯丙酮尿癥、無丙種球蛋白血癥。3. 后天基因突變引起的疾病，如腫瘤。4. 其它，如親子鑒定、個體識別、法醫(yī)人證。. 與疾病相關(guān)的遺傳物質(zhì)改動主要有兩類，1. 遺傳物質(zhì)，即DNA或RNA的程度的變化。如病毒感染時病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在人體內(nèi)的從無到有，某些腫瘤中癌基因表達程度的從低到高。2. 遺傳物質(zhì)的構(gòu)造變化，即基因突變。如點突變引起的基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起的基因激活或滅活等等。 因此，從實際上說，一切涉及基因構(gòu)造和功能變化的檢測都

5、屬于基因診斷?；蛟\斷的內(nèi)容.常用基因診斷的技術(shù)1. Hybridization2. PCR3. RFLP4. AFLP5. ASO6. SSCP . 每個人的DNA是不完全一樣的，普通每100500bp就有一個是不一樣的，即多態(tài)性。在兩套基因組DNA中平均有1000萬處不同，它們多位于內(nèi)含子序列中。堿基的變異就能夠?qū)е旅盖悬c的消逝或新的切點出現(xiàn)，當運用同一限制酶切割不同個體基因組DNA時，DNA片段長度出現(xiàn)差別，這種由于內(nèi)切酶切點變化所導致的DNA片段長度的差別，稱為限制性片段長度多態(tài)性restriction fragment length polymorphism, RFLP。 RFLP反

6、映了常見的個體間DNA核苷酸的可遺傳性變異，它按照孟德爾方式遺傳。RFLP可用Southern印跡雜交法檢出。 1. RFLP (restriction fragment length polymorphism).等位基因2由于出現(xiàn)新的切點，DNA片段縮至8kb。 DNA片段電泳后雜交圖.RFLP的檢出等位基因1因有額外切點而導致產(chǎn)生兩個長短不同的DNA片段3kb及5kb且均能與探針雜交。. 在人類基因組中還存在一類DNA反復序列，稱為小衛(wèi)星DNA。它們分布非常廣泛，每個反復單位通常只需幾幾十個堿基對，但其反復次數(shù)在人群中是高度變異的，又叫數(shù)目變異的串聯(lián)反復variable number ta

7、ndem repeats,VNTR。當用限制酶切割VNTR區(qū)時，只需酶切點不在反復區(qū)內(nèi)，就能夠得到各種長度不同的片段，可用于致病基因的連鎖分析。. 串聯(lián)反復的短片段的長度多態(tài)性可以經(jīng)過PCR擴增后電泳來檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態(tài)性AFLP連鎖分析法。 PCR擴增后，產(chǎn)物即等位片段之間的差別有時只需幾個核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分別鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析。2. AFLP amplified fragment length polymorphism. 當基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針allele-sp

8、ecific oligonucleotide，ASO用同位素或非同位素標志進展診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時需求合成兩種或兩種以上的探針，一種與正?；蛐蛄型耆恢?，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，這樣，就可以把只需一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來. PCR可結(jié)合ASO，即PCRASO技術(shù)，即先將含有突變點的基因有關(guān)片段進展體外擴增，然后再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節(jié)約了時間，而且只需極少量的基因組DNA就可進展。3. ASOallele-specific o

9、ligonucleotide. 異常探針 T A G正常人 患者 DNA DNA正常人 患者 DNA DNA雜交結(jié)果點雜交 正常探針 G A G 正常人 患者 DNA DNA雜交結(jié)果 正常人 患者 DNA DNA點雜交 等位基因特異的寡核苷酸探針(ASO)檢測點突變.基因診斷的臨床檢測運用.1. 基因診斷在感染性疾病檢測中的運用乙型肝炎病毒HBV、人乳頭瘤病毒HPV：其DNA可以運用點雜交、PCR方法直接檢出。丙型肝炎病毒HCV、人免疫缺陷病毒HIV：其RNA可以運用RT-PCR方法直接檢出。結(jié)核桿菌和瘧原蟲的分型可以運用探針雜交和PCR方法檢出。.丙型肝炎(HCV)基因診斷實例丙型肝炎為RN

10、A病毒，9500mer，編碼3011-3033個氨基酸，具有高變異性?；蚪M組成：E1NS2NS3NS43-NCRCNS1/E2NS15-NCR高變異區(qū)編碼衣殼和包膜蛋白NCR: 非編碼區(qū) 5-NCR為保守的區(qū)域，將引物設計在該區(qū)域，進展RT-PCR, 可特異性的擴增HCV。PCR引物：+: 5-GATTCTCGAGGCGACACTCCACCATAGAT-: 5-ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACCTPCR產(chǎn)物長度為322bp.2. 基因診斷在遺傳病檢測中的運用鐮狀細胞貧血癥 globin，6 ，其GAGGTG的突變，可用RFLPMst II，CCTNAGG或PCR-SSCP檢出。甲型血友病FVIII，XR