系統(tǒng)生物學合成生物學與轉錄組學課件

1、Genome transplantation inbacteria: changing onespecies to another天然完整基因組種間轉移:As a step toward propagation ofsynthetic genomes, we completelyreplaced the genome of a bacterialcell with one from another species bytransplanting a whole genome asnaked DNA. Intact genomic DNAfrom Mycoplasma mycoides（蕈狀支原

2、體 ） large colony (LC), virtuallyfree of protein, was transplanted intoMycoplasma capricolum（山羊支原體）cells by polyethylene glycol(PEG)-mediated transformation. Cellsselected for tetracycline resistance,carried by the M. mycoides LCchromosome, contain the completedonor genome and are free ofdetectable r

3、ecipient genomicsequences. These cells that resultfrom genome transplantation arephenotypically identical to the M.mycoides LC donor strain as judgedby several criteria.- Science. 2007 Aug 3; 317:632-8合成基因組-Science論文Science 2 July 2010: Vol. 329. no. 5987, pp. 52 - 56Creation of a Bacterial Cell Con

4、trolled by a ChemicallySynthesized GenomeDaniel G. Gibson,1 John I. Glass et alWe report the design, synthesis, and assembly of the 1.08megabase pairMycoplasma mycoides JCVI-syn1.0 genome starting from digitizedgenome sequence information and its transplantation into a M.capricolum recipient cell to

5、 create new M. mycoides cells that arecontrolled only by the synthetic chromosome. The only DNA in thecells is the designed synthetic DNA sequence, including watermarksequences and other designed gene deletions and polymorphisms, andmutations acquired during the building process. The new cells havee

6、xpected phenotypic properties and are capable of continuous self-replication.合成生命的關鍵步驟First Self-Replicating Synthetic Bacterial Cell 20-May-20101) 合成供體的基因組DNA：首先，將蕈狀支原體的全基因組測序，并按照該序列信息將其合成為1078條平均長度為1080bp的DNA片段。這些片段兩兩間 具有80bp的部分重疊，所有片段拼接起來構成蕈狀支原體的全長基因組。值得注意的是這些合成的片段較天然基因組略有一些改動，包括去除了14個不重要的 基因、為阻斷

7、基因而設計的兩個插入序列、27處單核苷酸多態(tài)性 (其中19處在意料之中) 以及4條用來區(qū)分于天然序列模本的“水印”標記 (Watermark)，這些改動都不影響細胞正常的生命活動。該過程涉及到計算機對合成序列的精密計算。2) 合成DNA片段的拼接：將以上合成的1078條DNA片段分別連接到載體，使其能在酵母細胞中通過同源重組拼接起來。于是，平均1080bp的DNA片段，10個一組拼接為大約10kb的片段 (109個)，然后將這些連接有目的基因片段的載體從酵母中分離出來，轉入大腸桿菌E. coli中進行擴增，以限制酶篩選出陽性克??；之后再將陽性克隆質粒中的這109條10kb左右的片段按同樣的方法

8、每組10個拼接成100kb的片段 (11個)；這11條片段最終拼接成完整的總共1077 947bp的基因組 (由于攜帶太大片段的載體在E. coli中不能穩(wěn)定傳代，因此后兩步拼接中采用多重PCR來篩選陽性克隆)。此過程除了2個銜接反應是在體外用酶處理構建，其余所有的片段都是在酵母細胞內依靠同源重組拼接而成。3) 人工基因組的甲基化修飾：由于供體細胞 (蕈狀支原體) 和受體細胞 (山羊支原體) 共用同一套限制酶系統(tǒng)，而天然的供體基因組是經甲基化修飾的。因此，拼接完成的基因組DNA還需在體外用甲基化酶 (從蕈狀支原體或山羊支原體提取物中純化) 進行修飾，以避免受體細胞限制酶系統(tǒng)的阻礙。4) 人工基

9、因組移植入受體細胞：將構建好的人工合成基因組移植入山羊支原體內。細胞經過不斷分裂傳代，具有人造基因組的細胞在含抗生素的培養(yǎng)基中篩選出來，同時含有天然DNA的細胞逐漸消失殆盡。最終只剩下含有山羊支原體細胞質但由合成DNA控制的人工嵌合體細胞。雖然蕈狀支原體和山羊支原體在基因組上75%是同源的，但該人造細胞明顯表現出蕈狀支原體的生長特性。合成生命操作圖解取名 Synthia:人造兒創(chuàng)造這個可復制的試驗性單細胞生物花費了4,000萬美元人工合成基因組中的水印The secret amino acid messages contained in watermarksthat were embedded

10、 in the worlds first manmade bacterialgenome.NCBI checked into the genetic sequence submitted byVenters Institute and found the watermarks hidden inplain sight.The five coded messages that will go down in history asembedded in the first synthetic genomeVENTERINSTITVTECRAIGVENTERHAMSMITHCINDIANDCLYDE

11、GLASSANDCLYDE代表5個作者: Craig Venter, Hamilton Smith, John Glass,Clyde Hutchison人工基因組組裝與檢測合成基因組結構圖Transcriptomics轉錄組學Transcriptome: An evolving definition(The population of) mRNAs expressed by a genome at any given time (Abbott, 1999)轉錄組（Transcriptom）：細胞所包含mRNA的總和。與基因組不同的是，轉錄組的定義中包含了時間和空間的限定。 轉錄組學（Tran

12、scriptomics）：研究細胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的類型與拷貝數；比較不同功能狀態(tài)下mRNA表達的變化，搜尋與功能狀態(tài)變化緊密相關的重要基因群。 新定義The complete collection of transcribed elements of the genome. (Affymetrix, 2004)mRNArRNA, tRNAsnmRNAs (small non-messenger RNAs)microRNAs and siRNAs (small interferring RNAs)snoRNAs (small nucleolar RNAs) 核仁小分子RNAsnRN

13、As (small nuclear RNAs)Other non-coding RNAsLong non-coding RNA (lncRNA)轉錄本All transcripts All mRNAsTranscriptomics Definition The study of characteristics and regulation of the functional RNA transcript population of a cell/s or organism at a specific time. Scopethe population of functional RNA tra

14、nscripts.the mechanisms that regulate the production of RNA transcriptsdynamics of the trancriptome (time, cell type, genotype, external stimuli)一、轉錄組學研究全部RNA的表達及功能轉錄組（transcriptome）指特定狀態(tài)下一種細胞或組織所能轉錄出來的所有RNA的總和。包括編碼RNA，即mRNA和非編碼RNA (non-coding RNA, ncRNA)轉錄組學（transcriptomics）：是在整體水平上研究細胞基因轉錄情況及轉錄調控規(guī)

15、律的科學。RNA組學（RNomics）：是分析、鑒定非信使小RNA（small non-messenger RNA, snmRNA）在特定狀態(tài)下表達情況、功能及其與蛋白質的相互作用。轉錄組的特點：受到內外多種因素的調節(jié)，因而是動態(tài)可變的。能夠揭示不同物種、不同個體、不同細胞、不同發(fā)育階段及不同生理病理狀態(tài)下的基因差異表達信息?；跍y序：cDNA文庫、illumina測序基于雜交：cDNA芯片（GeneChip，microarray）基因表達聚類轉錄組學的研究方法（一）微陣列是大規(guī)模基因組表達譜研究的早期主要技術大規(guī)模表達譜或全景式表達譜（global expression profile）：是

16、生物體（組織、細胞）在某一狀態(tài)下基因表達的整體狀況。微陣列或基因芯片（DNA chip）:利用光導化學合成、照相平板印刷以及固相表面化學合成等技術，在固相表面合成成千上萬個寡核苷酸探針，并與放射性同位素或熒光物標記的來自不同細胞、組織或整個器官的DNA或mRNA反轉錄生成的第一鏈cDNA進行雜交，然后用特殊的檢測系統(tǒng)對每個雜交點進行定量分析。Spotted MicroarrayscDNA ArraysOligo Arrays In Situ Oligo SynthesisPhotosynthesisPlaner surfaceMicrofluidics chipE-field synthesi

17、sIntegrated Chips Integrated uF, microarray and detection chips with PCR, fluorescence or e-detectionMicrofluidicsPlasticsCeramics SiliconOther materials不同的生物芯片技術平臺點樣芯片原位合成芯片微流體芯片整合型芯片基因芯片的探針Tagged RNA fragments flushed over arrayLaser activation of fluorescent tagsOptical scanning of hybridization

18、intensities基因芯片的雜交實驗Experimental overview:HybridizationWashingScan cy5 channelScan cy3 channel“Overlay images”Quantify pixel intensities.Cellpopulation ACell population BRNAextractionAABBReversetranscriptionAABBKlenowlabel incorporationSample B labelledwith cy3 dyeSample A labelled with cy5 dyeCy3和C

19、y5Cy3激發(fā)波長532nmCy5激發(fā)波長635nm圖像掃描Cy5Cy3歸一化Limit of Detection: 1 in 30,000 transcripts 20 transcripts/cellRed increase of Cy5 sample transcriptsGreen increase of Cy3 sample transcriptsYellow equal abundance差異基因篩選原理：采用cy3/cy5的ratio值對差異基因進行 判斷，或采用統(tǒng)計方法對差異基因進行統(tǒng)計推斷。 方法：倍數法：cy3/cy5比值大于2或者小于 0.5Z值法： Z=(X-)/ 作用

20、：發(fā)現兩個樣本間的差異表達基因，便于后續(xù)分析。Microarray and GeneChip ApproachesAdvantages:RapidMethod and data analysis well described and supportedRobustConvenient for directed and focussed studiesDisadvantages:Closed system approachDifficult to correlate with absolute transcript numberSensitive to alternative splicing

21、ambiguities高通量測序高通量測序技術（High-throughput sequencing）是指能夠一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，每一次序列測定的讀長一般較短的測序技術。 高通量測序技術是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(next generation sequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。高通量測序中重要名詞解釋1、測序深度：測序得到的總堿基數與待測基因組

22、大小的比值。假設一個基因組大小為7M，測序總堿基數為70M，則測序深度為10。2、覆蓋度：測序獲得的序列占整個基因組的比例。由于基因組中高GC含量，重復序列等復雜結構的存在，測序最終拼接組裝的序列往往無法覆蓋所有的區(qū)域，這些區(qū)域就叫做Gap。二者的關系：測序深度與基因組覆蓋度之間是一個正相關的關系，測序帶來的錯誤率或假陽性結果會隨著測序深度的提升而下降。當測序深度在1015X以上時，基因組覆蓋度和測序錯誤率控制均得以保證。 3、RPKM（reads per kilobase per million reads）是每百萬讀段中來自于某基因每千堿基長度的讀段數。其公式為: 其中，total exo

23、n reads指映射到某個基因上的reads數，mapped reads指map到所有基因的總的reads數。RPKM不僅對測序深度作了歸一化，而且對基因長度也作了歸一化，使得不同長度的基因在不同測序深度下得到的基因表達水平估計值具有了可比性，是目前最常用的基因表達估計方法?；趇llumina測序的轉錄組分析：RNA-seq樣品檢測文庫制備Cluster StationIllumina Sequencing生物信息分析Total RNA樣品檢測 Agilent 2100 檢測OD260/280:1.82.2 RNA 28S:18S 1.0; RIN7 第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的

24、打斷cDNA的合成第二天末端修復 加接頭膠回收3端加A第三天PCRPCR膠回收 文庫制備 cDNA:為具有與某RNA鏈呈互補的堿基序列的單鏈DNA即complementary DNA之縮寫。 以mRNA為模板，經反轉錄酶在體外反轉錄成cDNA，與適當的載體（常用噬菌體或質粒載體）連接后轉化受體菌，則每個細菌含有一段cDNA，并能繁殖擴增，這樣包含著細胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合稱為該組織細胞的cDNA文庫。 cDNA文庫真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過磁珠吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3的poly A與磁珠在bindingbuffer的作

25、用下相結合。磁珠通過MPC（磁分離器）從溶液中分離出來。mRNA與磁珠結合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。mRNA反轉錄純化過的mRNA樣品加入1 l的fragment buffer 70作用1.5min。加入1l的stop buffer終止反應。加入沉淀劑（NaAc 糖原 無水乙醇）沉淀酶切產物。末端修復cDNA 3末端加AAdapter連接不同方法比較OHFlow Cell接頭diol P7 P5 dioldiol模板雜交dioldiol 延長dioldiol 變性堿基片段雜交CTAGCTA5-3-5GT合成第一個堿基Cycle 1:按順序加入反應試劑清除未反應的堿基

26、和試劑激發(fā)堿基熒光并收集熒光信號 去除阻斷基團和熒光基團Cycle 2-n:重復前面的步驟GTCTAGTCTGCTAGA基于SBS測序技術Cluster station剩下的復制鏈其一端“固定”在芯片上，另外一端隨機和附近的另外一個引物互補，被“固定”住，形成“橋”(bridge)。形成的單鏈橋，以周圍的引物為擴增引物，在芯片表面進行擴增，形成雙鏈。雙鏈經變性成單鏈，再次形成橋，并作為下一輪擴增的模板繼續(xù)擴增反應。反復若干輪擴增，每個單分子得到了大量擴增，成為單克隆“DNA簇群”。生物信息分析基因表達聚類分析轉錄組學方法的應用導致基因表達數據爆炸性增長。如何對這些數據進行分析，從中提取有意義的

27、生物學信息，已成為轉錄組學的研究熱點和技術瓶頸。 聚類分析技術能將待處理的對象分配到相應的聚類中，使得同一聚類中的對象差別較小，不同聚類之間的對象差別較大。聚類分析技術在轉錄組學研究中，非常適合大批量分析基因群的功能。 基因表達聚類的數據表現Systematic variation in gene expression patterns in human cancer cell lines. Nature, 2000, Ross et al.有參考基因組序列信息分析流程Reads 在基因組上的分布基因結構優(yōu)化(Nagalakshmi, U. et al.,2008) 通過轉錄組測序鑒定出酵母3

28、 和5 UTR區(qū)域 鑒定基因可變剪接exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3common readsjunction readsmRNA鑒定融合基因新轉錄本預測Genomic intergenic regionReadsclusterPaired ReadsdistributionPaired-End (PE) ReadsN Eng J Med 2009SNP分析Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptomeGenome Res 2010Rice TranscriptomeMaterial callus root at seedling stage（14d） shoot at seedling stage（14d） flag leaves（2 stages） panicle（3 stages）Methods RNASeq（paired-end & single end） DGE small RNA（18-30 nt）基因功能注釋基因結構分析鑒定出大量新轉錄本可變剪接鑒定基因融合鑒定無參考基因組生