人類胎盤促乳激素與人類促乳激素穿插嵌合重組蛋白ppt課件

1、人類胎盤促乳激素與人類促乳激素交叉嵌合重組蛋白 對人類促乳激素接受體 結(jié)合才干與抗乳癌相關(guān)機(jī)制之研討藍(lán)珮菁Pei-Ching Lan張正教授Advisor: C.Allen ChangNational Chiao Tung UniversityBiological Science and Technology研討背景胎盤及胎盤素 中國的漢方醫(yī)學(xué)寶典本草綱目中，對於乾燥胎盤 -紫河車有記載 胎盤是母體傳遞胚胎生長發(fā)育所需物質(zhì)的通道前四週發(fā)育快速 胎盤素之效果，廣為生醫(yī)界所研討，其具有幫助細(xì)胞新生、及增強(qiáng)免疫機(jī)能等效果風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎研討背景胎盤及胎盤素 研討背景胎盤促乳激素Placenta Lact

2、ogen與促乳激素(Prolactin) 胎盤促乳激素Placenta Lactogen, PL22.3kDa蛋白質(zhì)只由胎盤生產(chǎn)初期了解可促進(jìn)母體乳腺之生長與乳汁之生產(chǎn)。促乳激素(Prolactin, PRL)腦下垂體前葉所分泌22.5kDa蛋白質(zhì)在生產(chǎn)後調(diào)控乳汁中之酪蛋白(casein)與乳蛋白素(lactabumin)之製造以及乳汁分泌。 研討背景促乳激素與訊息傳遞 JAK-STAT pathwayRas-MAPK pathway研討背景促乳激素與訊息傳遞 oPL/PRLR x-ray structure研討背景胎盤促乳激素Placenta Lactogen與促乳激素(Prolactin)

3、 訊息傳遞: JAK2 kinase-STAT路徑、ras-MAPK路徑最近一些研討報(bào)告指出，促乳激素會(huì)影響thymic stromal cell的 IL-1與IL-6的表現(xiàn)量，進(jìn)而影響T細(xì)胞的分化。IL-6在體外試驗(yàn)上也表現(xiàn)出抑制鼠的胎盤促乳激素的分泌量。顯示促乳激素與細(xì)胞動(dòng)素亦有關(guān)連，但其機(jī)制尚不清楚。 最近的研討顯示促乳激素與乳癌有其相關(guān)性研討背景乳癌與乳癌用藥乳癌在國人及世界婦女癌癥中，不斷佔(zhàn)有很高的比例。乳癌：乳房乳腺管細(xì)胞或是腺泡細(xì)胞經(jīng)由不正常分裂、繁衍所構(gòu)成之惡性腫瘤。 乳癌的治療：開刀、放射線治療、化學(xué)治療與荷爾蒙療法研討背景乳癌與乳癌用藥化學(xué)治療藥物：fluorouracil

4、5-FU與anthracycline(ex. doxorubicin)為第一線藥物荷爾蒙療法：以對抗動(dòng)情激素接受體(estrogen receptor)的藥物為主，如tamoxifen。 衛(wèi)生署藥政處通過用於治療乳癌的新藥：化學(xué)療法：太平洋紫杉醇 Taxol、歐洲紫杉醇 Taxotere、滅癌平Navelbin與截瘤達(dá)Xeloda荷爾蒙療法：安美達(dá)Arimidex。 研討背景乳癌與乳癌用藥目前對乳癌的荷爾蒙療法主要是以對抗動(dòng)情激素接受體(estrogen receptor，ER)的藥物為主-無法完全抑制乳癌細(xì)胞的成長。Tamoxifen 亦會(huì)抑制由促乳激素引發(fā)的 ER-negative Nb2

5、 rat lymphoma cells的生長。-ER以外的receptor在一些報(bào)告中指出促乳激素(PRL)能夠?yàn)閷谷榘┑牧硪粋€(gè)目標(biāo)。會(huì)過量表現(xiàn)促乳激素的基因轉(zhuǎn)殖鼠在11至15月齡即出現(xiàn)乳癌腫瘤PRL有影響經(jīng)由蛋白質(zhì)水解酵素水解的促乳激素片段，可表現(xiàn)出有抑制血管新生的作用PRL有影響研討背景乳癌與乳癌用藥接受體PRL對抗乳癌的接受體研討：Dopamine receptor 但由最近的研討報(bào)告指出其與乳癌的相關(guān)性小，所以抑制Dopamine receptor對治療乳癌能夠是無效的 。PRL receptor：PRL 專一結(jié)合，抗乳癌接受體目標(biāo)PL、GH 也會(huì)與PRL receptor bind

6、ingPLPRLGH 研討背景擬解決問題 針對PRL receptor研討抗乳癌藥物利用PL與PRL特性研發(fā)不產(chǎn)生生理功用的蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)片段：成分複雜不易控制嵌合重組：可掌握蛋白質(zhì)性質(zhì)研討背景基因隨機(jī)的嵌合重組 相關(guān)的基因做隨機(jī)的嵌合重組，可以得到多樣化的新型基因，而成為一組新蛋白質(zhì)的基因庫。Gene shuffling為一快速產(chǎn)生chimerical library的方法。利用DNase I 將類似的gene做隨機(jī)的剪切成小片段，再以此小片段基因的互補(bǔ)做PCR，可隨機(jī)的將基因相連而成相互鑲嵌的新的基因。由於鑲嵌的順序隨機(jī)且互不一樣，分析新的基因庫，可以獲得更多的蛋白質(zhì)資訊，並且可以由特定目標(biāo)

7、的篩選而得到功能更佳的基因及蛋白質(zhì)。 研討背景基因隨機(jī)的嵌合重組 研討背景基因隨機(jī)的嵌合重組 將hPL、hPRL做隨機(jī)的gene shuffling，藉由鑲嵌而成的基因序列，可分析這一family的蛋白質(zhì)的結(jié)協(xié)作用、coding potential、tissue specificity 跟gene function，藉由DNA sequence 以及computer modeling，可比較不同蛋白質(zhì)之結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)係。而藉由此蛋白質(zhì)與PRL 接受體的競爭力分析，及進(jìn)一步的細(xì)胞動(dòng)素分析，可作為抗乳癌藥物之candidate或是乳腺發(fā)育不全的治療。 PL gene cloningPRL gene

8、 cloningPRLR gene cloningIn vitro assayBinding constantYeast two hybridDNA shufflingPLPRLMutant gene任務(wù)項(xiàng)目及實(shí)施方法 1.人類促乳激素接受體(hPRL receptor)基因分子選殖為了進(jìn)行重組促乳激素的篩選，本實(shí)驗(yàn)室必須有促乳激素接受體基因以表現(xiàn)其蛋白質(zhì)。PCRcloning vector E.coli 做藍(lán)白篩選限制酵素來剪切DNA定序確認(rèn)選殖入表現(xiàn)穿越載體如：pQE30E.coli check 表現(xiàn)選殖出之促乳激素接受體任務(wù)項(xiàng)目及實(shí)施方法 2.人類促乳激素(hPRL)之基因分子選殖與蛋白

9、質(zhì)表現(xiàn) 為了進(jìn)行重組促乳激素的篩選，以及測試將來進(jìn)行shuffling重組時(shí)的PCR條件，本實(shí)驗(yàn)室亦進(jìn)行促乳激素基因選殖，並可將其表現(xiàn)之蛋白質(zhì)與市售隻促乳激素蛋白質(zhì)加以比較。PCRcloning vector E.coli 做藍(lán)白篩選限制酵素來剪切DNA定序確認(rèn)選殖入表現(xiàn)穿越載體如：pQE30E.coli check表現(xiàn)選殖出之促乳激素任務(wù)項(xiàng)目及實(shí)施方法 3.hPL與 hPRL gene shuffling 0.005U DNase I剪切hPL與 hPRL geneRT 10-30min9510minice 10min1.4agarose電泳200-500bpprimeless PCRPri

10、mer PCRCloning vector E.coli shuffling libraryDNA sequence任務(wù)項(xiàng)目及實(shí)施方法 4. Shuffling gene與hPRL 結(jié)構(gòu)之分子模擬 利用電腦程式,如Rasmol、insight II將已選殖出之hPRL receptor gene進(jìn)行電腦模擬，加上PRL之模擬結(jié)果，以得到兩蛋白質(zhì)相互作用之方式。模擬各Shuffling gene之三級(jí)結(jié)構(gòu),比較其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，並由模擬預(yù)測能夠之功能性,如與receptor之結(jié)合位置。任務(wù)項(xiàng)目及實(shí)施方法 5. Shuffling gene與hPRL receptor之結(jié)合力試驗(yàn) Yeast two-

11、hybrid system是近年發(fā)展的蛋白質(zhì)交互作用研討方法。以yeast two hybrid 的方法，以hPRL receptor為釣餌，找出與hPRL receptor有交互作用的Shuffling genehPRLR gene - pGBKT7 vectorshuffling gene - pGADT7 vectoryeast表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活化之表型如lacZ基因表現(xiàn)而使參與X-gal培養(yǎng)之菌體產(chǎn)生藍(lán)色Essential gene 存活任務(wù)項(xiàng)目及實(shí)施方法 Shuffling gene與hPRL receptor之結(jié)合力試驗(yàn) 其利用將釣餌蛋白的基因剪接入一帶有DNA binding doma

12、in基因之現(xiàn)載體，以產(chǎn)生釣餌蛋白與DNA binding domain之交融蛋白；另外候選之library基因則剪接入一帶有轉(zhuǎn)錄活化因子基因之載體，以產(chǎn)生候選蛋白與轉(zhuǎn)錄活化因子之交融蛋白當(dāng)此兩種選殖載體均被轉(zhuǎn)型入酵母菌內(nèi)，假設(shè)釣餌蛋白與候選蛋白產(chǎn)生交互作用，則DNA binding domain會(huì)與酵母菌內(nèi)之DNA結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化因子則促使標(biāo)示基因表現(xiàn)，如此則可以挑出可與釣餌蛋白質(zhì)交互作用之候選蛋白質(zhì)。任務(wù)項(xiàng)目及實(shí)施方法 6. Binding constant Yeast two hybrid： 定性藉由ELISA方法測定重組蛋白質(zhì)與接受體的結(jié)合常數(shù)。 另一個(gè)篩選的方法：可以將shuffling

13、的protein點(diǎn)於晶片上，再利用帶有標(biāo)示的receptor protein，來將與hPLR有交互作用之蛋白質(zhì)篩選出。參考各文獻(xiàn)的方法，以gel filtration 來分析與hPRL receptor之競爭力。對hPRL receptor有較大競爭力者，能夠?yàn)榭谷榘┧幬?candidate。任務(wù)項(xiàng)目及實(shí)施方法 7. NMR/X-Ray蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定 將與清華大學(xué)余靖教授協(xié)作進(jìn)行NMR測試與中研院袁小含博士協(xié)作進(jìn)行X-Ray測定重組蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)。 任務(wù)項(xiàng)目及實(shí)施方法 8. Clinical studies 篩選出能夠有功用之重組蛋白質(zhì)後，將再以乳腺細(xì)胞株做in vitro assay。以特

14、定乳癌老鼠進(jìn)行animal model試驗(yàn)。 9. hPL之細(xì)胞動(dòng)素(cytokine)變化乳腺細(xì)胞株與hPL或重組蛋白共同培養(yǎng)之，測定cytokine 如IGF-1、IL量之變化或其他cytokine量之變化。 目前研討結(jié)果 1. DNA shuffling試驗(yàn)先前的試驗(yàn)，試以不同濃度DNaseI與不同作用時(shí)間的搭配，尋找出可以適當(dāng)剪切DNA為不同大小片段的條件。最後以以0.005U的DNase I剪切DNA，室溫作用10分鐘，可得到較佳的剪切情況，最小片段可由電泳膠片上看出約200bp。 200bp目前研討結(jié)果 1. DNA shuffling試驗(yàn)而在將DNA片段重新組合的PCR試驗(yàn)，則先

15、以Taq聚合脢做試驗(yàn)，但卻無法正確生合成所要的DNA。後經(jīng)參考paper上以辨識(shí)度較高的聚合脢做效果較好，則改以rTth聚合脢做重組的PCR，則可得到重組的DNA。 目前研討結(jié)果 1. DNA shuffling試驗(yàn)Shuffle重組的DNA library，經(jīng)酵素剪切，接入cloning vector 來載入shuffling之基因，再轉(zhuǎn)型入 E.coli 中。經(jīng)過DNA初步定序，發(fā)現(xiàn)有二個(gè)重組DNA能夠是有變化的。分別命名為pSPRS314-2-2與pSPRS314-3-3b46目前研討結(jié)果 2. TLC與HPLC分析突變株TKRMY68及對照之野生株CBY57(無CAS基因)以SD培養(yǎng)液

16、培養(yǎng)3天後，搜集菌液，萃取其不皂化之脂類物質(zhì)經(jīng)TLC分析，可明顯辨識(shí)出TKRMY68會(huì)產(chǎn)生一新的環(huán)化物質(zhì)。目前研討結(jié)果 2. TLC與HPLC分析以HPLC分析，OSD 4.6x250mm管柱，CH3CN 1ml/min沖提，UV202偵測突變株TKRMY68的萃取物於大約25分鐘時(shí)較野生株CBY57的萃取物多了一個(gè)peak。 目前研討結(jié)果 3. PRL基因選殖 PL基因已由林孟嘉同學(xué)於本實(shí)驗(yàn)室選殖出。PRL基因則參考基因庫裡的DNA序列設(shè)計(jì)引子，欲以PCR放大的方法來選殖。hPRL(I)-30BamHI :5-CGCGGATCCAACATGAACATAAAGGATCG -3hPRL (II)

17、-24EcoRI :5-CCGGAATTCCTTCTGATACATTTCCTGCAG -3hPLR(II)-30KpnI :5-CGGGGTACCGTTACCTGAAGAAAAATCACA -3以super Therm聚合脢做PCR，由瓊脂膠體電泳確認(rèn)，已經(jīng)由placental cDNA放大選殖出PRLR基因。選殖入pBluescript II SK+ vector，經(jīng)轉(zhuǎn)型入XL1Blue E. Coli，萃出其plasmid，以EcoRI限制酵素剪切，由瓊脂膠體電泳可見約3kb相當(dāng)於vector大小及約2kb相當(dāng)於insert大小的DNA片段。目前研討結(jié)果 5. PRL molecular simulation 由於oPL的X-Ray三級(jí)結(jié)構(gòu)已解出，我們以oPL結(jié)構(gòu)為模板，利用insightII軟體模擬出hPRL的三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果仍為4-helix bundle的結(jié)構(gòu)，與oPL X-Ray結(jié)構(gòu)的骨架平均差為12.39。目