G0期淋巴細胞暴露于γ射線DNA損傷應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄譜教學(xué)文稿

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。G0期淋巴細胞暴露于射線DNA損傷應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄譜-G0期淋巴細胞暴露于射線DNA損傷應(yīng)答基因轉(zhuǎn)錄譜摘要電離輻射引起人類細胞大量的DNA損傷，這可能改變mRNA表達水平。我們已經(jīng)分析了全血中參與G0/G1檢查點通路的DNA損傷應(yīng)答基因的mRNA表達譜，從而評估它們的放射適應(yīng)性反應(yīng)，如果有射線。血液樣本是從25個隨機的正常的健康的男性捐贈者收集的，并有書面的知情同意，照射劑量在0.1-2.0Gy(0.7Gy/min)。利用彗星實驗研究DNA鏈斷裂，而用H2AX作為生物標(biāo)志物可以將DNA雙鏈斷裂可視化。如果存

2、在劑量反應(yīng)，研究照射后1h和5h所有劑量組的轉(zhuǎn)錄水平。在三個不同的吸收劑量(0.1、0.3和0.6Gy)分別研究轉(zhuǎn)錄水平的適應(yīng)反應(yīng)，然后是4h后具有挑戰(zhàn)性的劑量2.0Gy。對于兩個實驗，從照射全血獲得的PBMCs分離總的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用實時定量PCR研究ATM、ATR、GADD45A、CDKN1A、P53、CDK2、MDM2和CyclinE的mRNA表達水平。利用彗星實驗觀察到尾部DNA損傷百分比以劑量依賴方式顯著增加。在H2AX觀察到焦點數(shù)量隨劑量增加。照射后5h觀察到，高達1Gy時，GADD45A、CDKN1A和P53基因在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)呈明顯的劑量依賴方式(P0.05)。在CD

3、K2、CyclinE和P53觀察到mRNA表達水平的放射適應(yīng)反應(yīng)，而ATM、ATR、GADD45A、MDM2、ATM和ATR表達譜沒有顯示任何放射適應(yīng)性改變。參與G0/G1檢查點通路的DNA損傷基因?qū)w內(nèi)放射敏感性有重要意義，轉(zhuǎn)錄表達譜的改變可能對適應(yīng)反應(yīng)機制的理解提出新的見解。關(guān)鍵詞人類外周血單核細胞（PBMC）.mRNA.相對定量.實時定量PCR.射線照射前言眾所周知，包括電離輻射在內(nèi)的環(huán)境誘變因素對人類正常的細胞功能具有極大挑戰(zhàn)。電離輻射引起DNA損傷的范圍包括單鏈和雙鏈斷裂，DNA交聯(lián)，人類細胞分離和聚集的DNA損傷。雙鏈斷裂（DSB）和聚集的DNA損傷高度有害，有時候DNA錯配可能導(dǎo)

4、致染色體異常和基因突變。然而，人類細胞高效的DNA修復(fù)機制通過調(diào)節(jié)各種細胞和分子機制維持基因組的完整性。利用生物標(biāo)志物監(jiān)測高水平自然背景輻射暴露的人口總數(shù)或個人的職業(yè)暴露。例如染色體畸變（尤其是雙中心粒）或微核。最近幾年，努力建立分子生物標(biāo)志物去確定輻射特征。利用三種生物標(biāo)志物的適應(yīng)性研究可能有助于從電離輻射暴露總?cè)巳捍_定輻射敏感性和輻射抵抗性的個體。電離輻射的細胞反應(yīng)是由大量基因介導(dǎo)的，它們控制復(fù)雜的調(diào)節(jié)通路。這些通路可能導(dǎo)致細胞周期延遲、凋亡和DNA修復(fù)。電離輻射應(yīng)答基因表達改變是DNA損傷的指標(biāo)之一。雖然一些研究這已經(jīng)研究了對輻射暴露的應(yīng)答基因DNA損傷的表達模式，但是大部分研究探索不同

5、種類的細胞系，正常人類的成纖維細胞和皮膚活檢。人類外周血單核細胞(PBMCs)是體外研究理性的選擇。很少有關(guān)靜止淋巴細胞（G0）這些DNA損傷應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄水平模式。在分裂的細胞，電離輻射誘導(dǎo)DNA損傷，通過運動失調(diào)血管擴張調(diào)節(jié)DNA損傷反應(yīng)，突變（ATM）和ATR(ATM和Rad3相關(guān)的)蛋白激酶屬于絲氨酸蘇氨酸激酶。ATM/ATR激活后，p53發(fā)生磷酸化，其活化誘導(dǎo)GADD45A和CDKN1A(p21)導(dǎo)致G1期阻滯。在這個過程中，參與的其它基因有MDM2、CDK2和CyclinE，它們可能在G1期檢查點阻滯發(fā)揮重要作用。在這篇文章，我們研究靜止淋巴細胞這些基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。研究的基因的特征

6、如下：細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1a(CDKN1A)也被稱為p21，它抑制細胞周期蛋白激酶活性，這是通過p53在轉(zhuǎn)錄水平嚴格調(diào)控的。生長阻滯和DNA損傷誘導(dǎo)基因（GADD45A）是GADD家族中電離輻射頻繁誘導(dǎo)的唯一成員，它參與DNA修復(fù)、染色體完整性的維持、細胞周期調(diào)控和凋亡。P53（也稱為TP53）調(diào)節(jié)細胞周期、DNA修復(fù)和凋亡。雖然在正常細胞，p53蛋白水平低，但是DNA損傷反應(yīng)可能增加p53蛋白水平。ATM和ATR是兩個信號分子，它們通過含有絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化在DNA損傷位點招募響應(yīng)電離輻射。細胞周期蛋白依賴性激酶是絲氨酸/蘇氨酸激酶的同分異構(gòu)體，它通過細胞周期蛋白的幫助調(diào)控細

7、胞周期進程。細胞周期蛋白E/CDK2復(fù)合體使p27（細胞周期蛋白D的抑制劑）磷酸化，標(biāo)記它的降解。MDM2是p53重要的負向調(diào)節(jié)者。DNA損傷后，緊接著MDM磷酸化導(dǎo)致p53穩(wěn)定。這項研究的目的是評估參與G0/G1檢查點通路的DNA損傷應(yīng)答基因的mRNA表達水平是否存在劑量反應(yīng)。此外，我們試圖評估人類血在靜止期（G0）對電離輻射反應(yīng)的這些基因的轉(zhuǎn)錄模型是否存在適應(yīng)反應(yīng)。針對這些疑問，利用堿性的彗星實驗研究PBMCsDNA鏈斷裂的DNA損傷量。由于一些組織蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾，特別是DNA損傷反應(yīng)中Ser139殘基H2AX的磷酸化，我么也嘗試利用H2AX作為生物標(biāo)志物研究PBMCs中DNADSB是否形

8、成或可視化。最后，研究PBMCs暴露于不同劑量的射線照射的劑量反應(yīng)和適應(yīng)反應(yīng)。材料和方法血液樣本收集和倫理聲明靜脈血液樣本使用含有EDTA無菌的采血管從25個隨機的健康男性捐贈者（不吸煙）收集，年齡在25-40歲。所有捐贈者都給予了知情同意，這項實驗得到醫(yī)學(xué)倫理委員會、巴巴原子能研究中心（BARC）、Trombay和Mumbai的允許。劑量反應(yīng)和適應(yīng)反應(yīng)實驗都進行。樣本照射和從血中分離PBMCs對于DNA損傷實驗，利用血液照射機2000(BoardofRadiationandIsotopeTechnology,Mumbai,India)使用60CO源以70cGy/min分5個劑量組0.1,0.

9、3,0.6,1.0,and2.0Gy照射血液樣本，設(shè)立陰性照射對照。根據(jù)生廠商的說明，利用Histopaque1077(SigmaAldrich,StLouis,USA)根據(jù)梯度離心法從照射的全血分離PBMCs。DNA損傷定量我們進行堿性彗星實驗定量上面提到劑量組的DNA鏈斷裂。H2AX是DSB特定的生物標(biāo)志物，利用它也進行劑量反應(yīng)實驗。用彗星實驗測量DNA鏈斷裂堿性彗星實驗被用于定量DNA鏈斷裂。此法的要求如下：融化的瓊脂糖（1%）堆積到磨砂的玻片作為基礎(chǔ)層。使用蓋玻片蓋住，保持在4直到它凝固。PBMCs(1105/mlcells/ml)和0.5%融化的瓊脂糖(lowmelting,Sigm

10、aAldrich,USA)以1:10(v/v)在37輕輕混勻。基礎(chǔ)層凝固后，融化的瓊脂糖中的細胞混合物(250ul)在玻邊上擴散。注意玻片上瓊脂糖區(qū)域基礎(chǔ)層樣本的擴散。玻片放在平面上在黑暗中保持30min以促進樣本的凝固。含有細胞層的瓊脂糖凝固不久后，移除蓋玻片，進行裂解步驟。玻片進入新鮮制備的預(yù)冷的裂解液中(2.5MNaCl,100mMEDTA,10mMTrizmabase,10%DMSO,and1%Triton-X-100,pH10.0)，在4保存20min。裂解步驟結(jié)束后，去除玻片多余的緩沖液，浸入新鮮制備的堿性溶液，pH13.0，含有0.6gNaOH和20mMEDTA，在黑暗中室溫保存

11、30min。最后玻片從堿性溶液轉(zhuǎn)移到水平電泳儀，玻片平放在凝膠盤上，和電極等距離。堿性電泳液含有12gNaOH和500mMEDTA(pH8.0)，小心將它傾倒進電泳緩沖槽中直到溶液的水平面淹沒樣本玻片。電泳在20V300mA進行20min。電泳結(jié)束后，玻片在中性緩沖液(0.4MTrisHCl,pH7.5)中沖洗5min。將玻片用70%酒精固定，在空氣中干燥，使用1SyBr綠色染料染色。使用熒光顯微鏡(NikonEclipseTi-Uinvertedmicroscope,Japan).放大20倍在黑暗中觀察。隨機選擇100個細胞（每個玻片50個）使用TriTekCometScoreTMVersi

12、on1.5定量。圖1顯示了各種劑量組的圖像。不同劑量組DNA損傷尾部定量用圖2的柱狀圖顯示。使用磷酸化H2AX檢測DNA損傷我們把磷酸化的作為生物標(biāo)志物，使用共焦顯微鏡檢查DNADSB。檢測H2AX焦點的方法如前面描述的要求。靜脈血液樣本從隨機的健康的個體收集，用0.1、0.3、0.6、1.0和2.0Gy照射，設(shè)立陰性照射對照。簡單地說，要求如下：從照射的全血分離PBMCs，照射后在37培養(yǎng)30min，然后在冰上用1%甲醛固定15min，隨后在70%的酒精中培養(yǎng)2h。關(guān)于通透性，也在1%BSATriton-X-100PBS溶液（牛蛋白血清和Triton-X-100的磷酸緩沖鹽的混合物）中培養(yǎng)細

13、胞。在4含有Anti-phospho-HistoneH2AX(Ser139)和05-636(Millipore,Temecula,CA,USA)10g/ml的1%BSATri-ton-X-100PBSsolution(BSATPBS)中培養(yǎng)細胞過夜。過夜培養(yǎng)后，使用含有0.05%Tween20的1%BSATPBS溶液沖洗細胞，使用AlexaFluor488標(biāo)記的RabbitAnti-mouseantibodyA-11059Molecularprobes(Invitrogen,Eugene,Oregon,USA)培養(yǎng)。標(biāo)記的細胞稀釋成濃度為1(106cells/ml)，100l懸浮液傾倒在涂有P

14、oly-L-Lysine的蓋玻片(BioCoatTM354085,BDBiosciences,India)上，在黑暗中室溫保存30min。經(jīng)過細胞的適當(dāng)粘附性，BSATPBSTween20溶液沖洗蓋玻片2次。利用ProlongGoldAntifadeDAPI試劑和DAPI,P-36935,分子探針(Invitrogen,Eugene,Oregon,USA)將蓋玻片蓋在玻璃片上，在共焦顯微鏡(CarlZeiss,Model-LSM510Meta,Germany)下觀察。圖2顯示了劑量和H2AX焦點增加相關(guān)的信息。總RNA的提取和cDNA的制備以及mRNA表達的分析從PBMCs提取總的RNA研究了

15、0.1、0.3、0.6、1.0和2.0Gy(劑量率70cGy/min)劑量組的DNA損傷應(yīng)答基因的基因表達譜。在1和5h從照射的全血分離PBMCs，使用HipuraRNA提取試劑盒(HimediaLaboratoryPvt.Ltd.Mumbai,India)從PBMCs提取總的RNA。（因為從全血分離PBMCs需要1h，培養(yǎng)0和4h觀察基因表達譜，因此表達視為1和5h。）此外，對這些基因進行適應(yīng)反應(yīng)研究。分別用3個不同的吸收劑量(0.1、0.3和0.6Gy)照射全血，其次是4h后2.0Gy的攻擊劑量。分別從每個血液樣本提取總的RNA，給予吸收劑量，其次是4h后2.0Gy的攻擊劑量。使用pico

16、dropMicrolitre分光光度計定量RNA，在260/280nm檢查純度。RNA的完整性用0.8%的瓊脂糖凝膠和溴化乙錠染色檢查。輪廓清楚的28S和18S條帶的RNA樣本作為合成cDNA。cDNA合成和實時定量PCR（RT-qPCR）對于每一個等份樣本，利用轉(zhuǎn)錄子高保真cDNA合成試劑盒(RocheDiagnostics,GmbH,Germany)將總RNA(250ng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。進行RT-qPCR定量選擇基因(ATM,ATR,CDKN1A,GADD45A,P53,MDM2,CDK2,andCyclinE)mRNA的表達水平。利用LC480實時定量PCR儀(RocheDiagno

17、stics,GmbH,Germany)在96多孔板上進行RT-qPCR。重復(fù)進行所有的反應(yīng)，使B-Actin和B2M正?；?。在基線表達沒有觀察到顯著的變化。因此，利用肌動蛋白作為所有基因的相對量。所有的引物設(shè)置從美國的Sigma-Aldrich獲得。表1列出了本研究的引物序列。每一個RT-qPCR反應(yīng)都在在總體積為0.25mMofeachdNTPs(RochediagnosticsPvt.Ltd.GmbH,Germany),0.5UofFastTaqDNApolymer-ase(RocheDiagnosticsPvt.Ltd.GmbH,Germany),5.0pmolsofbothforwar

18、dandreverseprimers,and0.39ofSYBRgreen(SigmaAldrich,USA)中進行。所有基因進行實時定量q-PCR共40個循環(huán)，步驟如下:在95預(yù)培養(yǎng)5min，然后95變性10s，59退火30s，72延伸30s。熔解曲線分析分三步完成：95熔化5min，然后59退火1min，72延伸，最后一步在4010s。進行溶解曲線分析也確保擴增的DNA是感興趣的產(chǎn)物。利用LC480軟件1.1進行相對定量。結(jié)果用Pfaffle表述的標(biāo)準(zhǔn)化率表示。Normalizedratioconc:target=（conc:reference）sample:（conc:target=co

19、nc:reference）calibrator.統(tǒng)計分析對對照和照射樣本的平均表達水平進行配對t檢驗。對1和5h照射血液樣本的所有8個基因的mRNA表達水平進行回歸分析研究相關(guān)性。利用SigmaStat軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果研究照射全血的DNA損傷和mRNA表達模式的水平，它們暴露的劑量組是0.1和2.0Gy，設(shè)立陰性照射對照。利用單細胞凝膠電泳（彗星實驗）對這些個體進行DNA鏈斷裂定量，特別是尾部DNA百分數(shù)。如圖2顯示，在DNA損傷尾部觀察到隨劑量點有明確的劑量反應(yīng)。它很好地補充了圖3顯示H2AX焦點信息隨劑量增加。研究了在1和5h同一劑量組照射全血8個DNA損傷應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄表達模式。A

20、TM、ATR、CDKN1A、GADD45A、P53、MDM2、CDK2和CyclinE的相對量利用肌動蛋白基因標(biāo)準(zhǔn)化。比較照射后1和5h這些基因的平均相對表達，用直方圖表示（圖4a-h）。我們的結(jié)果顯示，達到1.0Gy，當(dāng)5h時，GADD45、CDKN1A和P53有明確的照射劑量反應(yīng)，與1h相比，2.0Gy時的表達水平下降。進行配對t檢驗研究1和5h時表達水平的顯著性。ATM顯示表達譜在0.3、0.6和1.0Gy(P=0.04）有輕微增加，但是在2.0Gy沒有觀察到表達水平的顯著變化。達到1.0Gy時，ATR轉(zhuǎn)錄譜沒有顯示任何增加反應(yīng)，當(dāng)2.0Gy5h顯著上調(diào)。至于MDM2，在0.32.0Gy

21、5h(P=0.03)觀察到顯著的轉(zhuǎn)錄變化。關(guān)于CDK2，所有劑量組的表達水平都有輕微增加，但是不顯著。在5h，CyclinE在所有劑量組(P=0.02)都顯示顯著上調(diào)，與1h相比，并沒有觀察到顯著性。達到1.0Gy，8個基因中的3個基因(GADD45A,CDKN1A,andP53)表達水平顯示顯著增加趨勢(P0.05)。我們進行回歸分析找出在1和5h觀察表達模式的關(guān)聯(lián)。ATR(R=0.956,P=0.03)、CDK2(R=0.953,P=0.03),和CDKN1A(R=0.995,P=0.001)表達譜的趨勢檢驗顯示顯著差異。適應(yīng)反應(yīng)研究對樣本進行基因表達分析，使用吸收劑量處理樣本：0.1、0

22、.3和0.6Gy，然后利用攻擊劑量2.0Gy評估適應(yīng)反應(yīng)，如果存在在圖5a，b顯示在本研究中，認為吸收劑量是0.1、0.3和0.6Gy，在ATM、ATR、MDM2、GADD45A和CDKN1A沒有觀察到適應(yīng)反應(yīng)。然而，CyclinE、CDK2和P53顯示適應(yīng)反應(yīng)(P0.05)。ATM顯示適應(yīng)反應(yīng)，但是在吸收劑量0.1和0.3Gy不顯著，其次是攻擊劑量2.0Gy。在0.3Gy吸收劑量，ATR顯示和2.0Gy觀察到的表達相似的表達。有趣的是，雖然CDKN1A表達譜顯示依賴劑量增加，但是在3個吸收劑量的一個都沒有觀察到適應(yīng)反應(yīng)。類似地，在0.1和2.0Gy時，GADD45A表達譜顯示上調(diào)增加。但是在

23、3個吸收劑量的一個都沒有觀察到適應(yīng)反應(yīng)。P53在所有劑量組也顯示上調(diào)增加，但是只有在吸收劑量0.1Gy時顯示適應(yīng)反應(yīng)。CDK2在0.3和0.6Gy顯示適應(yīng)反應(yīng)。但是在吸收劑量0.1Gy時顯示和2.0Gy相似的表達。CyclinE在所有的三個劑量組都顯示穩(wěn)定的適應(yīng)反應(yīng)。MDM2完全不顯示適應(yīng)反應(yīng)。討論哺乳動物細胞具有對包括電離輻射的生理和基因毒性應(yīng)激的復(fù)雜分子反應(yīng)。許多這樣的反應(yīng)是通過基因表達改變介導(dǎo)的。大部分對電離輻射基因表達調(diào)節(jié)的先前研究是利用高劑量暴露進行的，但是從治療或環(huán)境劑量的角度來看，這與來自低劑量暴露的數(shù)據(jù)相關(guān)。利用DNA損傷相關(guān)mRNA水平表達譜評估個體對電離輻射的敏感性，這對人

24、群監(jiān)測、職業(yè)的和放療接觸人群非常重要。研究已經(jīng)證明，正常人群輻射應(yīng)答基因的基線表達水平廣泛變化。人群中的輻射敏感性和輻射耐受性個體可能易于有這種變化。電離輻射導(dǎo)致人類細胞DNA損傷譜。低和高LET照射都導(dǎo)致獨立和集群的DNA損傷，后者更復(fù)雜。集群損傷可能是DSB或沒有DSB的氧化集群DNA損傷，這在非常低的劑量時可能引起。然而，這些復(fù)雜的損傷很難修復(fù)。此外，在這種暴露下，集群DNA損傷的過程可能產(chǎn)生DSBs。并不知道這些結(jié)果表達水平的結(jié)果。通過堿性彗星實驗可以測量非DSB損傷；而DSBs損傷可以通脈沖場電泳和中性彗星實驗檢測。PBMCs可用的資料有限，因此，我們曾經(jīng)努力研究在這樣的暴露下是否可

25、以檢測和誘發(fā)鏈斷裂和DSBs。利用彗星實驗和H2AX生物標(biāo)志物，我們觀察到DNA鏈斷裂中DNA尾部的百分比隨劑量增加而增加。類似地，我們觀察到H2AX焦點形成隨劑量增加而增加。在DNA損傷反應(yīng)中，我們觀察到，急性射線照射的正常個體，在照射后5h，其mRNA表達水平增加。我們已經(jīng)證明CDK2和CyclinE有放射敏感性反應(yīng)，p53與它們的mRNA表達水平無關(guān)。電離輻射的細胞反應(yīng)由基因介導(dǎo)的，它們控制多方面的調(diào)節(jié)通路，包括細胞周期、凋亡和DNA修復(fù)。報道人類PBMCsp53、p21、DDB2、cyclinG1和GADD45等重要基因和一些凋亡基因如BAX和Bcl-2等有輻射轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。細胞周期調(diào)節(jié)基

26、因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與DNA損傷檢查點的功能密切相關(guān)，基因表達的改變可能是誘發(fā)細胞周期阻滯的機制。在這項研究，我們發(fā)現(xiàn)，0.1和1.0Gy射線暴露后，P53、CDKN1A(p21)、GADD45A、CDK2和CyclinEmRNA表達水平顯著上調(diào)。在此指出的是，這里使用的PBMCs不是增殖細胞。一些報告利用重點顯示哺乳動物細胞輻射暴露的適應(yīng)反應(yīng)，例如突變、存活和染色體損傷。Olivieri等報道了體外低劑量電離輻射暴露時，人類淋巴細胞的適應(yīng)反應(yīng)。然而，這些基因轉(zhuǎn)錄水平的適應(yīng)反應(yīng)并不知道。血液細胞適應(yīng)反應(yīng)的體外研究對人類健康有重要意義。它產(chǎn)生強大的分子防御機制從而激活或增強DNA修復(fù)機制。雖然輻射適應(yīng)反

27、應(yīng)發(fā)現(xiàn)后，在體外對人類細胞系進行了大量的分子研究，但是PBMCs的可用資料有限。在這項研究中，我們研究了三個單獨吸收劑量組的劑量反應(yīng)關(guān)系和輻射適應(yīng)性質(zhì)，例如0.1、0.3和0.6Gy。一般來說，ATM和ATR是DNA損傷傳感器，它們通過DNA損傷激活，參與與細胞周期檢查點相關(guān)的信號通路并通過激活包括TP53的大量轉(zhuǎn)錄因子參與DNA修復(fù)。類似地，也顯示射線也和誘發(fā)GADD45，證明X射線的五個基因存在劑量關(guān)系，換言之，CDKN1A、GADD45、MDM2、ATF3和BAX對2和50cGy的急性射線暴露有反應(yīng)，他們發(fā)現(xiàn)，在劑量率較低時，GADD45A和CDKN1A被誘導(dǎo)的水平較低。有趣的是，ATM和ATR的表達水平?jīng)]有顯示任何變化。這個原因尚不清楚。這需要進一步探討增值的淋巴細胞。我們已經(jīng)證明人類血細胞0.1-2.0Gy體外輻射暴露可以誘發(fā)參與G0/G1檢查點通路的DNA損傷應(yīng)答基因的mRNA表達水平。利用單細胞電泳和H2AX的DNA損傷研究補充了我們的數(shù)據(jù)。圖2顯示尾部DNA損傷呈劑量依賴性增加。在這項