AFP的檢測1班3組演示教學

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。AFP的檢測1班3組-AFP的免疫檢測甲胎蛋白(AFP)主要在胎兒肝中合成,分子量6.9萬,在胎兒13周AFP占血漿蛋白總量的13。在成人,AFP可以在大約80的肝癌患者血清中升高，在生殖細胞腫瘤出現(xiàn)AFP陽性率為50。在其他腸胃管腫瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者亦可出現(xiàn)不同程度的升高。但當肝細胞發(fā)生癌變時，卻又恢復(fù)了產(chǎn)生這種蛋白質(zhì)的功能而且隨著病情惡化它在血清中的含量會急劇增加，甲胎蛋白就成了診斷原發(fā)性肝癌的一個特異性臨床指標。過去一直認為是診斷原發(fā)性肝癌的特異性腫瘤標志物，具有確立診斷、早期診斷、鑒

2、別診斷的作用。近年大量的臨床卻發(fā)現(xiàn)，AFP達到上千，但多年都沒有肝癌的跡象；同時發(fā)現(xiàn)約20的晚期肝癌患者，直至病故前，AFP仍不超過10。甲胎蛋白是肝癌的特異性標志，但血清甲胎蛋白陽性未必都是肝癌。在臨床中發(fā)現(xiàn)，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高的患者同時有血清甲胎蛋白升高。AFP單克隆抗體的制備單抗的理化性狀高度均一，生物活性單一，與抗原結(jié)合的特異性強，可重復(fù)性高，對環(huán)境的高度敏感性，弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng)，便于人為處理和質(zhì)量控制并且來源容易。1、原理：是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經(jīng)抗原免疫能產(chǎn)生抗體的小鼠脾細胞和能在體外長期繁殖的小鼠骨髓瘤細胞，用聚乙二醇（PEG）為細

3、胞融合劑使細胞融合產(chǎn)生雜交瘤細胞，通過次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷（HAT）選擇基的作用只讓融合成功的雜交瘤細胞生長，經(jīng)反復(fù)的免疫學檢測篩選和單個細胞培養(yǎng)，最終獲得既能產(chǎn)生所需單克隆抗體又能長期體外繁殖的雜交瘤細胞系。將這種細胞擴大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔，可從小鼠腹水中得到高效價的單克隆抗體。2、制備步驟1)獲得抗原：市場上購得商品化AFP,免疫BALB/c小鼠，獲得致敏的B淋巴細胞；2)細胞的選擇與融合：建立雜交瘤細胞的目的：是制備對抗原特異的單克隆抗體，所以融合細胞一方必須選擇經(jīng)過抗原(AFP)免疫的B細胞，通常來源于免疫動物的脾細胞。脾是B細胞聚集的重要場所，無論以何種免疫方式刺激，脾

4、內(nèi)皆會出現(xiàn)明顯的抗體應(yīng)答反應(yīng)。而另一個細胞則是為了保持融合后的細胞在體外能夠長期存活并無限分裂、繁殖，通常選擇小鼠骨髓瘤細胞。細胞的融合是產(chǎn)生雜交瘤細胞的中心環(huán)節(jié)，使用細胞融合劑造成細胞膜一定程度的損傷，使細胞易于相互粘連而融合在一起，最佳的融合效果應(yīng)是最低程度的細胞損傷而又產(chǎn)生最高頻率的融合。聚乙二醇是目前最常用的細胞融合劑，一般的濃度為40%左右。步驟：將骨髓瘤細胞與脾細胞按1:21:10比例混合，加入PEG，誘導兩種細胞融合，時間控制在2分鐘以內(nèi)，再加入培養(yǎng)液緩慢稀釋PEG融合液至失去融合作用，融合細胞形成具有2個或多個核的異形體，最終產(chǎn)生雜交細胞。3）選擇培養(yǎng)基腫瘤細胞合成DNA通常途

5、徑有兩條：一為生物合成的主要途徑，可被葉酸拮抗物（氨基蝶呤）阻斷；另為替代途徑，葉酸代謝受阻時，細胞通過HGPRT和TK，利用核苷酸前體物合成核苷酸，進而合成DNA。HAT培養(yǎng)液篩選后，只有具有兩親本細胞雙重特性的雜交瘤細胞能長期生存并產(chǎn)生抗體，成為制造單克隆抗體的細胞源。4）陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)（有限稀釋法）有限稀釋法的原理為將細胞懸液連續(xù)稀釋，最終至96孔板每個培養(yǎng)孔內(nèi)平均含一個細胞，培養(yǎng)34天后，選擇能分泌抗體的單個細胞群落陽性孔，反復(fù)多次克隆，獲得由單個細胞增殖形成同源性的雜交瘤細胞克隆。方法：經(jīng)有限稀釋后，將細胞培養(yǎng)至覆蓋0%20%孔底時，吸取培養(yǎng)上清用ELISA測抗體含量，依

6、AFP抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細胞克隆化，后進行抗原特異的ELISA測定，選出高分泌特異性細胞株擴大培養(yǎng)或凍存。目前采用液氮保存雜交瘤細胞。細胞放入液氮前，需要逐步降溫，如果凍存管放置于-80低溫冰箱過夜后再放入液氮中，可長期保存。復(fù)蘇細胞時，凍存管取出后，立即37水浴，使之融化。5）AFP單抗獲得（動物體內(nèi)誘生法）常選用BALB/c小鼠或與BALB/c小鼠雜交的F1代小鼠為接種動物。接種前一周，在小鼠腹腔內(nèi)注入降植烷或醫(yī)用石蠟油0.5ml。接種時，每次向小鼠腹腔注射（0.51）106個雜交瘤細胞。接種后1014天，可分次采集腹水，一只可得1020ml。將收集的腹水離心去除細胞

7、，滅活（5630分鐘），再離心，取上清液，加入0.1疊氮鈉，分裝保存于-20。6）單克隆抗體的純化（親和層析法）親和層析是一種吸附層析，抗原（或抗體）和相應(yīng)的抗體（或抗原）發(fā)生特異性結(jié)合，而這種結(jié)合在一定的條件下又是可逆的。所以將抗原（或抗體）固相化后，就可以使存在液相中的相應(yīng)抗體（或抗原）選擇性地結(jié)合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開，達到分離提純的目的。方法：取適量腹水離心取上清，用磷酸鹽緩沖液（PBS)稀釋4倍，4過夜，離心取上清，按柱體積1/10加樣，用0.01mol/LPH7.4的PBS液洗脫，流速為1ml/min，再用檸檬酸緩沖液洗脫抗體，收集洗脫成分。7）、單克隆抗體鑒定

8、：包括特異性鑒定、效價測定、純度鑒定及親和力鑒定二、檢測方法1.化學發(fā)光免疫分析技術(shù)(1)化學發(fā)光酶免疫分析（CLEIA）1)原理：用參與催化某一化學發(fā)光反應(yīng)的辣根過氧化物酶來標記AFP單克隆抗體，與待測標本中相應(yīng)的抗原AFP發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物魯米諾，酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再傳送至計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。2)操作方法：抗體包被：由聚苯乙烯高分子單體聚合成的微球包被AFP單抗加樣：標本-洗滌-辣根過氧化物酶標記的單抗-洗滌-加底物魯米諾，H2O2和發(fā)光增強

9、劑顯色：辣根過氧化物酶催化魯米諾顯色3）方法學評價：發(fā)光過程中作為標記物的酶基本不被消耗，而反應(yīng)體系中發(fā)光劑充分，因此發(fā)光信號強而穩(wěn)定，且發(fā)光時間較長，檢測方式簡單，成本較低。（2）直接化學發(fā)光免疫分析1）原理：用化學發(fā)光劑吖啶脂直接標記AFP單克隆抗體，與待測標本中相應(yīng)的抗原AFP發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶脂標記抗體復(fù)合物，加入氧化劑H2O2和pH糾正液NaOH，成為堿性環(huán)境，吖啶脂即可在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收，記錄單位時間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分光的積分，與待測抗原量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。2）操作方法：抗體包被：

10、由聚苯乙烯高分子單體聚合成的微球包被AFP單抗，封閉加樣：標本-洗滌-加入吖啶酯標記的AFP單抗-洗滌-加入氧化劑（H2O2）和PH糾正液（NaOH）顯色：吖啶脂在堿性環(huán)境中直接分解發(fā)光3）方法學評價：CLIA技術(shù)是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，它繼承了同位素靈敏度高的優(yōu)點，同時克服了其放射性污染及半衰期短的缺點。由于采用自動化儀器分析，實驗條件標準化，人為影響小，試劑穩(wěn)定，操作簡單無污染。(3)電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA）1)原理：是以電化學發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕標記抗體（抗原），以三丙胺（TPA）為電子供體，在電場中因電子轉(zhuǎn)移而發(fā)生特異性化學發(fā)光反應(yīng)。2)操作方法：抗體包被：由磁性微球包被AFP單

11、抗加樣：標本-洗滌-加入三聯(lián)吡啶釕標記的AFP單抗-洗滌-加入電子供體三丙胺(TPA)緩沖液顯色：三聯(lián)吡啶釕和TPA在電場中進行電子轉(zhuǎn)移并發(fā)光3）方法學評價：電化學發(fā)光免疫分析法是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應(yīng),包括電化學和化學發(fā)光兩個過程,可對反應(yīng)進行精確控制,能對各種物質(zhì)進行快速分析,是目前最先進的標記免疫檢測技術(shù)，其靈敏度高，準確性好、快捷、簡便,超過常用放射免疫法和酶聯(lián)免疫法，可為臨床提供理想的檢測結(jié)果。但儀器昂貴,試劑成本也較高,難以在基層醫(yī)院開展。2酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）雙抗體夾心法1）原理：先將特異性抗體與固相載體結(jié)合，形成固相抗體；加入待測標本并溫育，使

12、標本中的抗原與固相抗體充分反應(yīng)，形成固相抗體抗原復(fù)合物，洗滌除去其他游離成分；然后加入酶標記抗體并溫育，使固相抗體抗原復(fù)合物與辣根過氧化物酶標記抗體結(jié)合，形成固相抗體-待測抗原-酶標記抗體復(fù)合物（雙抗體夾心），洗滌除去游離酶標記抗體；加底物，固相載體結(jié)合的酶可催化底物成為有色產(chǎn)物，根據(jù)產(chǎn)物的顯色程度進行抗原的定性或定量檢測。2）操作方法：抗體包被：將AFP單克隆抗體溶于緩沖液（pH9.6碳酸鹽緩沖液）中，加于由聚苯乙烯制作的ELISA板孔中，4過夜或372小時，再用5%-20%的小牛血清封閉。加樣：將包被孔編號，設(shè)置空白對照，再在相應(yīng)的孔上分別加入陰陽性對照和待測樣品，隨即加入由改良過碘酸鈉法

13、制備的酶標抗體。輕輕振蕩混勻后，置37溫育。洗滌：在洗板機上選擇5次洗滌程序，洗板后在吸水紙上拍干。顯色：每孔加底物，再加顯色劑，充分混勻，室溫（1825）避光反應(yīng)5分鐘。終止每孔加硫酸終止液終止反應(yīng)，陽性者從藍色變?yōu)辄S色。結(jié)果判斷：酶標儀檢測：選擇波長450nm，用空白孔校零，在終止反應(yīng)后的10分鐘內(nèi)測定各孔OD值。計算：用雙對數(shù)線性回歸或其他適宜的曲線擬合方式繪制標準曲線，利用該標準曲線計算待測樣品的AFP含量。3)方法學評價：酶聯(lián)免疫吸附法操作簡單，適用基層單位使用，但靈敏度和精密度稍差，線性范圍較窄，操作簡單,但其線性范圍較窄,而且存在“鉤狀效應(yīng)。3膠體金免疫技術(shù)斑點金免疫層析試驗（D

14、ICA）1）原理：是將膠體金標記技術(shù)和蛋白質(zhì)技術(shù)相結(jié)合的以醋酸纖維素膜為載體的快速的固相膜免疫分析技術(shù)。在膜的一端滴加的標本溶液受載體膜的毛細管作用向另一端移動，如同層析一般，在移動過程中被分析物與固定于載體膜上某一區(qū)域的抗體結(jié)合而被固相化，無關(guān)物則越過該區(qū)域而被分離，然后通過膠體金的呈色條帶來判讀實驗結(jié)果。2）操作方法：在進行任何測試前必須先完整閱讀使用說明書，使用前將試劑和樣品恢復(fù)至室溫。取出檢測試紙條后應(yīng)在1小時內(nèi)盡快使用。將試劑條按箭頭方向插入血清標本中，至少10秒鐘后取出平放于干凈平整的臺面上；亦可以不取出，一直放在標本中直到讀結(jié)果。注意：血清液面不能超過試劑條的標記線。等待紅色條帶

15、的出現(xiàn)，測試結(jié)果應(yīng)在1030分鐘讀取。3）結(jié)果判斷：陰性結(jié)果：僅出現(xiàn)一條紅色條帶，即對照線區(qū)出現(xiàn)有色條帶，檢測線區(qū)無色，為正常。陽性結(jié)果：出現(xiàn)兩條紅色條帶，即對照線和檢測線區(qū)均出現(xiàn)紅色條帶，表明AFP含量高于25ng/ml。無效結(jié)果：當對照線區(qū)未出現(xiàn)有色條帶，表明試驗失敗或試劑失效，需進行重復(fù)檢測。注意：在規(guī)定的觀察時間內(nèi)，不論檢測線區(qū)有色條帶的顏色深淺，即使非常弱的色帶也應(yīng)判為陽性。4）方法學評價：斑點金免疫層析試驗，本法雖然存在靈敏度及準確度不及ELISA和化學發(fā)光等方法，但本法除層析條裝置外，不需任何儀器設(shè)備。且具有操作簡便，快捷以及操作人員不需技術(shù)培訓，試劑穩(wěn)定，便于保存等特點，故臨床

16、可用于某些疾病的普查。4.時間分辨熒光免疫測定（TRFIA）雙抗體夾心法1）原理：固相抗體和Eu3+標記抗體與待檢抗原結(jié)合，形成固相抗體-待檢抗原-Eu3+標記抗體復(fù)合物，在酸性增強液作用下，Eu3+解離下來并被增強液中的螯合劑螯合成一個具有高強度熒光的穩(wěn)定螯合物，在340nm激發(fā)光下發(fā)射613nm熒光。鑭系元素的熒光光譜Stokes位移較大，一般為273nm，很容易利用簡單的濾光片把激發(fā)光和散射光分開，同時鑭系元素螯合物的熒光壽命較長（10-1000微秒），檢測時可在短壽命本底熒光完全衰變后，再測定鑭系元素螯合物的特異性熒光。因此選擇鑭系元素Eu3+作標記物。Stokes位移：激發(fā)光譜與發(fā)射

17、光譜的波長差，越大越好。2）操作方法：包被：將AFP特異性抗體包被于固相載體上加樣：加入待測標本洗滌加入Eu3+標記的抗體（利用具有雙功能基團的螯合劑，一端與Eu3+結(jié)合，另一端與抗體上的氨基結(jié)合）洗滌加入酸性增強液結(jié)果測定：在340nm的激發(fā)光照射下，游離出的Eu3+螯合物可發(fā)出613nm的熒光。經(jīng)時間分辨熒光檢測儀測定并推算出待檢抗原的含量。3）方法學評價：TRFIA是20世紀80年代迅速發(fā)展起來的一種公認最有發(fā)展前途的非放射免疫標記技術(shù),它采用鑭系金屬離子作為示蹤物,利用時間分辨熒光測定法排除了非特異熒光干擾,真正實現(xiàn)零本底、靈敏檢測超過TPFIA法；對AFP的檢測可以看出,該法對肝癌、

18、肝硬化、肝炎患者中AFP含量檢測與RIA和ECLIA無明顯差異，相關(guān)性和精密度等指標都與另兩種方法相當。具有靈敏度高示蹤物穩(wěn)定、標準曲線劑量范圍寬、自動化程度高、操作簡便。儀器和試劑較為便宜等,造合在各類醫(yī)院中開展,是一種較理想的非放射性標記分析方法。5.速率散射比濁法1）原理：抗原抗體混合瞬間便發(fā)生反應(yīng)，在抗體過量的前提下，反應(yīng)由慢到快，單位時間內(nèi)形成的復(fù)合物不斷增多，隨后逐漸減慢，連續(xù)動態(tài)檢測可發(fā)現(xiàn)某一時間段抗原抗體反應(yīng)速率最快，單位時間內(nèi)形成的免疫復(fù)合物最多，散射光強度變化最大，即速率峰，該峰值大小與抗原濃度呈正相關(guān)。選取速率最大，且與被測物濃度變化呈線性關(guān)系的速率峰值，制作劑量-反應(yīng)曲

19、線，通過計算機計算可獲得被測物濃度的量。2）操作方法：仔細閱讀說明書，編制分析參數(shù)將待測標本和抗血清分別加入樣本盤和試劑盤，輸入命令，選擇檢測AFP，儀器自動取樣檢測并動態(tài)監(jiān)測抗原抗體反應(yīng)的速率，計算機對測量數(shù)據(jù)進行自動分析處理，即可得知標本中抗原含量。注：抗原過量檢測：在測定過程中，抗原抗體迅速反應(yīng)，在規(guī)定時間內(nèi)反應(yīng)介質(zhì)中的抗體應(yīng)與標本中抗原全部結(jié)合，無游離抗原存在。此時再加入已知的相同抗原，該抗原與剩余游離抗體結(jié)合形成復(fù)合物，可出現(xiàn)第二個速率峰值信號，由此證明第一次速率峰值信號全部由待測抗原產(chǎn)生。如沒有出現(xiàn)第二高峰，則說明待測標本中抗原濃度過高，測定結(jié)果不準確，提示應(yīng)將標本進一步稀釋重新測

20、定，以保證檢測結(jié)果的準確性。3）方法學評價：速率散射比濁法，是抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的動力學檢測法，也是目前臨床應(yīng)用較多的一種方法，本法自動化程度高，具有快速，靈敏，準確，精密等優(yōu)點。并且采用抗原過量檢測方法，保證了結(jié)果的準確性。但儀器和試劑價格比較貴，對抗體的質(zhì)量要求很高。6.免疫放射分析（IRMA）雙抗體夾心法1）原理：先用固相抗體與抗原結(jié)合，再用過量的標記抗體抗原的另一決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-標記抗體復(fù)合物，洗棄剩余標記抗體，測固相上放射性。2）操作方法：用已知抗體包被于固相載體，用另一種已知抗體標記放射性核素125I,制備為標記抗體,與待測抗原反應(yīng)后形成包被抗體-待測抗原-標記抗體復(fù)合物。用已知濃度抗原的系列標準品進行反應(yīng)，可得到一條正向劑量反應(yīng)曲線，如將待測樣品進行同樣操作，則可從劑量反應(yīng)曲線查得樣品中的抗原濃度。3）方法學評價：放射免疫技術(shù)有較高的靈敏度，精密度和準確度，線性范圍寬，但是采用放射性核素作為示