藥學(xué)專業(yè)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃申請書文獻

1、2013年度國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng) 業(yè)訓(xùn)練計劃申報書基于菜豆假單胞菌毒素的生物源除草劑開發(fā) 及抗性基因資源挖掘指導(dǎo)教師:團隊成員:2013年3月- - / 15武漢大學(xué)2013年度大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃申報書填表時間：2013年03月10日項目名稱基于菜豆假單胞菌毒素的生物源除率劑開發(fā)及抗性基因資源挖掘項目創(chuàng)新特色概述?開發(fā)環(huán)境友好型的生物除率劑，打破跨國公司草甘麟和草俊 瞬的壟斷地位?改造產(chǎn)生菌株的抗性基因，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的除率劑 抗性基因，為開發(fā)轉(zhuǎn)基因抗除率劑作物儲備基因資源?綜合利用基因工程、細胞工程等分子生物學(xué)技術(shù)進行開發(fā)研 究項目所屬一級學(xué)科理學(xué)、農(nóng)學(xué)（跨學(xué)科）申請經(jīng)費10000元起

2、止時間2013年3月至2015年5月姓名學(xué)號院（系）、專業(yè)聯(lián)系電話()卜 i 1*青 B 人1一Aia-hArg trixpliideAJbhrgH- Ort 。-HN h MMP INotoxin由合成路線可知，參與藥效基團合成的基因有 ，因此可將與藥效基團合成無關(guān)的基因敲除或?qū)⒑铣伤幮Щ鶊F的基因組裝起來，構(gòu)建一個只合成藥效基團的合成途徑，這樣就可以減少合成步驟，降低物質(zhì)和能量消耗，以期提高毒素的產(chǎn)量。實驗材料：宿主菌銅綠假單胞菌實驗過程：限制性內(nèi)切酶技術(shù)與擴增技術(shù)結(jié)合克隆與藥效基團合成相關(guān)的基因，按照基因簇中基因排列順序，用連接酶組裝成藥效基團基因簇；選擇合適的載體和藥效基團基因簇，進行啟

3、動子改造和密碼子優(yōu)化，將重構(gòu)基因簇導(dǎo)入異源宿主菌(銅綠假單胞菌 )；發(fā)酵培養(yǎng)，檢測藥效基團的活性和合成單位，并與原始菌株相同環(huán)境下相同時間內(nèi)的相關(guān)數(shù)據(jù)比較，優(yōu)化異源表達系統(tǒng)。項目II.改良抗性基因，開發(fā)轉(zhuǎn)基因植物本方案擬采用基因工程和蛋白質(zhì)工程的方法，對抗性基因進行優(yōu)化改良，以提高其抗性。然后篩選合適的位點拆分，建立和轉(zhuǎn)化模式植物的方法，為開發(fā)轉(zhuǎn)基因作物打下基礎(chǔ)。.實驗材料：野生型煙草(L.),菜豆丁香假單胞菌 3121 ( .3121 ),大腸桿菌21 ( 21), 28a質(zhì)粒等。.實驗步驟：抗性基因的優(yōu)化改良易錯擴增設(shè)計引物，采用易錯擴增并誘導(dǎo)目的基因發(fā)生隨機性突變，得到具有不同位點的突變

4、基因構(gòu)建質(zhì)粒重組將突變基因裝載到大腸桿菌超量表達載體28a,得到重組質(zhì)粒。原核表達，篩選優(yōu)良突變基因?qū)⒅亟M質(zhì)粒轉(zhuǎn)到大腸桿菌 21中，挑取單菌落接種于含有高濃度的培養(yǎng)基中，經(jīng)抗性梯度培養(yǎng)后尋找存活下來的大腸桿菌，篩選抗性增強的抗性基因。真核表達，檢驗活性對優(yōu)良抗性基因進行修飾及加工，使其能在真核細胞中表達。將加工后的抗性基因?qū)肽繕?biāo)植株一野生型煙草中，檢驗其活性。拆分改良型基因并導(dǎo)入目標(biāo)植株一野生型煙草（ L.）花粉易攜帶抗性基因漂移產(chǎn)生超級雜草。目前解決思路是：由于花粉中只含有染色體，而葉綠體不能隨植物花粉轉(zhuǎn)移，因此可將改良型基因拆分成兩個沒有活性的基因片斷，一斷整合在染色體 上，另一斷插入葉

5、綠體 中。這樣花粉中只攜帶沒有活性的部分基因片斷，而避免了抗性基因的漂移產(chǎn)生超級雜草的安全性問題?？剐曰虿鸱治稽c的確定1根據(jù)的堿基序列，利用蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測分析網(wǎng)站對其抗性蛋白進行結(jié)構(gòu)預(yù)測，找到結(jié)構(gòu)域的交接位點。繼續(xù)利用 接點掃描系統(tǒng)（7 ）精確尋找改良型基因能夠進行拆分的位點。利用7轉(zhuǎn)座在靶的隨機位點上插入15（即編碼5個氨基酸短肽）的外源片段，通過鑒定目的蛋白能否忍受少量外源氨基酸多肽 的插入來尋找可能的拆分位點。抗性基因的拆分與介導(dǎo)載體的構(gòu)建采用方法，從上述的可拆分位點處將改良型基因拆分成N端與C端兩個片段，稱為和然后分別arglGNlntein-C與 內(nèi)含肽片段對應(yīng)基因的 N端和C

6、端融合。 見下圖詳解：核酸 argK-J| Intein-N)C 二argK N基因表達、蛋白融合 lntein r r/IargK-N蛋白質(zhì)工（argK-C7內(nèi)含肽自鶉切 Intein*目標(biāo)蛋白.CargKN農(nóng)桿菌介導(dǎo)融合基因轉(zhuǎn)入煙草愈傷組織2在野生型煙草（L.）中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)將融合基因N端插入核基因組，融合基因 C端插入葉綠體基因組。在細胞核內(nèi)和葉綠體內(nèi)表達的前體蛋白中的內(nèi)含肽可以互相識別進行蛋白剪接，形成了一個完整的有功能的目的蛋白產(chǎn)物 ，即抗除草劑蛋白，轉(zhuǎn)基因植株對除草劑表現(xiàn)出抗性。通過用含有的 培養(yǎng)液培養(yǎng)煙草愈傷組織，篩選產(chǎn)有抗性蛋白而存活下來的植株，進而大規(guī)模種植。反式剪接防止

7、基因漂流。編碼抗除草劑的基因改良型基因被拆分，轉(zhuǎn)入核中和葉綠體中。核基因片段融合了編碼反式剪接蛋白內(nèi)含肽剪接區(qū)域的端（）和編碼葉綠體定位的（），整合進葉綠體中的基因片段則融合了編碼反式剪接蛋白內(nèi)含肽剪接區(qū)域的端（）。轉(zhuǎn)錄和翻譯后，（）-（）導(dǎo)入葉綠體中，在那里通過反式剪接或介導(dǎo)的蛋白互補（）形成有活性的抗性蛋白。3參考文獻M C , F J , A E , al . A 7 一.2000,28 : 1067 1077.2頓寶慶、陸偉、張維、平淑珍、王旭靜、陳明、徐玉泉、金丹、王勁、趙仲麟、梁愛敏、侯松娜、.、林敏，熒光假單胞菌 G2.合酶的拆分和 介導(dǎo)的活性恢復(fù).科學(xué)通報.2006, 51 （

8、12）: 1479-1481.3靳茜、王志興、王旭靜、賈士榮，限控基因飄流的生物學(xué)措施研究進展，中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報2012,14 （5） :64-70.三、預(yù)期成果.對的合成機制有更深的理解，探索出一種可以高效生產(chǎn)的途徑。2.篩選得到對抗性提高的基因,建立拆分表達構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物的系統(tǒng)。.爭取整理發(fā)表1-2篇有關(guān)合成調(diào)節(jié)的科研論文，通過論文的發(fā)表，我們可以直接參與學(xué)習(xí)論文的 撰寫、修改和的發(fā)表全部過程，增強我們的知識產(chǎn)權(quán)意識。.通過此次創(chuàng)新實踐，提高隊員的專業(yè)知識水平和創(chuàng)新意識，激發(fā)隊員學(xué)習(xí)專業(yè)知識的興趣；培養(yǎng)實事求是、艱苦奮斗、的科學(xué)研究精神；提高隊員的綜合素質(zhì)，促進學(xué)生由知識型向能力型人才的轉(zhuǎn)變。四、詳細預(yù)算預(yù)算項目名稱簡要說明費用材料購置標(biāo)品、分子生物學(xué)試劑等4000測試化驗毒素活性、含