醫(yī)藥-臨床-護(hù)理心力衰竭衰竭的實(shí)驗(yàn)研究ppt課件

1、歡迎進(jìn)入學(xué)習(xí) 課堂心力衰竭的實(shí)驗(yàn)研究(Experimental Study of Heart Failure)病理生理學(xué)教研室 劉 潔心力衰竭時(shí)整體、器官、細(xì)胞和分 子水平的改變及其病理生理學(xué)意義利用基因敲除或轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究特 定基因或基因表達(dá)產(chǎn)物的功能心力衰竭研究的基本策略(Basic Strategies for Heart Failure Study)一、傳統(tǒng)心力衰竭動(dòng)物模型二、基因改造的動(dòng)物模型三、分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞四、干細(xì)胞與心肌梗死的治療Contents（Conventional Animal Models of Heart Failure）一、傳統(tǒng)心力衰竭動(dòng)物模型心 肌 受 損

2、( Impaired myocardium ) 心室負(fù)荷過(guò)重(Overload of ventricle) 其 他 ( O t h e r s ) 心 力 衰 竭 的 病 因(Causes of heart failure) Classification（一）冠狀動(dòng)脈結(jié)扎模型（二）壓力超負(fù)荷模型（三）容量超負(fù)荷模型（四）心動(dòng)過(guò)速起搏模型（五）其他模型（一）冠狀動(dòng)脈結(jié)扎模型（Coronary Ligation Models）大鼠、狗、家兔Establishment結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈Suitable Animal心肌缺血缺氧心肌代謝異常心 力 衰 竭心 肌 梗 死心 肌 受 損舒縮功能障礙 結(jié)扎左側(cè)

3、冠狀動(dòng)脈不完全結(jié)扎：慢性心肌缺氧導(dǎo)致HF完全結(jié)扎：心肌梗死導(dǎo)致HF（二）壓力超負(fù)荷模型 (Pressure Overload Models)主動(dòng)脈縮窄模型 (Aortic Banding Models)高血壓模型 (Hypertension Models)1.主動(dòng)脈縮窄模型（Aortic Banding Models）縮窄主動(dòng)脈Establishment左心室射血阻抗 左 心 衰 竭左心室壓力負(fù)荷過(guò)重主 動(dòng) 脈 縮 窄腹主動(dòng)脈縮窄：大鼠、家兔胸主動(dòng)脈降枝縮窄：豚鼠Suitable Animals2. 高 血 壓 模 型 (Hypertension Models)自發(fā)性高血壓大鼠(SHR) (S

4、pontaneously hypertensive rat)兩腎一夾腎性高血壓大鼠 (Two-kidney one-clip renal hypertension)左心室射血阻抗 左 心 衰 竭左心室壓力負(fù)荷過(guò)重高血壓外周阻力（三）容量超負(fù)荷模型（Volume Overload Models） 狗 ：建立動(dòng)靜脈瘺或破壞二尖瓣家兔：主動(dòng)脈瓣穿孔導(dǎo)致主動(dòng)脈返流大鼠：腹主動(dòng)脈與腔靜脈間造瘺Establishment左 心 衰 竭左心室舒張期容量負(fù) 荷 過(guò) 重破 壞 二 尖 瓣二尖瓣關(guān)閉不全主動(dòng)脈瓣穿孔主 動(dòng) 脈 返 流（四）心動(dòng)過(guò)速起搏模型（Tachycardia-pacing Models）狗：起

5、搏心率200 次/分家兔：起搏心率350400 次/分Establishment心 力 衰 竭心 輸 出 量心 動(dòng) 過(guò) 速心 肌 耗 氧 量心室充盈不足縮 短 舒 張 期（五）其他模型（Other Models）心 肌 病心 肌 損 害心肌舒縮功能障礙心 力 衰 竭 心肌病：阿霉素心肌病 心肌病倉(cāng)鼠整體水平研究器官組織水平研究細(xì)胞分子水平研究Applications 可對(duì)心力衰竭發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程進(jìn)行研究，包括代償期、從肥大到衰竭的過(guò)渡期、心肌重構(gòu)過(guò)程以及輕中度心力衰竭。AdvantagesLimitations動(dòng)物種屬差異很大，不同模型與心力衰竭病人的某些方面相似在動(dòng)物模型所得結(jié)果與心力衰竭病

6、人不完全相同細(xì)胞類型與刺激因素多樣而復(fù)雜（Gene-modified Animal Models of Heart Failure）二、基因改造的動(dòng)物模型研究心力衰竭的相關(guān)基因研究心力衰竭發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制Applications（一）基因敲除模型（Gene Knockout Models）Cardiac-specific “Knock-out”PMHC drives Cre recombinase expression. Cre recombinase catalyzes the recombination at a specific DNA sequence(named loxP site

7、). If a target gene is “floxed” by two loxP sites by gene targeting , Cre recombinase works as molecular scissors to cut the target gene out in a cardiac-specific manner, as Cre is expressed only in the cardiomyocytes.1. 肌肉 LIM 蛋白基因敲除小鼠（Muscle LIM Protein Gene Knockout Mice） 肌肉 LIM 蛋白調(diào)節(jié)肌肉分化，敲除其基因的純合

8、子將發(fā)展為擴(kuò)張性心肌病，伴心肌肥大、間質(zhì)細(xì)胞增生和纖維化，成年小鼠出現(xiàn)心力衰竭。（ Myogenic Factor 5 Gene Knockout Mice ）2. 肌肉因子 5基因敲除小鼠 Myogenic Factor 5參與肌細(xì)胞的增殖與修復(fù)，敲除其基因的小鼠將發(fā)展為擴(kuò)張性心肌病。（二）轉(zhuǎn)基因模型（Transgenic Models）Cardiac-specific Transgenic SystemA promotor region of a gene defines time- and tissue-specific expression of the gene. Cardiac M

9、HC gene promotor (PMHC) drives expression of the gene in a cardiomyocyte-restricted manner. A foreign gene connected to PMHC is expressed in the transgenic mouse in the same pattern as cardiac MHC .1. G蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠（G protein transgenic mice）(1) Gs 轉(zhuǎn)基因小鼠（ Gs Transgenic Mice ）過(guò)表達(dá)Gs慢性持續(xù)性交感刺激心 肌 病心 力 衰 竭心臟過(guò)表

10、達(dá)Gs的小鼠基因轉(zhuǎn)錄：心臟GsmRNA增加38倍蛋白含量：Gs含量增加3至5倍蛋白功能：Gs活性上升88%左室射血分?jǐn)?shù) (EF) 正常-AR激動(dòng)劑與受體親和力增強(qiáng)AC活性增加心肌對(duì)Iso和NE敏感性增加出 生 時(shí) 心肌病、心臟擴(kuò)大、左室EF下降1 4 個(gè) 月 后 病理檢查心肌纖維化心肌細(xì)胞數(shù)量減少殘余心肌細(xì)胞代償性 肥大、變性與萎縮(2) Gq 轉(zhuǎn)基因小鼠（ Gq Transgenic Mice ）2 倍表達(dá)：無(wú)明顯變化4 倍表達(dá)：心臟重量增加，PKC的膜轉(zhuǎn) 位增加，胎兒基因表達(dá)增加， 心肌收縮力減弱更高表達(dá)：動(dòng)物死于左右室衰竭和肺淤血小鼠心臟中過(guò)表達(dá)Gq 結(jié)扎主動(dòng)脈過(guò)表達(dá)Gq小鼠 失代償性離

11、心性肥大對(duì)照小鼠 代償性向心性肥大導(dǎo)入無(wú)活性Gq 抑制心肌肥大注射Gq抗體 消除ANP表達(dá)(3) RGS轉(zhuǎn)基因小鼠（ RGS Transgenic Mice ）G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白(regulator of G protein signalling, RGS) 心臟表達(dá)：RGS3/4作用：激活GTP酶，使Gq的信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)減弱RGS GqGTP酶活性 對(duì)照動(dòng)物 左室肥厚和 ANF表達(dá) RGS4轉(zhuǎn)基因小鼠 減輕 RGS4增強(qiáng)Gq失活，減輕心肌肥大結(jié)扎主動(dòng)脈（ -adrenoceptor Kinase or GPCR Kinase 5 Transgenic Mice ）2. -腎上腺素受體激酶或G蛋白

12、偶聯(lián)受體激酶5轉(zhuǎn)基因小鼠過(guò)表達(dá)-ARK或GPCRK 5心 力 衰 竭-AR 脫 偶 聯(lián)（ IGF-1 or NGF Transgenic Mice）3. IGF-1或NGF轉(zhuǎn)基因小鼠過(guò)表達(dá)生長(zhǎng)因子心肌細(xì)胞過(guò)度肥大心 力 衰 竭擴(kuò)張性心肌?。?Isolated/Cultured Cardiac Myocyte）三、分離培養(yǎng)的心肌細(xì)胞 在活細(xì)胞或分子水平研究心力衰竭發(fā)生、發(fā)展規(guī)律以及藥物作用等。ApplicationsAdvantages無(wú)神經(jīng)體液因素及肝腎解毒功能的影響無(wú)心肌組織中心肌細(xì)胞滲透延緩問(wèn)題,尤其適用于細(xì)胞內(nèi)外離子轉(zhuǎn)運(yùn)研究可排除血管因素在整體心肌組織解剖上的差異消除細(xì)胞間隙的影響及細(xì)胞

13、之間機(jī)械牽拉所造成的對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜的破壞（一）新生大鼠心肌細(xì)胞（ Neonatal Rat Cardiomyocyte ） 細(xì)胞純度高 刺激可控制AdvantagesIdentification of cell types in cultured cells. To characterize cell types in the culture, immunocytochemical staining was performed with anti-sarcomeric -actin antibody（400）.分化不完全肥大的誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)短刺激過(guò)分單純?yōu)槿斯は到y(tǒng)，必須嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件Limitati

14、ons（二）成年大鼠心肌細(xì)胞（ Adult Rat Cardiomyocyte ）細(xì)胞已分化Advantages分離培養(yǎng)的費(fèi)用高細(xì)胞成活的時(shí)間短Limitations四、干細(xì)胞與心肌梗死的治療(Stem Cell & Treatment of Myocardial Infarction)內(nèi)科藥物治療 心臟血運(yùn)的重建心臟移植術(shù) 干細(xì)胞移植Treatment of MII. Definition of Stem Cell 具有高度自我更新能力并有多向分化潛能的細(xì)胞，稱為干細(xì)胞。 II. Classification of Stem Cell胚胎干細(xì)胞 Embryonal Stem Cell軀體全能

15、干細(xì)胞 Somatic Totipotent Stem Cell組織庫(kù)軀體祖細(xì)胞（組織干細(xì)胞） Somatic Progenitor Cell of Tissue Reservoir胚胎干細(xì)胞（Embryonal stem cell, ESC）來(lái)源：胚泡內(nèi)細(xì)胞群或原生殖細(xì)胞特點(diǎn)：1.能在體外不斷生長(zhǎng)增殖 2.子代細(xì)胞有相同的基因型和表現(xiàn)型 3.具有多向分化潛能，可分化為各種 組織和器官骨髓干細(xì)胞（Bone Marrow Stem cell, BMSC）來(lái)源：骨髓分類：造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞特點(diǎn)：多向分化潛能與ESCs相似組織干細(xì)胞（Tissue Stem cell, TSC）來(lái)源：各種組織特

16、點(diǎn)：可塑性有限（limited plasticity）常用：成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞胚胎干細(xì)胞由于政治、倫理甚至宗教原因，遠(yuǎn)不能用于臨床。目前，只有自體同源的骨髓干細(xì)胞和骨骼肌成肌細(xì)胞可能用于心肌梗死后的心肌重建。（三）干細(xì)胞與心肌梗死1.骨髓干細(xì)胞移植（BMSC Transplantation）骨髓干細(xì)胞平滑肌細(xì)胞心肌細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞Preclinical Study單核骨髓干細(xì)胞平滑肌細(xì)胞心肌細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞穿越Coronary capillary內(nèi)皮分布于受損的心肌組織中Preclinical Study經(jīng)皮冠脈內(nèi)注射同源單核BMSC冠脈旁路移植術(shù)+同源BMSC心肌內(nèi)注射Phase I Clinic

17、al TrialBMSC TransplantationImproved Contractile Performance of Infarcted MyocardiumMyogenesisMyocytesAngiogenesisNew vesselsOperation Timing 心肌梗死后23天到數(shù)周過(guò)早：BMSC分化為炎癥細(xì)胞過(guò)晚：BMSC在陳舊的梗死瘢痕中失去分化能力 無(wú)副作用，尤其是無(wú)明顯的致心律失常效應(yīng)。Advantages2.骨骼肌成肌細(xì)胞移植（Skeletal Myoblast Transplantation）移植后存活率足夠高移植后可分化為心肌細(xì)胞樣細(xì)胞心肌細(xì)胞樣細(xì)胞可嫁接于

18、梗死的心肌組織Preclinical StudyABNon-stained photographs of preparations from in vitro cell culture (magnification 200). Myoblasts used for transplantation(A) and preparation confirming the cultured myoblasts capability of transformation into myocytes in vitro in serum-free conditions(B). 在多種動(dòng)物（大鼠、家兔、狗、豬、綿羊） 經(jīng)多種手段檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：移植后心肌舒縮功 能改善。Preclinical StudyPhase I Clinical Trial經(jīng)皮冠脈內(nèi)注射同源成肌細(xì)胞冠脈旁路移植術(shù)+同源成肌細(xì)胞心肌內(nèi)注射 骨骼肌成肌細(xì)胞高度耐缺氧，即使移植到陳舊性梗死瘢痕中仍可分化為心肌細(xì)胞樣細(xì)胞。Advantages 移植到陳舊性梗死瘢痕中有時(shí)會(huì)引起室性心律失常，可預(yù)防性使用胺碘酮。Limitations美國(guó)印第安納大學(xué)醫(yī)學(xué)院Field等和斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院Balsam等日前的2項(xiàng)研究結(jié)果使當(dāng)前的研究熱點(diǎn) “骨髓干細(xì)胞可修復(fù)心肌”理論遭受質(zhì)疑。他們發(fā)現(xiàn)，注入