蛋白純化培訓(xùn)總結(jié)(共6頁)

1、蛋白(dnbi)純化培訓(xùn)總結(jié)蛋白質(zhì)分離純化一般需經(jīng)過細(xì)胞破碎(p su)、澄清、分離等步驟。1 細(xì)胞(xbo)破碎常見的細(xì)胞破碎方法有超聲破碎法、反復(fù)凍融法、高壓勻漿法、珠磨破碎法等。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)條件來選擇合適的破碎方法。凍融法操作十分簡便，無需特殊設(shè)備，在實(shí)驗(yàn)室中使用很方便，但耗時(shí)，耗能，大規(guī)模應(yīng)用困難。珠磨破碎法適用范圍較廣，但對操作者的經(jīng)驗(yàn)水平要求較高，且制備量不易放大。本實(shí)驗(yàn)室主要采用高壓勻漿法破碎細(xì)胞，一方面可以得到充分破碎的細(xì)胞，高壓勻漿機(jī)的制冷系統(tǒng)也可減少蛋白質(zhì)的熱變性的可能，另一方面此種方法與其他方法相比，可在增大細(xì)胞破碎量的時(shí)候有效的節(jié)約時(shí)間。若不具備高壓勻漿破

2、碎細(xì)胞的條件，也可采用超聲破碎法，但超聲破碎的效率受到聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及菌種類型等多種因素的影響。2 澄清經(jīng)過細(xì)胞破碎的蛋白樣品中含有大量的細(xì)胞碎片，不利于此后純化過程的進(jìn)行，需對樣品液進(jìn)行澄清處理。這一過程可通過離心、過濾、微濾等方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室較多采用離心的方法獲取澄清的液體，也可使用微濾的方法，如使用膜孔大小低于0.45m的濾膜進(jìn)行過濾，但容易出現(xiàn)頻繁的濾膜堵塞的狀況，需多次更換濾膜。大規(guī)模生產(chǎn)中可使用過濾的方法，如板框過濾法。3 分離分離的方法主要有沉淀法、超速離心、超濾、層析。沉淀法在血液制品的生產(chǎn)中應(yīng)用較多，如沿用至今的冷乙醇沉淀法制備血漿蛋白。超速離心法根據(jù)不同大分

3、子物質(zhì)沉降系數(shù)的不同，通過離心將其分離開來，如用于病毒顆粒的分離。超濾法分離效率不高，主要應(yīng)用于樣品的濃縮。層析法在蛋白純化中應(yīng)用最為廣泛，主要包含了離子交換層析、反相層析、疏水相互作用層析、親和層析、體積排阻層析。3.1 層析在以上幾種層析方法中，應(yīng)用較多的為離子交換層析和親和層析。離子交換層析根據(jù)蛋白質(zhì)與介質(zhì)之間靜電吸附的強(qiáng)弱進(jìn)行分離。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用離子交換層析時(shí)，需要根據(jù)純化對象的不同，在離子交換層析介質(zhì)、洗脫液pH值、緩沖溶液類型、洗脫鹽類型這幾方面進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以尋找出最適的條件，預(yù)實(shí)驗(yàn)可用重力柱進(jìn)行。離子交換層析分為陽離子交換層析和陰離子交換層析，兩種類型(lixng)離子交換劑的常用電

4、荷基團(tuán)如下表：陰離子交換劑陽離子交換劑Diethylaminoethyl(DEAE) 二乙氨乙基 -CH2CH2N+(CH2CH3)2Carboxymethyl (CM)羧甲基-CH2COOQuaternary aminoethyl(QAE) 季銨基乙基-CH2CH2N+(C2H5)2CH2CHOHCH3Sulphopropyl (SP)-CH2CH2CH2SO3Quaternary ammonium (Q)季銨鹽-CH2N+ (CH3)3Methylsulphonate (S)-CH2SO3親和層析則是通過生物特異性差異分離樣品的液相層析技術(shù)?？煞蛛x其他層析方法難以分離的樣品。此種方法需根據(jù)

5、純化的物質(zhì)不同選擇不同的配基。在我們的實(shí)驗(yàn)中，選擇了將目的(md)蛋白與組氨酸標(biāo)簽融合表達(dá)，運(yùn)用組氨酸標(biāo)簽與層析柱上金屬離子（Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+）的特異結(jié)合，來分離純化(chn hu)目的蛋白。層析技術(shù)的基本步驟包含平衡、上樣、洗脫，需根據(jù)純化對象的不同，來探索優(yōu)化洗脫方案。線性梯度洗脫雖為標(biāo)準(zhǔn)方法，且精確度高，但階梯洗脫方法往往有更好的效果，實(shí)驗(yàn)中需摸索不同洗脫濃度下的洗脫體積，以確定針對特定蛋白樣品的最佳方案。如果單一一種層析方法的純化效果不佳，可嘗試采用多種層析方法進(jìn)行純化。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)培訓(xùn)中純化的目標(biāo)蛋白為在BL21（DE3）菌株中表達(dá)的帶His標(biāo)簽的可溶融合蛋白，

6、蛋白由IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過超聲破碎法裂解細(xì)菌得到粗蛋白，在通過親和層析、蛋白酶切、離子交換層析技術(shù)獲得純度達(dá)90%以上的目標(biāo)蛋白。實(shí)驗(yàn)(shyn)材料：1.儀器(yq)：高速冷凍離心機(jī)、恒流泵、蛋白(dnbi)核酸檢測儀（見圖1）、電泳儀、pH計(jì)圖12.層析柱：IMAC預(yù)裝柱、Q預(yù)裝柱、SP預(yù)裝柱3.試劑：Tris、NaCl、Imidazole、Ni2SO4、EDTA、NaOH、重組腸激酶Enterokinase實(shí)驗(yàn)方法：誘導(dǎo)表達(dá)加入量為：1ml菌液加入1l 0.5mIPTG，37誘導(dǎo)3h.破菌破菌buffer：20mM Tris 250mM NaCl 10mM Imidazole,pH 8

7、.020:1(ml/g)比例用破菌buffer重懸菌體，10探頭400W超聲4s,停止6s，循環(huán)99次。中間暫停一次攪拌均勻。破菌液12000rpm離心20min。親和層析：Column：IMAN預(yù)裝柱（規(guī)格1ml）Buffer A：20mM Tris 250mM NaCl 10mM Imidazole,pH 8.0Buffer B：20mM Tris 250mM NaCl 500mM Imidazole,pH 8.0Flow rate: 1.5ml/min清洗柱子：100mM EDTAddH2O0.2M NaOHddH2O，每種清洗液至少10個(gè)柱體積，最后一步?jīng)_ddH2O至流出液pH約為中性

8、。掛Ni：沖100mM Ni2SO4至流出液出現(xiàn)綠色，用至少10個(gè)柱體積ddH2O洗柱，去掉多余未螯合的Ni2+。平衡柱子：Buffer A平衡至少10個(gè)柱體積，歸零蛋白核酸檢測儀讀數(shù)。上樣：樣品留取40l，其余上柱。洗脫(x tu)液配制：用Buffer B配制梯度洗脫液，每個(gè)梯度至少10ml，梯度為50mM Imidazole、100 mM Imidazole、250 mM Imidazole。收集(shuj)洗脫液方法：待蛋白純化儀出峰時(shí)（即讀數(shù)開始上升）開始收樣至峰下降至穩(wěn)定數(shù)值時(shí)停止收樣。酶切：Digestion buffer：20mM Tris 50mM NaCl，pH 7.5樣品

9、(yngpn)稀釋：取200l 250mM Imidazole洗脫液，加入800l Digestion buffer混勻。酶切：3個(gè)EP管A、B、C，依次加入100l、100l、200l上述混合液，C內(nèi)加入8l EK酶，混勻取100l加入B混勻取100l加入A。室溫酶切1h。離子交換層析：陰離子交換：Column：Q預(yù)裝柱（規(guī)格1ml，His標(biāo)簽結(jié)合柱上，目標(biāo)蛋白穿透，此柱可去除樣品中內(nèi)毒素）Buffer A：20mM Tris pH 1.5單位PI值Buffer B：20mM Tris 1M NaCl pH 1.5單位PI值步驟：10ml Buffer A平衡柱子EK酶切樣品上樣，收集流穿樣

10、品10ml Buffer A平衡柱子100/300/500mM/1M NaCl 和0.2M NaOH洗脫，收集洗脫液各取40l電泳陽離子交換：Column：SP預(yù)裝柱（規(guī)格1ml，目標(biāo)蛋白結(jié)合柱上，此柱可去除樣品(yngpn)中內(nèi)毒素并對樣品進(jìn)行濃縮）Buffer A：20mM Tris pH 1.5單位(dnwi)PI值Buffer B：20mM Tris 1M NaCl pH 1.5單位(dnwi)PI值步驟：10ml Buffer A平衡柱子QFT上樣，收集流穿樣品10ml Buffer A平衡柱子100/300/500mM/1M NaCl 和0.2M NaOH洗脫，收集洗脫液各取40l

11、電泳透析、超濾、濃縮至保存體系透析袋處理及透析裁剪合適大小的透析袋。大體積2% NaHCO3和1mM/L EDTA（pH 8.0）中將透析袋煮沸10min。去離子水徹底清洗透析袋。1mM/L EDTA（pH 8.0）煮沸10min。冷卻后存于4，透析袋始終浸沒于液體中，此后均需帶手套操作。透析袋驗(yàn)漏后，將待透析液體加入透析袋內(nèi)，置于透析液中4透析過夜。超濾濃縮去離子水潤洗濾膜，透析液潤洗濾膜，加入樣品，4低溫4000rpm （速度過大易破壞濾膜）2min預(yù)超濾，根據(jù)樣品超濾速率，調(diào)整此后超濾時(shí)間，切勿使濾膜干掉。超濾完后，吹打勻樣品后再繼續(xù)超濾。附 1：超濾管處理(chl)方法新管：去離子水、透析buffer潤洗舊管：0.1M NaOH 浸泡30min，用槍吹打(chud)，離心。去離子水潤洗，20%乙醇(y chn)洗。保存：20%乙醇浸泡附 2：測蛋白Lowry法BCA法Bradford法A280/A260法附 3：EDTA配制800ml 水溶，加200ml 10M NaOH 附 4：Ni柱脫Ni0.1 M EDTA 洗至無色水洗至pH中性0.2M NaOH 至核酸蛋白純化儀指數(shù)穩(wěn)定水洗至pH中性20%乙醇洗并保存。內(nèi)容總結(jié)（1）蛋白純化培訓(xùn)總結(jié)