植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)分析

1、植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)一植物病原細(xì)菌常用培養(yǎng)基 的制作與滅菌1.了解細(xì)菌培養(yǎng)基的種類； 2.掌握常用細(xì)菌培養(yǎng)基的配方和制作方法；。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和操作方法 （1）配方：牛肉膏3，蛋白胨 10，NaCl 5，瓊脂 20，蒸餾水 1000 L。(NA)：分離和培養(yǎng)最常用（2）配制過程：將牛肉膏、蛋白胨、 NaCl 溶于蒸餾水后，調(diào)節(jié)，加入瓊脂溶化后分裝于三角瓶和試管。（一）培養(yǎng)基的配制2. Hugh和Leifson（HL）培養(yǎng)基：細(xì)菌的好氧性和厭氧性測(cè)定蛋白胨 2.0 g 氯化鈉 5.0 g 磷酸氫二鉀 0.2 g 瓊脂 3.0 g 蒸餾水 1000.0 ml 溴百里酚蘭（酒精溶液

2、 1.5 ml）待培養(yǎng)基融化，并調(diào)pH后，裝于試管中，每支試管裝9 ml 滅菌。培養(yǎng)基凝固后，用接種針蘸細(xì)菌懸浮液針刺接種，一直刺到管底。分別在培養(yǎng)2、4和7 d后觀察記錄。 好氧性細(xì)菌，只在開管的上部生長(zhǎng)；兼性厭氧性細(xì)菌，則在開管的上下部都能生長(zhǎng)；厭氧性細(xì)菌，則只能在開管的下部和閉管中生長(zhǎng)。（1）配方：NH4H2PO4，氯化鉀0.2，MgSO4.7H2，蒸餾水1000 L，溴百里酚蘭（1.6%酒精溶液）1.5 mL; 1%碳素化合物。培養(yǎng)基：碳素化合物產(chǎn)酸試驗(yàn) 單糖（葡萄糖、半乳糖）；雙糖（麥芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。 有的細(xì)菌不產(chǎn)酸和氣，有的只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，少數(shù)植物病原細(xì)菌既

3、產(chǎn)酸又產(chǎn)氣（3）分裝：將上述培養(yǎng)基分裝于試管中，每管10 mL左右。如果測(cè)定氣體產(chǎn)生，加上杜氏發(fā)酵小玻管后滅菌。產(chǎn)酸時(shí)培養(yǎng)液變黃，產(chǎn)堿時(shí)變藍(lán)，產(chǎn)氣則小玻管內(nèi)培養(yǎng)液被部分排出，出現(xiàn)空隙。（2）配制過程：將NH4H2PO4、氯化鉀、MgSO4.7H2O溶于蒸餾水，調(diào)節(jié)后加入溴百里酚蘭，最后加入碳素化合物（也可分別滅菌后加入）4. MR和VP試驗(yàn)：對(duì)葡萄糖的分解能力（1）配方：蛋白胨5，葡萄糖5，磷酸氫二鉀5，蒸餾水 1000 L。（2）配制過程：將蛋白胨、葡萄糖、磷酸氫二鉀溶于蒸餾水，調(diào)節(jié) ，每管分裝5mL即可。5. 硝酸鹽還原（1）配方：硝酸鉀1.0，蛋白胨5.0，酵母膏3.0，蒸餾水1000L

4、， （2）配制過程：將硝酸鉀、蛋白胨、酵母膏稱好后，溶解于蒸餾水后，調(diào)節(jié) pH。6. 半胱氨酸培養(yǎng)液：測(cè)定產(chǎn)H2S能力（1）配方：蛋白胨10，硫酸鈉0.1g，g，蒸餾水1000L。（2）配制過程：將半胱氨酸、蛋白胨、硫酸鈉稱好后，溶解于水中，調(diào)節(jié) 即可。7. 吲哚試驗(yàn)（1）配方： 蛋白胨，磷酸氫二鈉，葡萄糖，蒸餾水1000L。（2）配制過程：將蛋白胨等稱好后，溶解于蒸餾水，調(diào)節(jié)即可。8. 明膠液化g，蛋白胨5.0，明膠10-12%，蒸餾水1000L。（2）配制過程：將牛肉浸膏、蛋白胨溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)后，將明膠溶解于此溶液中，即可分裝于試管中。 9. 淀粉水解試驗(yàn)（1）配方： 牛肉浸膏3.0

5、 g，蛋白胨，淀粉1.5 g，瓊脂15-20 g，蒸餾水1000 L。（2）配制過程：將牛肉浸膏、蛋白胨、淀粉稱好后，溶解于蒸餾水中，加入稱好的瓊脂，待融化后調(diào)節(jié)。10. 石蕊牛乳反應(yīng) （1）配方： 脫脂牛乳1000 L ， 石蕊液（4%）15-20 mL。（2）配制過程：提前配制石蕊液（二）培養(yǎng)基的滅菌 上述培養(yǎng)基應(yīng)按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌。普通培養(yǎng)基為1212030min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長(zhǎng)度一般以不超過試管長(zhǎng)度的1/2為宜；半固體培養(yǎng)基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。明膠培養(yǎng)基滅菌1

6、2-15分鐘。石蕊牛乳培養(yǎng)基間歇滅菌3次，每次通蒸汽20-30 分鐘。滅菌方法 滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類。本實(shí)驗(yàn)主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。 加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過加熱使菌體內(nèi)蛋白質(zhì)凝固變性，從而達(dá)到殺菌目的。高壓蒸汽滅菌法 高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是基于水的沸點(diǎn)隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設(shè)計(jì)的。當(dāng)蒸汽壓力達(dá)到2時(shí)，水蒸氣的溫度升高到121，經(jīng)2030min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標(biāo)本和工作服等都可應(yīng)用此法滅菌。 操作方法和注意事項(xiàng)如下: 加水 打開滅菌

7、鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。 裝料、加蓋 滅菌材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，采用對(duì)角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。 排氣 打開放氣閥。用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當(dāng)有大量蒸汽排出時(shí)，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣完全排凈。 升壓、保壓和降壓 當(dāng)鍋內(nèi)冷空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開始上升。當(dāng)壓力上升至所需壓力時(shí)，控制電壓以維持恒溫，并開始計(jì)算滅菌時(shí)間，待時(shí)間達(dá)到要求（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121，20min）后，停止加熱，待壓力降至接近“0”時(shí)，打開放氣閥。 注意不能過早過急地排氣，否則會(huì)由于瓶?jī)?nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而

8、造成瓶?jī)?nèi)液體沖出容器之外。 干熱滅菌法 通過使用干熱空氣殺滅微生物的方法叫干熱滅菌。一般是把待滅菌的物品包裝就緒后，放入電烘箱中烘烤，即加熱至160170維持12h。 干熱滅菌法常用于空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養(yǎng)基等都不能用此法滅菌。 1 細(xì)菌（NA）和真菌(PDA)常用培養(yǎng)基的配方和制 作過程有何異同點(diǎn)？2 試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和注意事項(xiàng)。三、作業(yè)實(shí)驗(yàn)二 植物病原細(xì)菌的分離 和致病性測(cè)定二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和操作方法 （1）首先要選擇典型、新鮮病組織;（2）以滅菌剪將病斑剪下，略帶健康組織，大小約1公分左右，放在滅菌載玻片中央，加無菌水1d。加上滅菌蓋玻片，靜置

9、約10min左右，觀察是否有云霧狀自破口處涌出（一）細(xì)菌溢現(xiàn)象觀察 （1）斑點(diǎn)型：如棉花角斑病。A. 剪取新鮮的典型病斑，約1cm見方。（二）植物病原細(xì)菌的分離1. 細(xì)菌懸浮液的配制（不同癥狀類型分離材料的選擇和表面消毒）B.表面消毒：將切取的組織塊在70乙醇中浸一下立即取出，然后用表面消毒劑進(jìn)行表面消毒，可以采用升汞，152min或的次亞氯酸鹽如漂白粉（1：9稀釋液）2minC.消毒后用滅菌水洗滌3次，將病組織放在另一個(gè)培養(yǎng)皿的滅菌水中，剪破中心或以滅菌玻璃棒研碎病組織靜置2030分鐘，等細(xì)菌游出。（2）萎蔫型如茄青枯病將莖部剪成12寸長(zhǎng)，表面用70酒精輕拭，在火焰上表面消毒，以滅菌刀縱剖，

10、選擇輕微變色病部，以滅菌刀切出薄片或以解剖針挑出病健交界處組織（可以不再消毒），加滅菌水浸泡20-30分鐘。如果莖部較粗，也可以在表面消毒后用解剖刀橫斷莖部，用夾子或手緊壓莖部橫斷面，擠出溢膿或汁液。（3）腫瘤組織 軟瘤比較容易分離；木質(zhì)瘤可以磨碎后接種在向日葵、番茄等幼株上長(zhǎng)出瘤后再分離。由于細(xì)菌位于表皮細(xì)胞和木質(zhì)部之間，因此應(yīng)用酒精棉花擦拭表面，在火焰上表面消毒，再在滅菌皿中實(shí)行解剖后以滅菌玻棒將其搗碎，靜置浸泡24h。 （4）腐爛組織較簡(jiǎn)單，選擇近病部交界處以接種環(huán)挑取少量腐爛組織，稀釋。（5）種子帶菌的分離選擇病種子，以0.1升汞液表面消毒12min，滅菌水洗滌，再將此種子在70酒精中

11、浸幾分鐘，洗滌23次，取出放在研缽中磨碎，離心取上清液。 2. 分離方法A.倒平板：注意培養(yǎng)基的溫度不能太高，否則冷凝水太多，細(xì)菌在水中游動(dòng)而影響單個(gè)分散菌落的形成。 （1）平板劃線分離法：被普遍采用B.用接種環(huán)蘸取上述配制好的菌懸液，在已凝固的平板培養(yǎng)基表面劃線 如果菌液濃度大，培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動(dòng)角度減小，增加劃線的次數(shù)劃4條線后，將接種環(huán)滅菌，培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動(dòng)90，從第2條線開始劃45條線（2）培養(yǎng)皿稀釋分離法0原液1取1環(huán)菌液0.5L滅菌水2混勻后取1環(huán)3混勻后取1環(huán)4混勻后取1環(huán)5混勻后取1環(huán)3.培養(yǎng)一般放置在 2830溫箱中倒置培養(yǎng)，時(shí)間23 d。將冷卻至45左右的培養(yǎng)基倒入裝有稀釋菌液的培養(yǎng)皿中

12、，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液和培養(yǎng)基混勻，待其凝固后培養(yǎng)。4.細(xì)菌的純化 挑取分離出的典型單菌落平板劃線培養(yǎng)（2皿），如此重復(fù)12次，最后，在均勻一致的平板中，挑取典型菌落移植在斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)，長(zhǎng)成后在4環(huán)境中保存菌種。1. 配制107-108CFU/mL的細(xì)菌懸浮液，菌齡48小時(shí)左右；（二）致病性測(cè)定 2. 指示植物的選擇：一般用煙草，在假單胞和黃單胞菌屬上較適用。3. 接種方法：用注射器將細(xì)菌液從煙草下表皮注入葉肉細(xì)胞間。用滅菌水作陰性對(duì)照，同屬HR陽(yáng)性的菌株作陽(yáng)性對(duì)照。4. 培養(yǎng)條件：接種后的植物應(yīng)保持在25，相對(duì)濕度較高（85%）的條件下。5. 結(jié)果觀察：在2448h表現(xiàn)枯斑為陽(yáng)性反應(yīng)，

13、3d左右出現(xiàn)黃斑為陰性反應(yīng)。三 作業(yè)：1.簡(jiǎn)述本實(shí)驗(yàn)中植物病原細(xì)菌的分離步驟及其操作注意事項(xiàng)2. 煙草過敏性反應(yīng)試驗(yàn)?zāi)軌虼_定細(xì)菌的致病性嗎？為什么？實(shí)驗(yàn)三植物病原細(xì)菌的形態(tài)觀察1.了解革蘭氏染色鑒定的快速鑒定方法；2.掌握革蘭氏染色和鞭毛染色的方法；3.掌握細(xì)菌培養(yǎng)性狀的描述特征。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和操作方法 （一）革蘭氏染色 （1）試劑A. 結(jié)晶紫草酸銨染劑：溶液：g，酒精（95%）20mL 混合溶液和，過濾，貯藏于試劑瓶中，24h后使用。溶液：g，蒸餾水80mLC.復(fù)染劑原液：番紅O 2.5g，95%酒精100mL復(fù)染劑：原液10mL，蒸餾水90mLB. g，碘化鉀2g蒸餾水30

14、0mL。 將碘和碘化鉀在研缽中研和，慢慢加水并繼續(xù)研和直至碘和碘化鉀溶解，然后加水稀釋到300mL，盛入棕色試劑瓶，放暗處備用。（2）染色程序A. 配制細(xì)菌懸浮液：菌齡16hB. 在干凈的載玻片上涂片、風(fēng)干，不要加熱，然后在火焰上通過2次，固定玻片。C. 結(jié)晶紫染色1分鐘，水洗數(shù)秒鐘，吸干。D. 碘液處理1分鐘，水洗，吸干。E. 用95%酒精褪色約30秒。水洗，吸干F. 番紅O復(fù)染10秒，水洗，吸干G. 加1滴香柏油，在油鏡下鏡檢，紅色為革蘭氏陰性菌，紫色為革蘭氏陽(yáng)性菌。2.氫氧化鉀溶解試驗(yàn)（1）試劑：3氫氧化鉀（2）方法：取12滴3氫氧化鉀溶液置于干凈的玻片上，用牙簽取新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物與氫氧化

15、鉀混合，充分?jǐn)嚢?020秒，如果液滴變粘稠并可拉出絲狀物體，表示測(cè)試菌為革蘭氏陰性菌，反之則為革蘭氏陽(yáng)性菌。（二）鞭毛染色（西薩基爾法） （1）媒染劑：?jiǎn)螌幩?0g，ALCL3.6H2O 18g，ZnCL2 10g，g，60%酒精40mL 在研缽中加入酒精和上述各種成分，充分研磨后，再加入其余的酒精。使用前用蒸餾水稀釋2倍，染色時(shí)過濾，濾液直接滴在涂片上。溶液：g，酒精（95%）10mL 溶液和分別配制后混合。溶液：苯酚（結(jié)晶）5g，蒸餾水95mL（2）染液：2. 染色步驟（1）載玻片準(zhǔn)備：選用新的或沒有傷痕的，先用洗潔精浸泡洗滌，用清水洗凈后，再放入酸酒精（硫酸與酒精等量混合）中浸泡24-4

16、8h，取出后用清水洗凈，再用蒸餾水洗，瀝干水后，浸泡在95%酒精中備用。（2）配制細(xì)菌懸浮液，菌齡很重要，一般適溫培養(yǎng)16-24h。用吸管沿試管壁緩緩加入無菌水5mL，靜置30分鐘左右，配成菌懸液。（3）涂片：取浸在酒精中的載玻片，在火焰上燒去酒精，平放，用吸管吸取細(xì)菌懸浮液（以上層為好）在載玻片的一端滴一滴，然后將載玻片稍稍傾斜，使菌懸液從一端緩緩流向另一端，使涂片自然風(fēng)干。（4）媒染劑過濾后，直接將濾液滴在涂片上，處理5-7分鐘（5）用水輕輕洗去染媒劑，甩去載玻片上剩余的水，在空氣中干燥后，再加苯酚品紅染劑染色5分鐘。（6）水洗，在空氣中干燥后，加1滴香柏油，在油鏡下觀察鞭毛的數(shù)量和著生位

17、置。1.革蘭氏染色反應(yīng)和鞭毛染色在植物病原細(xì)菌鑒定中有何作用？為什么？2.細(xì)菌鞭毛染色對(duì)菌齡的要求比較嚴(yán)格，在操作過程中也要注意動(dòng)作的輕柔，為什么？3 觀察和記錄NA平板上的細(xì)菌菌落性狀、菌體形狀、運(yùn)動(dòng)性和革蘭氏染色結(jié)果。三 作業(yè)實(shí)驗(yàn)四 植物病原細(xì)菌生理生化測(cè)定1. 掌握無菌操作技術(shù)；2. 了解各種生理生化性狀測(cè)定常用試劑的配制方法；3. 掌握各種生理生化性狀的觀察方法。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法 1.產(chǎn)酸和產(chǎn)氣試驗(yàn)（一）碳素化合物的利用1）接菌培養(yǎng)：一般每5 mL培養(yǎng)液接種0.1mL 108 CFU/ml菌懸液，適溫下培養(yǎng)3-4周。2）結(jié)果觀察：產(chǎn)酸：培養(yǎng)液變?yōu)辄S色產(chǎn)堿：培養(yǎng)液變?yōu)樗{(lán)

18、色CK：培養(yǎng)液為草綠色變色產(chǎn)氣：杜氏發(fā)酵小玻管出現(xiàn)空隙CK：杜氏發(fā)酵小玻管不出現(xiàn)空隙產(chǎn)氣（1）配方：NH4H2PO4，氯化鉀0.2，MgSO4.7H2，蒸餾水1000 L，溴百里酚蘭（1.6%酒精溶液）1.5 mL; 1%碳素化合物。Ayers培養(yǎng)基：碳素化合物產(chǎn)酸試驗(yàn) 單糖（葡萄糖、半乳糖）；雙糖（麥芽糖、乳糖）；多糖（淀粉）；醇（甘露醇）。 有的細(xì)菌不產(chǎn)酸和氣，有的只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，少數(shù)植物病原細(xì)菌既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣（3）分裝：將上述培養(yǎng)基分裝于試管中，每管10 mL左右。測(cè)定氣體產(chǎn)生時(shí)，加上杜氏發(fā)酵小玻管后滅菌。（2）配制過程：將NH4H2PO4、氯化鉀、MgSO4.7H2O溶于蒸餾水，調(diào)節(jié)后加入

19、溴百里酚蘭，最后加入碳素化合物（也可分別滅菌后加入） 3）MR試驗(yàn)結(jié)果觀察：取上述培養(yǎng)液5ml，加甲基紅試劑23滴，呈明顯紅色為陽(yáng)性，呈黃色為陰性。2.甲基紅(MR)和VP(產(chǎn)3-羥基丁酮)試驗(yàn)1）接菌培養(yǎng)：一般每5mL培養(yǎng)液接種8CFU菌懸液，適溫下培養(yǎng)1周。2）甲基紅試劑配制：甲基紅溶解于300ml的95%酒精中，然后用蒸餾水稀釋至500ml。 4）VP試驗(yàn)結(jié)果觀察：每毫升加0.1mL40%KOH溶液, 置48-50水浴處理2h，充分搖動(dòng)后觀察結(jié)果。在4h內(nèi)出現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性反應(yīng)。 測(cè)定亞硝酸，每試管加試劑A和試劑B各1ml如呈紅色，表示有亞硝酸根。1）接菌：在培養(yǎng)液中接菌后培養(yǎng)1周（二）氮

20、素化合物的分解2）Griess-Llosvary試劑測(cè)定法 試劑A：對(duì)氨基苯磺酸，5mol/L醋酸（冰醋酸加水）1000ml 試劑B：二甲基-萘胺6ml，5mol/L醋酸1000ml1.硝酸鹽還原1）醋酸鉛濾紙條的制備：將濾紙剪成5mm50mm的小條浸在5%醋酸鉛溶液中，空氣中干燥后，在120烘箱中滅菌1h。2）接菌：將細(xì)菌接種于試管中的培養(yǎng)液中后，用上述制備的濾紙條夾在棉花塞和試管壁之間，使紙條懸在培養(yǎng)液面上，但不要碰到培養(yǎng)液，25培養(yǎng)2周。3）結(jié)果觀察：紙條變黑表示有硫化氫產(chǎn)生，為陽(yáng)性反應(yīng)。2.硫化氫產(chǎn)生1）草酸濾紙條的制備：將濾紙剪成5mm50mm的小條浸在飽和草酸溶液中，空氣中干燥后，

21、在120烘箱中滅菌1h。2）接菌：將細(xì)菌接種于試管中的培養(yǎng)液中后，用上述制備的濾紙條夾在棉花塞和試管壁之間，使紙條懸在培養(yǎng)液面上，但不要碰到培養(yǎng)液，適溫培養(yǎng)1周。3）結(jié)果觀察：紙條變淡紅色表示有吲哚產(chǎn)生，為陽(yáng)性反應(yīng)。3.吲哚產(chǎn)生1）接菌：采用穿刺法接菌后，放在適溫中培養(yǎng)1-3周。以不接菌試管為對(duì)照。（三）大分子化合物的利用2）結(jié)果觀察：將經(jīng)過培養(yǎng)的接菌試管取出后，放在4冰箱中，看其是否凝固，如不凝固，則說明明膠分解而導(dǎo)致液化，為陽(yáng)性反應(yīng)。1.明膠液化A.酸的產(chǎn)生：石蕊牛乳變成粉紅色，表示從乳糖產(chǎn)酸1）接菌：將培養(yǎng)基接種細(xì)菌于28培養(yǎng)1-3周，以不接種的石蕊牛乳做對(duì)照。2）結(jié)果觀察：2.石蕊牛乳

22、反應(yīng)B.凝固：產(chǎn)酸達(dá)到發(fā)生凝塊，如產(chǎn)氣凝塊斷裂； 凝乳酶的作用而凝固，凝塊收縮與乳清分離。C.胨化：牛乳變清，往往從表層開始D.堿的產(chǎn)生：石蕊牛乳變藍(lán)色，胨化時(shí)常呈堿性E.石蕊還原：石蕊變?yōu)闊o色 在平板上加碘液后，培養(yǎng)基為深蘭色，菌落周圍有無色透明圈者為陽(yáng)性。1）接菌：將細(xì)菌接種于淀粉瓊脂平板上，適溫下培養(yǎng)24-48小時(shí)。2）結(jié)果觀察：3. 淀粉水解試驗(yàn)四、細(xì)菌的好氧性和厭氧性測(cè)定蛋白胨 2.0 g 氯化鈉 5.0 g 磷酸氫二鉀 0.2 g 瓊脂 3.0 g 蒸餾水 1000.0 ml 溴百里酚蘭（酒精溶液 1.5 ml）待培養(yǎng)基融化，并調(diào)pH后，裝于試管中，每支試管裝9 ml 滅菌。培養(yǎng)基

23、凝固后，用接種針蘸細(xì)菌懸浮液針刺接種，一直刺到管底。分別在培養(yǎng)2、4和7 d后觀察記錄。 好氧性細(xì)菌，只在開管的上部生長(zhǎng)；兼性厭氧性細(xì)菌，則在開管的上下部都能生長(zhǎng)；厭氧性細(xì)菌，則只能在開管的下部和閉管中生長(zhǎng)。1）試劑：1%二甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽或1%四甲基對(duì)苯二胺鹽酸鹽。（五）其他生理生化試驗(yàn)2）測(cè)定方法：1.氧化酶試驗(yàn)A. Kovacs：在培養(yǎng)皿內(nèi)放一張濾紙，濾紙上加3-4滴試劑使其濕潤(rùn)，用牙簽挑取24h菌苔涂在濾紙上，60秒內(nèi)變成紫色為陽(yáng)性反應(yīng)，60秒后或不便色為陰性。B.濾紙條法：用濾紙條蘸少許菌苔，加1d試劑，立即呈粉紅色為陽(yáng)性1）試劑：3%過氧化氫2）測(cè)定方法：挑取固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24

24、-48h的菌苔，置于干凈玻片上，滴加過氧化氫。2.過氧化氫酶（接觸酶）試驗(yàn)3）結(jié)果觀察：在半分鐘內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生的為陽(yáng)性，不產(chǎn)生氣泡的為陰性。三 作業(yè)：1 若有吲哚和硫化氫產(chǎn)生，其實(shí)驗(yàn)的試管口上的濾紙條會(huì)發(fā)生什么樣的顏色變化，為什么？2 在石蕊牛乳不能和其他細(xì)菌培養(yǎng)基一起滅菌，為什么？反應(yīng)中會(huì)出現(xiàn)多種不同的反應(yīng)，試分析其發(fā)生的原因？ 3 觀察和記錄細(xì)菌氧化發(fā)酵試驗(yàn)、MR試驗(yàn)以及接觸酶試驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)五 植物病原細(xì)菌的PCR分子鑒定 1 了解PCR反應(yīng)的原理；掌握PCR反應(yīng)的操作方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?二、PCR擴(kuò)增 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，簡(jiǎn)稱PCR）1、

25、PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與目標(biāo)序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)反應(yīng)步驟構(gòu)成：模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈（以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備）；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循

26、環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需24分鐘， 23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。2 The procedure of PCR5533d.NTPsTaqPrimers5353535353535353componentdenaturation535353535353(94) extension53535353353TaqTaq55repeatedanneal(72) (50) 53535353553353532 cycles4 copies3 cycles8 copies535353535353535353535

27、3355353535310反應(yīng)緩沖液（含Mg2）5.0 ldNTP混合物，10 mmol/L1.0 l上游引物，20 mol/L1.0 l下游引物，20 mol/L1.0 l模板DNA1.0 lTaq plus DNA聚合酶，5 U/l0.5 l加雙蒸水至終體積為50 l 3 反應(yīng)體系 取一0.5 ml PCR薄壁管，依次加入以下試劑： M 1 2 3 43kb2kb0.8% agrose gel electrophoresis of full length PCR product from Y160M: DNA marker; 1: Y160; 2:positive control; 3 4

28、: CK-引物量： 每條引物的濃度1umol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。酶及其濃度：目前有兩種Taq DNA聚合酶供應(yīng)， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U(指總反應(yīng)體積為100ul時(shí))，濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。4 PCR反應(yīng)操作注意事項(xiàng)：dNTP的質(zhì)量與濃度 dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當(dāng)易變性失去生物學(xué)活性。dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃

29、度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調(diào)節(jié)到，小量分裝， -20冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解。在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)(偏高或偏低)，就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低。模板(靶基因)核酸模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。Mg2+濃度Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響，在一般的PCR反應(yīng)中，各種dNTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為為宜。Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少。PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件為溫度、時(shí)間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時(shí)間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)。變性溫度與時(shí)間： 變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，9394lmin足以使模板DNA變性，若低于93則需延長(zhǎng)時(shí)間，但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗。退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：重要因素。變性后溫度快速冷卻至4060，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合