熒光定量PCR在肺結(jié)核臨床診斷與療效評估中地應(yīng)用

1、熒光定量PCR在肺結(jié)核臨床診斷及療效評估中的應(yīng)用建立熒光定量PCR檢測結(jié)核分枝桿菌方法，評估其在肺結(jié)核的臨床診斷和療效評估中的應(yīng)用價(jià)值。方法針對結(jié)核分枝桿菌保守序列IS6110基因設(shè)計(jì)引物和探針，建立熒光定量PCR方法。分別以熒光定量PCR、集菌培養(yǎng)和染色鏡檢法檢測疑似肺結(jié)核和確診肺結(jié)核患者隨訪的痰標(biāo)本，比較各方法在結(jié)核病診斷以及治療效果評估中的作用。結(jié)果熒光定量PCR的檢測靈敏度為4Copies/反應(yīng)，遠(yuǎn)高于抗酸染色法和集菌培養(yǎng)法。熒光定量PCR法與集菌培養(yǎng)法和抗酸染色法對臨床樣本的檢出率分別為64.29、35.12和12.5?；颊咧委熜Ч碾S訪檢測結(jié)果顯示，結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量呈持續(xù)減少的趨

2、勢。結(jié)論熒光定量PCR方法具有快速、敏感和特異性高的特點(diǎn)，可以快速、及時(shí)獲取肺結(jié)核患者服藥后的治療效果，為醫(yī)生的后續(xù)督導(dǎo)治療提供依據(jù)，具有重要的臨床意義。結(jié)核病是全球性的重大公共衛(wèi)生問題之一。全球現(xiàn)有肺結(jié)核病人2000多萬，其中95在發(fā)展中國家1，我國是22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，活動(dòng)性肺結(jié)核患者居世界第2位，每年因結(jié)核病死亡的人數(shù)達(dá)到15萬人，給國家和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響我國經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展2。結(jié)核分枝桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測是結(jié)核病診斷和治療轉(zhuǎn)歸確認(rèn)的重要依據(jù)。提高實(shí)驗(yàn)室檢測能力，促進(jìn)早診斷、早治療是有效控制結(jié)核病蔓延的必要措施。目前臨床以集菌培養(yǎng)和染色鏡檢法為主要的實(shí)驗(yàn)室檢測手段。大量研究

3、表明，傳統(tǒng)方法的檢出率低、培養(yǎng)周期長，已難以滿足臨床需要3，4。熒光定量PCR是近年發(fā)展起來的一種重要的基因診斷技術(shù)，具有靈敏度高、特異性好、可定量、污染少、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。該研究建立了熒光定量PCR檢測臨床結(jié)核分枝桿菌的方法，并對熒光定量PCR在臨床肺結(jié)核診斷和療效評估中的應(yīng)用進(jìn)行了評價(jià)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。材料與方法1.1標(biāo)本1.1.1疑似肺結(jié)核病患者采集2009-2010年5月某傳染病院診斷的疑似肺結(jié)核患者痰液標(biāo)168份，其中男性115份，女性53份，年齡1560歲。疑似肺結(jié)核病患者的確認(rèn)依據(jù)結(jié)核病診斷指南，患者出現(xiàn)咳嗽、咳痰3周或以上，可伴有咯血、胸痛、呼吸困難，或者發(fā)熱，盜汗、乏力、

4、食欲降低、體重減輕、月經(jīng)失調(diào)等癥狀，臨床需進(jìn)一步做痰和胸部線檢查的患者51.1.2確診患者選擇臨床確診肺結(jié)核病患者。為確保樣本采集的連貫性，在爭取患者同意隨訪的同時(shí)，選擇暫時(shí)在家休養(yǎng)的就近患者，共選取5例活動(dòng)性肺結(jié)核患者。樣本采集患者漱口后痰液，在服藥前1d即開始留樣，服藥后，在隨訪中17d內(nèi)每天采集1次，后續(xù)間隔25d采集1次。1.2儀器Bact/Alert3D全自動(dòng)細(xì)菌快速培養(yǎng)和藥敏檢測系統(tǒng)、Heraeus低溫冷凍離心機(jī)Megafuge1.0R、Biospec-miniDNA/RNA/Proteinanalyzer（島津）、7500熒光定量PCR擴(kuò)增儀（AppliedBiosystems）

5、、凝膠成像系統(tǒng)（英國UVItec）。1.3抗酸染色法與集菌培養(yǎng)法操作參考結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程5進(jìn)行。1.4痰液DNA的提取取0.5ml痰標(biāo)本加入2倍樣本體積4的NaOH，液化10min后15000r/min離心5min，去上清液；向沉淀中加入0.5ml滅菌水，充分振蕩混勻，15000r/min離心2min，去上清，重復(fù)洗滌3次；沉淀中加入50lDNA提取液（1NP-40+2TritonX-100），充分振蕩混勻，100水浴10min；待冷卻至室溫，15000r/min離心5min，取上清液備用。1.5熒光定量PCR方法1.5.1引物與探針設(shè)計(jì)針對IS6110基因設(shè)計(jì)引物與探針，上游引物：5

6、-GTCGCCCGTCTACTTAATG-3，下游引物：5-GCGGATTCTTCGGTCGTG-3，產(chǎn)物長度為107bp。探針：5FAM-CCGACGGTGCGTAAGTGGGTGCGTCGG-DABCYL3，由XX基康生物技術(shù)XX合成。1.5.2反應(yīng)條件反應(yīng)體系（40l）：4.0l10buffer，7.0mmol/LMg2+，200mol/LdNTP，0.2mol/L上下游引物，0.2mol/L探針，4LDNA模板，2.5UTaqDNA聚合酶。擴(kuò)增條件：943min；9420s，5220s，7220s，40次循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)定陽性對照、弱陽性對照與空白對照（notemplatecontrol,

7、NTC）。按照熒光定量PCR分析軟件設(shè)定基線（baseline）與閾值（threshold），以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.5.3標(biāo)準(zhǔn)品制備以結(jié)核分枝桿菌H37Ra為參考菌株，PCR擴(kuò)增IS6110基因并克隆到質(zhì)粒載體。提取純化重組DNA，10倍梯度稀釋至107Copies/mL作為強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品，103Copies/mL作為弱陽性標(biāo)準(zhǔn)品。1.5.4特異性以結(jié)核分枝桿菌H37Ra為陽性標(biāo)本，提取牛型分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、蟾分枝桿菌、草分枝桿菌、龜分枝桿菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、腦膜炎奈瑟氏菌為模板檢測引物與探針的特異性。1.5.5靈敏度與標(biāo)準(zhǔn)

8、曲線繪制抽提標(biāo)準(zhǔn)品DNA，10倍系列準(zhǔn)確定量稀釋102107Copies/mL的DNA模板，分別取4L進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，。1.5.6結(jié)果判定熒光定量PCR擴(kuò)增曲線規(guī)則，呈對數(shù)增長，Ct值36即可判定為陽性；如擴(kuò)增曲線不規(guī)則或Ct值40，報(bào)告為陰性；如Ct值在3640之間，且擴(kuò)增曲線呈對數(shù)增長，樣本重復(fù)測定，如Ct值仍在3640之間報(bào)告為陰性。結(jié)果2.1熒光定量PCR法的特異性結(jié)核分枝桿菌H37Ra出現(xiàn)特異擴(kuò)增，凝膠電泳出現(xiàn)107bp條帶。對該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行測序，序列分析顯示為結(jié)核分枝桿菌核酸序列，其他非結(jié)核分枝桿菌擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。2.2熒光定量PCR法的靈敏度與線性以10倍梯度稀釋配制

9、原始拷貝數(shù)102107Copies/mL的標(biāo)準(zhǔn)品系列，取4L進(jìn)行分子信標(biāo)熒光定量PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Ct=-3.61344logC0+45.78456，線性X圍為4102107Copies/mL，r=0.99503，Ct值與DNA模板含量呈線性關(guān)系。經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最低可檢測4Copies/反應(yīng)，見圖1。圖1熒光定量PCR法檢測結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)曲線2.3肺結(jié)核的診斷采集168份疑似結(jié)核病患者痰標(biāo)本，集菌培養(yǎng)法和涂片染色法陽性檢出率分別為35.12（59/168）、12.5（21/168），熒光定量PCR法陽性檢出率64.29（108/168）。對抗酸染色法和培養(yǎng)法陽性的樣本，熒光

10、定量PCR法的靈敏度分別為100和95.4。對20份正常人群來源的痰標(biāo)本，熒光定量PCR方法檢測結(jié)果為陰性，符合率為100。2.4隨訪檢測隨訪周期3個(gè)月，對5例活動(dòng)性肺結(jié)核進(jìn)行了動(dòng)態(tài)檢測。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，隨著臨床治療方案的進(jìn)行，病人晨痰中結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量呈持續(xù)下降的趨勢（即Ct值增加）。隨訪期間連續(xù)4次測定患者標(biāo)本的結(jié)果，Ct值分別為26.60、27.58、28.25、29.14，呈連續(xù)增加（圖2）。為保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，每份晨痰都進(jìn)行平行測定。圖2隨訪期間熒光定量PCR連續(xù)測定肺結(jié)核患者標(biāo)本擴(kuò)增曲線隨訪期間，3例患者轉(zhuǎn)陰，2例仍為陽性。病例1為男性，23歲，發(fā)病時(shí)間約2個(gè)月，

11、病程較短，病情較輕，治療前X線檢查未見異常，痰涂片檢查：涂陽1+，服藥后在1個(gè)月內(nèi)迅速轉(zhuǎn)陰，結(jié)核分枝桿菌從105copys/mL減少到不能檢出。病例2、3、4、5治療前X線檢查均有不同程度的異常，病程較長，患病時(shí)間在半年以上。如病例2為男性，41歲，X線檢查右上肺可見斑片狀、條索狀模糊影，密度不均，邊緣不清，其中間見一空洞，無粟粒。痰涂片檢查結(jié)果為涂陽3+，診斷為咳痰等臨床癥狀均有減輕。病例仍為陽性。隨訪各病例結(jié)核分枝桿菌III型涂陽肺結(jié)核患者。經(jīng)過3個(gè)月的治療，4例患者咳嗽、2和3涂片與熒光定量PCR檢測結(jié)果均轉(zhuǎn)陰性，病例4、5Ct值隨時(shí)間的變化曲線見圖3。圖3熒光定量PCR檢測結(jié)核分枝桿菌

12、CT值與隨治療時(shí)間變化曲線討論熒光定量PCR是近年發(fā)展迅速的基因診斷技術(shù)。與傳統(tǒng)檢測方法比較，熒光定量PCR的陽性檢出率有顯著提高，研究中熒光定量PCR與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和涂片法的陽性檢出率分別是64.29、35.12、12.5，與文獻(xiàn)報(bào)道一致6，7。而且熒光定量PCR法極大地縮短了檢測的時(shí)間，有助于對患者確診并及時(shí)采取治療手段8，9。目前臨床所用實(shí)驗(yàn)室檢測方法十分落后，已成為阻礙我國結(jié)核病防治工作順利展開的重要原因，在基層建立和推廣特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測方法非常必要。在對5名確診結(jié)核病患者的隨訪中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過3個(gè)月的治療，3名患者痰液中不再有結(jié)核分枝桿菌檢出。另2名由于感染時(shí)間較長，并有較大程度的器質(zhì)性改變，經(jīng)過治療雖未很快轉(zhuǎn)陰，但排出的結(jié)核分枝桿菌數(shù)量也有顯著減少。在隨訪監(jiān)測期間，熒光定量PCR檢測結(jié)核分枝桿菌的Ct值隨著治療的持續(xù)進(jìn)行呈不