組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品海藻酸鈉

1、4.9細(xì)菌內(nèi)毒素4.9細(xì)菌內(nèi)毒素組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品海藻酸鈉1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了海藻酸鈉作為原料的要求、試驗(yàn)方法、檢驗(yàn)規(guī)則、標(biāo)志、包裝等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于制備組織工程醫(yī)療器械產(chǎn)品及其支架材料的海藻酸鈉C2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB./T 191包裝儲運(yùn)圖示標(biāo)志GB/T 2828. 1計數(shù)抽樣檢驗(yàn)程序第1部分：按接收質(zhì)量限（AQL）檢索的逐批檢驗(yàn)抽樣計劃GB/T 16886. 1醫(yī)療器械生物學(xué)評價第1部分：風(fēng)險管理過程中的評價與試驗(yàn)YY/T 0313醫(yī)用

2、高分子產(chǎn)品包裝和制造商提供信息的要求中華人民共和國藥典（2015版）3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。1分解 decomposition由于暴露在環(huán)境中，化學(xué)的或熱的因素導(dǎo)致海藻酸鈉結(jié)構(gòu)的改變，例如溫度高于180C。分解作用 可導(dǎo)致海藻酸鈉產(chǎn)生毒性變化。降解 degradation材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)或外觀發(fā)生改變。聚合物的降解通常依靠酸催化水解，斷裂糖昔鍵來實(shí) 現(xiàn)，在受熱時也常會發(fā)生降解。降解不是分解。對聚合物而言，降解通常是指解聚。解聚 depo I ymer i zat i on聚合物鏈的長度縮小成為較短的鏈段。解聚可以將聚合物變?yōu)楣烟呛?或單糖單元。對海藻酸鈉而 言，糖昔鍵的

3、水解是解聚的首要因素。水合膠體hydrocoI loid當(dāng)水合時水溶性聚合物形成的膠體。3.5平均分子量 average molecular mass ( average molecular weight)平均分子量最常用的表達(dá)方式是數(shù)均分子量（MJ和重均分子量（乩），其計算公式如下：NM / w*： / Ew，二 / ZN：M：式中：N：具有特定分子量M：的分子數(shù)量：W：具有特定分子量M,的分子質(zhì)量：在一個多分散體系中，此Mg扎/扎即分子量分布數(shù)值，海藻酸鈉的、L/扎通常在1.03.0之 間。4要求性狀應(yīng)為白色或淡黃色粉末狀固體。鑒別通過傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）檢測且其典型特征峰（c

4、m”基本一致：33753390 （b） , 1613 （s） , 1416 （s） , 1320 （w） , 1050-1125 （b） , 903 （m） , 600-710 （b）。其中，s：強(qiáng)帶：m： 中級帶；w：弱帶；b：寬帶。結(jié)構(gòu)組成采用H-核磁共振光譜（NMR）檢測，典型1H-NMR譜顯示如下：平均分子量及其分子量分布應(yīng)確定海藻酸鈉的平均分子量及其允差范圍，以及分子量分布數(shù)值。注：推薦海藻酸鈉的分子量分布數(shù)值為1.03.0之間。干燥失重應(yīng)不大于15.0% （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。分應(yīng)為18. 0%27. 0 % （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。金屬含量以鉛計重金屬總量應(yīng)不大于0. 004 % （質(zhì)量分?jǐn)?shù)），其

5、中伸含量應(yīng)不大于0.00015 % （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）, 鉛含量應(yīng)不大于0. 001 % （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。白質(zhì)含量應(yīng)不大于0.3 % （質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。6檢驗(yàn)規(guī)則6檢驗(yàn)規(guī)則應(yīng)小于0. 5 EU/mgo10微生物限度細(xì)菌菌落總數(shù)應(yīng)不大于200 CFU/go11生物學(xué)評價對本材料在預(yù)期使用中與人體接觸的部位、性質(zhì)和時間進(jìn)行分類，按照GB/T 16886. 1所述的基本 原則進(jìn)行生物安全性評價。5試驗(yàn)方法性狀目視觀察，應(yīng)符合4.1的規(guī)定。鑒別通過傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）測定（浪化鉀壓片法），應(yīng)符合4. 2的規(guī)定。結(jié)構(gòu)組成采用H-核磁共振光譜（NMR）檢測，試驗(yàn)方法見附錄A,應(yīng)符合4. 3的規(guī)定。平均分子

6、量及其分子量分布平均分子量可通過以下兩種方法來確定：特性黏數(shù)法，以及凝膠滲透色譜聯(lián)合多角度激光散射測定 儀（SEC-MALLS）測定分子量。試驗(yàn)方法見附錄B,應(yīng)符合4. 4的規(guī)定。干燥失重采用中華人民共和國藥典（2015版）四部通則0831規(guī)定的方法測定。應(yīng)符合4. 5的規(guī)定?；曳职凑罩腥A人民共和國藥典（2015版）四部通則0841的方法測定，推薦在800c下灼燒至少6 h。 應(yīng)符合4. 6的規(guī)定。重金屬含量重金屬總量按照中華人民共和國藥典（2015版）四部通則0821重金屬檢查法第二法測定，伸 含量按照中華人民共和國藥典（2015版）四部通則0822神鹽檢查法第一法測定，鉛含量按照中 華人民

7、共和國藥典（2015版）四部通則0406原子吸收分光光度法第一法測定，應(yīng)符合4. 7的規(guī)定。注：珅含:ft、鉛含量也可按照中華人民共和國藥典（2015版）四部通則0412電棲耦合等離子體質(zhì)譜法測定。蛋白質(zhì)含量按照附錄C規(guī)定的方法測定，應(yīng)符合4. 8的規(guī)定。細(xì)菌內(nèi)毒素按照中華人民共和國藥典（2015版）四部通則1143規(guī)定的方法進(jìn)行測定。應(yīng)符合4. 9的規(guī)定。微生物限度按照中華人民共和國藥典（2015版）四部通則1105規(guī)定的方法測定，應(yīng)符合4. 10的規(guī)定。生物學(xué)評價按照GB/T 16886. 1所述的基本原則進(jìn)行生物安全性評價。6. 1批檢驗(yàn)產(chǎn)品以同日投料，同一工藝生產(chǎn)的產(chǎn)品為同一批號。6.

8、 1.2 批檢驗(yàn)應(yīng)進(jìn)行 4. 1, 4. 5, 4. 6, 4. 7, 4. 8, 4. 9, 4. 10 的檢測。6. 2型式檢驗(yàn)6.1.3型式檢驗(yàn)為全性能檢驗(yàn)。6.1.4型式檢驗(yàn)時，若所有檢驗(yàn)項(xiàng)目全部合格，則判定為合格，否則判定為不合格。6. 3抽樣檢驗(yàn)抽樣方案按照GB/T 2828.1進(jìn)行。7標(biāo)志大包裝應(yīng)有下列標(biāo)志：a）生產(chǎn)廠名和地址：b）產(chǎn)品名稱：c）產(chǎn)品注冊號和執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)編號；d）分類和規(guī)格：e）生產(chǎn)批號或日期；f）失效日期;g）貯存條件。小包裝應(yīng)有下列標(biāo)志：a）產(chǎn)品名稱;b）生產(chǎn)廠名和地址；c）分類和規(guī)格；d）生產(chǎn)批號或日期；e）原料來源：f）失效日期;g）貯存條件。儲運(yùn)標(biāo)志應(yīng)符合G

9、B/T 191中的規(guī)定。8包裝應(yīng)采用適宜的包裝，確保海藻酸鈉產(chǎn)品的安全性和有效性。產(chǎn)品的包裝、貯存、運(yùn)輸應(yīng)符合YY/T 0313的規(guī)定。YY/T XXXXXXXXX YY/T XXXXXXXXX附錄A（規(guī)范性附錄）海藻酸鈉的結(jié)構(gòu)組成和序列結(jié)構(gòu)的川-核磁測試方法A. 1范圍A. 1.1本檢測方法用于制備組織工程醫(yī)療產(chǎn)品及外科植入物的海藻酸鈉。A. 1.2描述海藻酸鈉的參數(shù)，包括艮（G含量），K （M含量）M/G、NC1 （連續(xù)G單元的平均數(shù)量大于1 的數(shù)值，即不包括-MGM-在內(nèi)的G單元的平均長度）等。A.2使用和有效性采用H-NMR的方法進(jìn)行測定時，海藻酸鈉溶液的黏性有可能導(dǎo)致NMR譜線加寬，

10、從而影響測定結(jié)果。 因此在測定前，需要先通過條件溫和的部分水解降低海藻酸鈉樣品溶液的黏性。把海藻酸鈉溶解于 99附M）中之后凍干，再將其溶解于99. 9 % D：0再凍干從而制備低宜0含量的樣品。三乙烯四胺六乙酸 （TTHA）被用作螯合劑以防止二價陽離子與海藻酸鈉反應(yīng)，這種反應(yīng)可以導(dǎo)致譜線加寬以及信號強(qiáng)度的 選擇性丟失。A.3材料A. 3. 1化學(xué)物質(zhì)A. 3.1.1海藻酸鈉樣品。A. 3. 1.2去離子水。A. 3. 1.3 HC1 （1 mol/L, 0. 1 mol/L）oA. 3. 1.4 NaOH （1 mol/L, 0. 1 mol/L）oA. 3. 1.5 DcO （99 %-9

11、9.9 %, 99.9 %）oA. 3. 1.6 三乙烯四胺六乙酸（TTHA, D2中0.3 mol/L, DC1或NaOD調(diào)pH值至555）。A. 3. 2儀器A. 3. 2. 1 分析天平（0. 1 mg）oA. 3. 2. 2振蕩器。A. 3. 2. 3 pHihA. 3. 2.4 水?。?00 *C）OA. 3. 2. 5凍干裝置。A. 3. 2. 6 NMR儀（推薦300 MHz區(qū)域強(qiáng)度或更高）。A. 4步驟A. 4.1樣品制備A. 4.1.1制備100 mL Img/mL海藻酸鈉水溶液。A. 4. 1.2 HC1 （1 mol/L, 0. 1 mol/L）調(diào)pH值為5. 6,將其置

12、于 100 C水浴中 1 hA. 4. 1.3 HC1 （1 mol/L, 0. 1 mol/L）調(diào)pH值為3.8,將其置于 100 水浴中30 min。A. 4. 1.4 NaOH （1 mol/L, 0. 1 mol/L）調(diào)pH值為78,凍干樣品過夜.A. 4. 1.5在99舟99.9 % D：0 5 mL中溶解海藻酸鈉樣品，再次凍干。A. 4. 1.6在99.9 % D：0 1 mL中溶解海藻酸鈉樣品10 mg12 mg.A. 4. 1.7在NMR樣品管中加入0.7 mL海藻酸鈉樣品,再加入20，L, 0. 3 mol/L TTHAoA. 4. 2技術(shù)參數(shù)A. 4. 2. 1海藻酸鈉牛-

13、NMR參數(shù)心沖出應(yīng)在80, 20Hz的標(biāo)準(zhǔn)一圍脈沖中獲得。原子核 質(zhì)子譜帶寬度 掃描次數(shù) 弛豫時間 質(zhì)子脈沖角度 掃描時間XH-0.5T 9.5642s904. 096s取得樣品數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)量取決于譜帶寬度（Hz）和掃描時間；32768 （400 Hz時）推薦使用數(shù)字式濾 器以及適合的數(shù)字信號處理器以獲得良好的基線。A. 4. 2. 2參考譜圖見圖1cA. 4. 3計算A. 4. 3, 1 :H-NMR數(shù)據(jù)由一系列方程式或影響因素進(jìn)行計算。這些因素包括（i）數(shù)據(jù)的最高平均數(shù)：（i i）保證黏度（例如，E:F&+ F）o在圖1中顯示了信號A, Bl, B2, B3, B4和C的積分強(qiáng)度JH-NMR

14、中 這些信號的意義如下：red-a： alpha reducing-endsA： Gred-b： beta reducing-endsBl： GGMB2： MGMB3： MGB4： MMC： GG海藻酸鈉的化學(xué)成分和序列結(jié)構(gòu)取決于信號的強(qiáng)度，它反映了各個成分的量。 TOC o 1-5 h z A. 4. 3. 2相關(guān)公式如下： G=0. 5A+C+0. 5 (B1+B2+B3) (A.1)M=B4+0. 5 (B1+B2+B3) (A.2)GG=0. 5 A+C-0. 5 (B1+B2+B3) (A.3)MG=GM=0. 5 (B1+B2+B3) (A.4)MM=B4(A.5)GGM=MGG=

15、 (Bl) 0.5 (B1+B2+B3) / (B1+B2) (A.6)MGM=(B2) 0.5 (Bl+B2TB3) / (B1+B2) (A.7)GGG=GG-GGM(A. 8)Fg=G/ (M+G) (A. 9)F=M/ (M+G) (A.10)F卬=GG/ (M+G) (A.11)Fp=MM/ (M+G) (A.12)FcFFMG/ (M+G) (A.13)F亭=GGG/ (M+G) (A.14)Fm=MGM/ (M+G)(A.15)F所F呼=GGM/ (M)(A.16)Nc=Fc/Fcx(A.17)Nci= (Fc-Fjkx)/Fp(A.18)NE/F*(A.19)如果reducin

16、g end signals也被積分(redn和red-b),則平均聚合度的評估公式如卜: DPn=(M+G+red-a+red-b)/(red-a+red-b ) (A.20)式中：Ga-L-古羅糖醛酸；M一一B-D-甘露糖醛酸：GG、GGGa-L-古羅糖醛酸聚合嵌段：MM、MMMB-D-甘露糖醛酸聚合嵌段：MG. GGM、MGM一一 Q-L-古羅糖醛酸和B-D-甘露糖醛酸聚合嵌段：Fc一一。-L-古羅糖醛酸含量：R一一B-D-甘露糖醛酸含量：F斤F*u-L-古羅糖醛酸聚合嵌段含量；F9- B -D-甘露糖醛酸聚合嵌段含量；電、F守、F守一一。-L-古羅糖醛酸和B-D-甘露糖醛酸含量：A逢續(xù)山

17、。-L-古羅糖醛酸單體的平均數(shù)量：Nc ,連續(xù)的。-L-古羅糖醛酸單體的平均數(shù)量大于1的數(shù)值，即不包括-MGM-在內(nèi)的G單元的平均 長度：連續(xù)的B -D-甘露糖醛酸單體的平均數(shù)量：DPn平均聚合度。A.5標(biāo)準(zhǔn)偏差和結(jié)果A. 5. 1 Fc及其標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)應(yīng)精確到0. 01。5.2 G含量高的海藻酸鈉應(yīng)給出G含量，例如，R為0.68 (標(biāo)準(zhǔn)偏差二0.01)。M含量高的海藻酸鈉應(yīng)給出M含量，例如,B為0.66 (標(biāo)準(zhǔn)偏差二0.01)。附錄B（規(guī)范性附錄）海藻酸鈉平均分子量及其分子量分布的測試方法1概述海藻酸鈉的分子量決定著它的某些特性，如粘度和/或膠體拉伸率等。由于上述原因以及這些特性 的不同

18、對最終用途的影響，采用直接或間接的方法測定海藻酸鈉的分子量是十分必要的。海藻酸鈉是一 個確定分子量范圍的多分散體系。分子量可用數(shù)均分子量（MJ和重均分子量（MJ米表示?？梢酝ㄟ^ 下述方式來測定：2依據(jù)特性黏數(shù)測定海藻酸鈉分子量特性黏數(shù)是描述單位質(zhì)量聚合物在溶液中的流體力學(xué)體積，表征聚合物在特定溶劑和溫度條件下的 一種特性,與濃度無關(guān)，與聚合物的平均分子量成比例。特性黏數(shù)的計算公式為:Mark-Houwink-Sakurada 方程其中K為常數(shù)，M為平均分子量，。為描述聚合物組成的經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，通常為0.51。當(dāng)。二1 時，M，i=扎。對海藻酸鈉而言，在離子強(qiáng)度為0.1時（例如，O.lmol/LNa

19、Cl溶液），其指數(shù)。接近于1。通過測 定特性黏數(shù)，并已知樣品的K和u值，則可確定聚合物的粘均分子量。特性黏數(shù)可以通過烏氏黏度計測 定。整個測定過程應(yīng)確保在溫度恒定為20 C,含有0.1 mol/L NaCl溶液和足夠低的海藻酸鈉濃度等條 件下進(jìn)行。其具體操作方法如下。精密稱取105 干燥6 h的海藻酸鈉0.2 g,置于約50mL的0.1 mol/L NaCl 溶液中（內(nèi)含0.05 %乙二胺四乙酸二鈉），放置24 h后溶解并稀釋至100 mL,按中華人民共和國藥 典（2015版）四部通則0633第二法測定特性黏數(shù)（n ）（溫度控制在20c0.05C）,其中K=2.0X IO-5, a =1,代入

20、Mark-Houwink-Sakurada方程，即可計算得到海藻酸鈉的平均分子量。B.3用凝膠滲透色譜（GPC）與多角度激光散射測定儀（SEC-MALLS）測定海藻酸鈉平均分子量及其分 子量分布多角度激光散射測定儀作為測分子量用的附加檢測器，不需標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)，克服了樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的化 學(xué)組成、分子結(jié)構(gòu)及大小不同帶來的誤差。由于通常無法獲得海藻酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)品，GPC結(jié)合SEC-MALLS 方法為測定其平均分子量提供了新的途徑。色譜條件如下:采用TSK G4000Pwx色譜柱：多角度激光檢測器及示差折光檢測器:流動相為0. 1 mol/L NaNOs溶液；流速為0. 5 mL/mino采用GPC結(jié)合SEC-MALLS,在690. 0 nm的波長和25 下測定散射光強(qiáng)。海藻酸鈉溶液的溶劑為超純 水。將樣品按上述色譜條件進(jìn)樣，測定分子量及其分子量分布。由Zimm圖用外推法計算扎，此以及分子 量分布指數(shù)必。附錄C(規(guī)范性附錄)海藻酸鈉蛋白質(zhì)含量測定1原理庫馬斯亮藍(lán)G-250具有兩種色調(diào)，在游離狀態(tài)下呈紅色，與蛋白質(zhì)結(jié)合后轉(zhuǎn)為青色，且其色深淺與 蛋白質(zhì)的濃度成正比。C.2設(shè)備C. 2. 1分析天平C. 2.2分光光度計2.1旋渦式混合器C.