講堂10fish技術(shù)原理與應(yīng)用熒光原位雜交

1、熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization，F(xiàn)ISH)內(nèi)容介紹FISH技術(shù)的基本原理FISH技術(shù)的實(shí)驗(yàn)方法和步驟FISH技術(shù)的應(yīng)用FISH原理FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。與傳統(tǒng)的放射性標(biāo)記原位雜交相比，熒光原位雜交具有快速、檢測信號強(qiáng)、雜交特異性高和可以多重染色等特點(diǎn)，因此在分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域受到普遍關(guān)注。FISH原理探針的熒光標(biāo)記探

2、針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測，同時(shí)還可以利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號進(jìn)行放大，從而可以檢測500bp的片段。直接標(biāo)記法是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測時(shí)步驟簡單，但由于不能進(jìn)行信號放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。雜交探針FISH實(shí)驗(yàn)方法和步驟固定細(xì)胞FFPE組織貼片F(xiàn)ISH實(shí)驗(yàn)方法和步驟1）探針變性2）標(biāo)本變性 3）雜交 4）洗脫5）雜交信號擴(kuò)大6）封片，熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果FISH實(shí)驗(yàn)

3、方法和步驟1）探針變性：將探針在75oC恒溫水浴中溫育5min，立即置0oC，510min，使雙鏈DNA探針變性。2）標(biāo)本變性：將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50oC培養(yǎng)箱中烤片23h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。取出玻片標(biāo)本，將其浸在7075oC的體積分?jǐn)?shù)70甲酰胺/2SSC的變性液中變性23min。 立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70、體積分?jǐn)?shù)90和體積分?jǐn)?shù)100冰乙醇系列脫水，每次5min，然后空氣干燥。3）雜交：將已變性或預(yù)退火的DNA探針10L滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上1818蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37oC雜交過夜（約1517h）

4、。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行。4）洗脫：此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底5）雜交信號的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）6）封片：可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在2070oC的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。7）熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果：先在可見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源，F(xiàn)ITC的激發(fā)波長為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色，而經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)

5、出綠色熒光。FISH技術(shù)優(yōu)點(diǎn)FISH不需要放射性同位素作探針標(biāo)記，安全性高；FISH的實(shí)驗(yàn)周期短，探針穩(wěn)定性高；FISH能通過多次免疫化學(xué)反應(yīng)，使其雜交信號明顯增強(qiáng)，從而提高靈敏度，檢測的靈敏度接近同位素探針雜交；FISH的分辨率高達(dá)1Kb-20Mb；FISH可以用不同修飾核苷酸分子標(biāo)記不同的DNA探針。FISH技術(shù)缺點(diǎn)雜交效率隨探針長度縮短而大幅度降低必須在已知探針的情況下進(jìn)行主觀判斷，準(zhǔn)確度（參照標(biāo)準(zhǔn)不同）FISH技術(shù)的應(yīng)用染色體結(jié)構(gòu)變異與非整倍體的檢測基因擴(kuò)增和缺失的檢測基因定位基因作圖染色體RNA和基因組進(jìn)化研究.Case 1 染色體結(jié)構(gòu)變異 Case2 基因擴(kuò)增和缺失FISH ana

6、lysis of the 5q deletion .Two signals were observed for the control loci (D5S23, D5S721 at 5p15), but only one signal was seen for the CSF1R locus (5q3334).Gastric Tumor Her2/neu FISHCase2 基因定位和作圖Multicolor fluorescence in situ hybridization of canine clones to dog chromosome 5 (CFA 5).Chromosomal m

7、apping of the murine Sirt5 gene.FISH技術(shù)的臨床應(yīng)用產(chǎn)前診斷腫瘤病理出生缺陷和智力發(fā)育滯緩病理檢測特殊的染色體異常疾病鑒定骨髓移植預(yù)后判斷產(chǎn)前診斷產(chǎn)前診斷（prenatal diagnosis）是指在出生前對胚胎或胎兒的發(fā)育狀態(tài)、是否患有疾病等方面進(jìn)行檢測診斷。狹義的產(chǎn)前診斷，僅針對胎兒染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常的疾病，在妊娠期通過有創(chuàng)性診斷方法（絨毛取材術(shù)、羊膜腔穿刺術(shù)和經(jīng)皮臍血管穿刺）獲取胎兒來源細(xì)胞，進(jìn)行染色體核型檢測，發(fā)現(xiàn)并確診，能夠于分娩前盡早終止妊娠。唐氏綜合征，是指細(xì)胞在減數(shù)分裂后期，第21號染色體未正常分離，從而導(dǎo)致該染色體有三條，因此也稱為21-三

8、體綜合征。它是目前發(fā)病率最高的染色體疾病之一，發(fā)病率約為1/600-800。傳統(tǒng)血清學(xué)唐氏篩查是通過抽取孕婦外周血，檢測血清中甲型胎兒蛋白、絨毛促性腺激素和游離雌三醇的濃度水平，并結(jié)合孕婦的預(yù)產(chǎn)期、體重、年齡和孕周等指標(biāo)計(jì)算生出唐氏患兒的危險(xiǎn)系數(shù)。唐氏篩查一般在孕中期進(jìn)行，最佳檢測孕周是14-20w+6。因其影響因素較多，由此計(jì)算得出的風(fēng)險(xiǎn)值誤差很大，假陽性和漏診率較大。唐氏篩查的檢出率只有60-70%左右，漏診率高達(dá)30-40%，因此唐篩低危孕婦也可能孕有唐寶寶；而唐篩結(jié)果高危的孕婦大部分經(jīng)產(chǎn)前診斷確診均孕正常胎兒。熒光原位雜交針對特異染色體（13、18、21、X和Y染色體）的快速產(chǎn)前診斷的

9、方法目前在歐美國家已得到大規(guī)模應(yīng)用，需要時(shí)間大幅縮短至24-48小時(shí)。產(chǎn)前診斷Male fetus with Down syndrome男嬰，唐氏綜合征染色體異常檢測染色體異常會(huì)影響機(jī)體的多個(gè)方面， 染色體病一般具有以下臨床特征：染色體病患者一般有先天性多發(fā)畸形，智力發(fā)育和生長發(fā)育遲緩，有的還有特殊的皮膚紋理改變。性染色體異常患者，除有上述特征外，常伴有內(nèi)外生殖器異?；蛳忍煨曰?，如性腺發(fā)育不良，副性腺不發(fā)育等。帶有染色體異常的胚胎，大部分流產(chǎn)或死產(chǎn)。在孕早期流產(chǎn)中，有50%-60%由染色體異常所導(dǎo)致，且流產(chǎn)發(fā)生的越早，流產(chǎn)胎兒的染色體異常頻率越高。染色體平衡易位攜帶者，其表型正常的親代有可能

10、將其畸變?nèi)旧w傳至子代，引起子代染色體不平衡而致病。染色體異常檢測流產(chǎn)組織染色體異常檢測：針對各種流產(chǎn)組織進(jìn)行檢測分析，配合臨床查找流產(chǎn)和異常妊娠的原因；成人不孕不育：為臨床上不孕不育夫婦查找染色體異常，判斷不孕不育的遺傳因素；成人或兒童染色體異常：為發(fā)育遲緩，智力低下以及多發(fā)畸形的患兒及其父母分析染色體異常方面的原因。染色體異常檢測 Androgen Receptor (Xq12) Smith Magenis syndrome (17p11.2) Angelman syndrome (15q11q13) SRY/Xcen (Yp11.3) Autism (dup15q12) Steroid

11、Sulfatase Deficiency (STS) (Xp22.3) Cri-du-chat syndrome* (5p-) Subtelomere rearrangement analysis DiGeorge/VCF (22q11.2) Trisomy screen (13, 18, 21, X, Y) Kallman syndrome (Xp22.3) Williams syndrome (7q11.23) Miller-Dieker syndrome (17p13) Wolf-Hirschhorn syndrome* (4p-) Phelan-McDermid syndrome (2

12、2q13.3) X/Y dual assay腫瘤病理：乳腺癌Her2基因檢測腫瘤病理：乳腺癌Her2基因檢測腫瘤病理：乳腺癌Her2基因檢測腫瘤病理： ALK融合熒光原位雜交 ALK最早是在間變性大細(xì)胞淋巴瘤（ALCL)的一個(gè)亞型中被發(fā)現(xiàn)的，因此定名為間變性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase，ALK）。隨后，在發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中有ALK基因重排之前，在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤和炎癥性肌纖維母細(xì)胞瘤（IMT）中分別發(fā)現(xiàn)了有多種類型的ALK基因重排，至此證明ALK是強(qiáng)力致癌驅(qū)動(dòng)基因。ALK分離熒光原位雜交檢測，是ALK診斷檢測最終獲得FDA批準(zhǔn)，用于檢測ALK基因重排非小細(xì)

13、胞肺癌，連同克唑替尼獲得美國批準(zhǔn)的基礎(chǔ)，也是目前唯一經(jīng)臨床驗(yàn)證的ALK檢測方法。該檢測可對FFPE組織進(jìn)行，這也是絕大多數(shù)肺癌組織的處理方式。要進(jìn)行分離熒光原位雜交沒有必要知道特定融合伴侶，因此，標(biāo)準(zhǔn)分離熒光原位雜交方案將允許在非小細(xì)胞肺癌以外檢測ALK基因重排。腫瘤病理： ALK融合熒光原位雜交腫瘤病理： ALK融合熒光原位雜交EML4-ALK是間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphomakinase, ALK)基因和棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白樣4(echinodermmicro tubule associated proteinlike 4,EML4)的融合基因。EML4-ALK融合基

14、因是非小細(xì)胞肺癌中最新發(fā)現(xiàn)的分子靶標(biāo)之一，所有的EML4-ALK融合基因均有生物學(xué)活性，其嵌合產(chǎn)物可導(dǎo)致ALK酪氨酸激酶持續(xù)高表達(dá)，從而激活下游PI3K/AKT、MAPK等信號通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。EML4-ALK融合基因存在與否與ALK激酶抑制劑的療效相關(guān)，小分子酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼(Crizotinib)對含有EML4-ALK融合基因突變的肺癌患者療效顯著。由跨國藥企Pfizer生產(chǎn)的靶向藥物克唑替尼(Crizotinib)，是一種上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型生長因子(Mesenchymal Epithelial Trasition Growth Factor, c-MET)和ALK的雙重抑制劑，是第一個(gè)針對EML4-ALK靶標(biāo)的ALK抑制劑藥物，目前已獲美國FDA批準(zhǔn)用于EML4-ALK陽性非小細(xì)胞肺癌患者的治療。腫瘤病理： ALK融合熒光原位雜交骨髓移植預(yù)后判斷目前異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneichematopoieticstemceltransplantation，allo-HSCT)是治療血液系統(tǒng)惡性和非惡性疾病的有效手段。移植后動(dòng)態(tài)監(jiān)測供受者混合性嵌合體比例變化判定移植是否成功，對指導(dǎo)移植后治療和預(yù)測復(fù)發(fā)具有十分重要的意義。FISH技術(shù)具有操作簡便、快速及結(jié)果敏感可靠等優(yōu)點(diǎn)，通過性染色體計(jì)數(shù)探針動(dòng)態(tài)監(jiān)測供受者混合性嵌合體比例變化對