分子熒光測定海水中氨氮含量

1、實驗熒光分析法測定海水中氨氮的含量一、實驗原理1.1方法原理海水中的氨氮與鄰苯二甲醛（o-Phthaldehyde, OPA）、亞硫酸鈉在堿性介 質中反應，生成具有熒光性的異吲噪衍生物，當其吸收了外界能量后，能發(fā)射出 一定波長和強度的光稱為熒光。外界提供能量的方式有多種，通過光照射激發(fā)產(chǎn) 生的熒光稱為光致熒光。由于不同的物質其組成與結構不同，所吸收光的波長（人x）和發(fā)射光的波 長以em）也不同，利用這兩個特性參數(shù)可以進行物質的定性鑒別。在y和y 一定的條件下，如果物質的濃度不同，它所發(fā)射的熒光強度（）就不同，兩者 F之間的定量關系可用下式表示：If=KC式中：if能發(fā)熒光物質的熒光強度；c能發(fā)

2、熒光物質的濃度；k 一定條件下的常數(shù)。當激發(fā)光強度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時，物質在一定濃度范圍 內，其發(fā)射熒光強度與溶液中該物質的濃度成正比，測量物質的熒光強度可對 其進行定量分析。熒光分析法就是利用物質的熒光特征和強度，對物質進行定性 和定量分析的方法。1.2儀器原理利用熒光進行物質定性定量分析的儀器有熒光計和熒光分光光度計，本次實 驗所用的是熒光分光光度計，其基本原理是：采用氙燈作光源，通過狹縫經(jīng)光 柵分光后照射到被測物質上，發(fā)射的熒光用光電倍增管檢測，經(jīng)放大后由數(shù)據(jù)采 集系統(tǒng)記錄結果。該儀器由四個基本部分組成，即激光光源、樣品池、用于選 擇激發(fā)波長和熒光波長的單色器或濾光片、檢

3、測器。圖1為熒光分光光度計的結 構示意圖。圖1熒光分光光度計結示意圖激發(fā)光源：選擇激發(fā)光源主要應考慮它的穩(wěn)定性和強度，光源穩(wěn)定性直接影 響測定的精密度和重復性，而強度則直接影響測定的靈敏度和檢出限，目前大部 分熒光分光光度計采用高壓氙燈作為光源。樣品池：通常采用低熒光的石英材質制成的方形或長方形池體。單色器：熒光分析儀具有兩個單色器，分光光度計采用光柵，熒光計采用濾 光片。第一個單色器置于光源和試樣池之間，用于選擇所需的激發(fā)波長，是之照 射與被測試樣上。第二個單色器置于樣品池與檢測器之間，用于分離所需檢測的 熒光發(fā)射波長。檢測器：熒光強度通常較弱，需要較高靈敏度的檢測器，一般采用光電倍增 管，

4、檢測位置與激發(fā)光成直角。二、儀器與試劑2.1儀器100-1000 pL（Finnpipette）移液槍，25 mL比色管，石英比色池（1 cm），洗 瓶2個，F(xiàn)96pro熒光分光光度計（上海棱光技術有限公司制造）2.2試劑氨氮標準使用液（100四mol/L），亞硫酸鈉溶液（10 mmol/L），四硼酸鈉溶液（10 g/L） ,OPA溶液（25 mmol/L），未知溶液B三、實驗步驟3.1標準工作曲線溶液的配制及測定3.1.1取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00 mL氨氮標準使用液標樣于比色管 中，用超純水定容至25.00 mL。3.1.2分別加入四硼酸鈉溶液、亞硫酸鈉溶液和OPA

5、溶液，各1.00 mL，混 勻后靜置30 min。3.1.3掃描發(fā)射波長，確定最佳發(fā)射波長。3.1.4在選定的激發(fā)波長和發(fā)射波長下測定標準樣品的熒光值，繪制標準 工作曲線。3.2待測樣品濃度的測定3.2.1取25.00 mL的待測樣品，衍生處理與上述步驟相同（樣品做三個平 行樣）。3.2.2根據(jù)標準工作曲線計算待測海水樣品中氨氮的含量。四、數(shù)據(jù)處理與結果4.1最佳發(fā)射波長的確定在選定的激發(fā)波長下，用分子熒光分光光度計對一定濃度的標準樣品所發(fā)射 出的波長在300-500 nm內的熒光強度進行掃描，得到該溶液熒光強度和發(fā)射波 長的數(shù)據(jù)，利用origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)進行處理，繪制得到如下光譜曲

6、線，如圖 1所示，由圖可知，在一定激發(fā)波長下，氨氮溶液發(fā)出的423 nm的熒光強度值最高， 選取此發(fā)射波長進行測定時靈敏度高誤差最小。圖1熒光發(fā)射光譜圖4.2繪制標準工作曲線用F96pro熒光分光光度計測定所配標準溶液氨氮熒光強度，取三次測定結 果的平均值，得數(shù)據(jù)如表1所示。表1標準工作曲線的測定數(shù)據(jù)序號標準溶液中氨氮的濃度md/L）熒光強度（IF）10.0066.4022.00102.2134.00191.6846.00209.3658.00333.48對測量結果進行簡單分析計算可知，第四個數(shù)據(jù)與其他數(shù)據(jù)的相關性較差對 做出的標準曲線圖會產(chǎn)生影響從而影響測量結果，作圖之前需要先舍棄。該數(shù)據(jù)

7、產(chǎn)生的原因可能有二：1.由于儀器工作不穩(wěn)定，在測量第四組數(shù)據(jù)時儀器的光源 發(fā)射出的光的強度有所降低，從而使溶液所發(fā)出的熒光強度降低使數(shù)據(jù)產(chǎn)生偏離；2.由于操作失誤，在配制標準工作曲線溶液時，加入的氨氮標準溶液不足1.50 mL使測量的熒光強度偏低。利用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行處理，繪制得圖到如下：圖2標準工作曲線4.2計算樣品中氨氮的含量用F96pro熒光分光光度計未知樣品溶液B （三個平行樣）進行測定，并對 每個平行樣進行三次測定，三次測定結果取平均值，得數(shù)據(jù)如表2所示。表2未知樣品溶液B的測定結果未知樣品溶液熒光強度I平行樣1258.01平行樣2251.77平行樣3327.00平行樣1中氨

8、氮濃度：將其熒光強度If=258.01帶入線性回歸方程 y=34.593x+52.366 計算可得濃度 c5.94 四mol/L。同理可求得平行樣2和平行樣3中氨氮的濃度分別為5.76四mol/L, 7.93四mol/L。三次平行測定的平均值為6.54四mol/L。故未知溶液B中氨氮的濃度為6.54 四mol/L。五、問題與討論（1）實驗中加入亞硫酸鈉溶液和四硼酸鈉溶液的作用分別是什么？熒光法測量氨氮是基于氨氮與鄰苯二甲醛在堿性條件下，發(fā)生反應生成衍 生物的基礎上進行的，反應的主要試劑為鄰苯二甲醛（OPA），選擇硼眇氫氧化 鈉緩沖液提供反應需要的堿性環(huán)境，選擇亞硫酸鈉作為反應的增穩(wěn)增敏劑，提高

9、 熒光體系的靈敏度和測量的穩(wěn)定性。（2）請另推薦一種測定海水中氨氮的方法，并與本實驗方法比較，說 明其優(yōu)缺點。在自然條件下，海水中的銨離子與氨共存，氨在海水中的離解度受海水中的 pH及溫度T的制約。原則上直接測量海水中的銨離子或氨均能測得總的氨氮含 量。但實際上直接用銨離子電極測量海水中的銨離子含量困難極大。主要原因是 海水為一個十分復雜的離子共存體，如K+、Na+、Mg2+、A13+等。其中K+、Na2+含量 巨大，構成對銨離子測量的嚴重干擾，而直接采用氨電極測量其含量則容易得多， 且不受上述諸多離子的干擾。根據(jù)銨離子和氨在水溶液中的質子平衡方程式可知，如果同時測得海水的溫 度丁，酸度pH和

10、氨的濃度NH3，那么在此種情況下便可獲得氨的離解度以及總 氨含量。此法是利用氨氮測量儀對海水中的氨氮進行實時測量的方法。其優(yōu)點是簡單快捷，可以對海水中的氨氮進行實時準確地測定便于野外測定 時使用，缺點是靈敏度較低。（3）影響儀器穩(wěn)定性的主要因素分析。電源電壓：電源電壓的穩(wěn)定性直接影響儀器光源強度的穩(wěn)定性，而光源的穩(wěn) 定性則影響測量的重復性和精確度，當電源電壓發(fā)生波動時，會使儀器的光強改 變從而影響被測物質發(fā)射熒光的強度，使測量發(fā)生誤差。溫度：由于大多數(shù)熒光物質隨著溫度的升高，其熒光效率和熒光強度降低， 這是因為在較高溫度下，分子內部能量有發(fā)生轉換的傾向，且溶質分子與溶劑分 子的碰撞幾率增大，使發(fā)生振動弛豫和外轉換的概率增加，所以溫