單抗系列培訓(xùn)完整版ppt課件

1、單克隆抗體 分享人：李 行2021.08.單抗根本概念單抗開展歷程單抗制備原理單抗實(shí)踐運(yùn)用實(shí)驗(yàn)存在的問題報(bào)告內(nèi)容單抗簡介. 單抗簡介1975年Kohler和Milstein建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，使經(jīng)綿羊紅細(xì)胞SRBC免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠的骨髓瘤細(xì)胞交融，創(chuàng)建了第一個B細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞株，獲得了抗SRBC的單克隆抗體。單抗技術(shù)的問世，不僅帶來了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次革命，而且它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個領(lǐng)域獲得極廣泛的運(yùn)用，促進(jìn)了眾多學(xué)科的開展。因此說單抗技術(shù)是免疫學(xué)，乃至醫(yī)學(xué)史上的一個里程碑。 .抗體消費(fèi)技術(shù)的三個時(shí)代：多克隆抗體 單克隆抗體 基因工程抗體. 根本概念1.抗原 1.1 傳統(tǒng)抗原根本概

2、念：能啟動機(jī)體的免疫應(yīng)對，且能與其免疫應(yīng)對產(chǎn)物(抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞)特異性結(jié)合，并產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)。1.2 現(xiàn)代抗原概念：能被B細(xì)胞免疫球蛋白受體識別或與主要組織相容性復(fù)合體MHC結(jié)合后能被T細(xì)胞受體識別的物質(zhì)統(tǒng)稱為抗原。.1.3 抗原的兩種根本特性：1免疫原性：指抗原分子可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)對產(chǎn)生特異性抗體及免疫效應(yīng)細(xì)胞的性質(zhì)。.2反響原性：指抗原分子與免疫應(yīng)對產(chǎn)物抗體或免疫效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)。.1.4 完全抗原與半抗原1完全抗原：具有免疫原性和反響原性的物質(zhì)。2半抗原又稱不完全抗原：無免疫原性，只需抗原性的物質(zhì)。3載體carrier：與半抗原結(jié)合使其成為免疫原的物質(zhì)。

3、如BSA，OVA半抗原+ 載體完全抗原.1.5 抗原表位抗原決議簇：指抗原分子中決議抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)。即抗原上可以引起機(jī)體產(chǎn)生抗體的分子構(gòu)造。一個抗原可以有許多不同的抗原決議簇。. 抗體Antibody,Ab根本概念：機(jī)體免疫細(xì)胞被抗原激活后，由分化成熟的終末B細(xì)胞-漿細(xì)胞合成、分泌的一類能與抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的免疫球蛋白。3.免疫球蛋白immunoglobulin, Ig： 具有抗體活性或化學(xué)構(gòu)造與抗體分子類似的球蛋白。2 .抗體 備注：Ab= Ig, IgAb,Ab是功能描畫，Ig是化學(xué)構(gòu)造的描畫。.根本構(gòu)造： 重鏈heavy chain，H2條 輕鏈light chai

4、n，L2條 可變區(qū)variable region, V區(qū) 恒定區(qū)constant region, C區(qū) 超變區(qū)hyper-variable region, HVR),又稱互補(bǔ)決議 區(qū)complementarydeterminingregion, CDR 骨架區(qū)framework region,FR 鉸鏈區(qū)hinge region3.1 免疫球蛋白的構(gòu)造可變區(qū).Ig的兩條長鏈稱為重鏈Heavy chain， H鏈，重鏈可分為： ，對應(yīng)的Ig的種類： IgM, IgG, IgA, IgD, IgE.Ig的兩條短鏈稱為輕鏈，可分為， ；每個Ig分子的兩條輕鏈完全一樣。.4. 多克隆抗體polyclo

5、nal antibody,PcAb：指由不同B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的針對抗原物質(zhì)中多種抗原決議簇的多種抗體混合物。如：免疫血清含多種特異性抗體。.5. 單克隆抗體monoclonal antibody，McAb：是由淋巴細(xì)胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對復(fù)合抗原分子上某一單個抗原決議簇的特異性抗體。6.細(xì)胞克?。河梢粋€細(xì)胞增殖而成的細(xì)胞群體。 克隆可以堅(jiān)持親本的絕大部分性狀。.8. 多克隆抗體和單克隆抗體的優(yōu)優(yōu)勢PcAbMcAb特異性低高均一性無有敏感性差強(qiáng)親和力親和力較強(qiáng)親和力不強(qiáng)成本、時(shí)間制備相對便宜，時(shí)間短成本高，時(shí)間長.雜交瘤技術(shù)根本原理. .制備流程交融在具有挑選作用的培育基中培育挑選出分泌抗體的細(xì)胞

6、，進(jìn)展克隆化SP2/0B細(xì)胞和SP2/0死亡.1. 抗原制備 不論是制備單抗還是多抗，抗原的設(shè)計(jì)與制備都是一個非常重要的問題，設(shè)計(jì)或者制備得不好的抗原有能夠完全不能免疫出抗體來。 1.1 一個良好的抗原必需具備的條件：1 分子量：普通是分子量越大，免疫原性越強(qiáng)，對于多肽或蛋白質(zhì)類的抗原來說，一個抗原決議簇又叫表位，epitope，通常由6-8個氨基酸殘基組成。而平均每5-10kD 才有一個表位，因此分子太小的多肽或蛋白是很難有一個表位的?？贵w制備過程及影響要素.2化學(xué)構(gòu)造與組成：構(gòu)造盡量復(fù)雜。簡單反復(fù)的物質(zhì)是不具有免疫原性的，拿明膠來說，它的分子量非常大，而且外源性也很強(qiáng)，但是組成明膠的氨基酸

7、多為直鏈氨基酸，在體內(nèi)容易被降解，因此它的免疫原性很弱。蛋白質(zhì)：a.氨基酸組成：含芳香族氨基酸特別是酪氨酸，免疫源性強(qiáng)。b.構(gòu)造：環(huán)狀的免疫原性強(qiáng)；直鏈，免疫原性弱。多糖：具有免疫原性，較蛋白質(zhì)弱。核酸：多無免疫原性。.3 外源性強(qiáng)。在個體構(gòu)成的早期就對本身物質(zhì)構(gòu)成了免疫耐受，因此假設(shè)和機(jī)體內(nèi)的物質(zhì)完全一樣或者是類似就很難引起機(jī)體的免疫應(yīng)對。4可降解性好。作為抗原，必需是可以降解的，塑料、不銹鋼等難降解的物質(zhì)免疫原也很弱。含L-氨基酸的蛋白質(zhì)易降解，具有免疫原性。但是由D-型氨基酸組成的物質(zhì)免疫原性很弱，同樣是由于機(jī)體不能降解D-氨基酸組成的蛋白或多肽。.2. 免疫方案2.1 動物的選擇：常見

8、的可以用來制備抗體的動物有：小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、綿羊、山羊、馬、驢、奶牛，還有用雞或者鴨的。需思索的問題：第一個問題是能否具有較好的免疫效果.第二個問題是抗血清產(chǎn)量的問題.2.2 免疫佐劑：先于免疫原或同時(shí)與抗原混合注射機(jī)體可加強(qiáng)抗原的免疫原性的物質(zhì)。1顆?？乖庖咝詮?qiáng)，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果，如細(xì)胞類抗原、電泳跑蛋白膠。2可溶性抗原免疫原性較弱，普通要加佐劑。油性佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑；無機(jī)化合物微生物及其產(chǎn)物脂質(zhì)體細(xì)胞因子.2.4 抗原與佐劑的乳化2.5 免疫途徑：1體內(nèi)免疫：皮下，腹腔，肌肉，靜脈等2體外免疫：較少。2.3 免疫劑量：根據(jù)免疫原、免疫途徑、免疫

9、動物、免疫佐劑有關(guān)。 普通的免疫劑量是微克級別。2.6 免疫時(shí)間間隔：普通間隔2-3個星期。.抗體產(chǎn)生的普通規(guī)律初次應(yīng)對：抗原初次進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生的應(yīng)對。特點(diǎn)：埋伏期誘導(dǎo)期長7-10天； 抗體的種類以IgM為主； 抗體的親和力低； 維持時(shí)間短； 總抗體程度低。.再次應(yīng)對：抗原再次進(jìn)入機(jī)體所產(chǎn)生的應(yīng)對。特點(diǎn)：埋伏期短約2-3天； 抗體的種類以IgG為主； 抗體的親和力比初期應(yīng)對明顯加強(qiáng)； 維持時(shí)間長； 總抗體程度高。.3. 免疫鼠血清的采集和檢測小鼠第三次免疫1 周后，免疫組對小鼠進(jìn)展眼球靜脈采血，搜集血清，血清交由檢測擔(dān)任人，該擔(dān)任人對血清進(jìn)展檢測。1免疫酶技術(shù)：ELISA，IPMA2免疫熒光技術(shù)

10、：IFA3間接血凝實(shí)驗(yàn)4放射免疫檢測 .4. 雜交瘤細(xì)胞株的建立 SP2/0的預(yù)備 豢養(yǎng)層細(xì)胞的制備 脾細(xì)胞B細(xì)胞的制備 脾細(xì)胞和SP2/0的交融 單克隆抗體的制備與鑒定雜交瘤的挑選 細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇 實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵！.4.1 試劑和耗材 4.1.1 試劑： DMEM 、 胎牛血清FBS、 HAT 、 HT 、 50%PEG ， 青、鏈霉素、生理鹽水;4.1.2 儀器：生物平安柜、二氧化碳培育箱、程度離心機(jī)、倒置顯微鏡； 工具：止血鉗，剪刀、直頭眼科鑷子、彎頭眼科鑷子.4.2 進(jìn)展細(xì)胞交融的前一天，預(yù)備豢養(yǎng)層細(xì)胞：8-10周齡BALB/c雌性小鼠;用注射器向腹腔內(nèi)注射DMEM，悄然揉壓小鼠腹膜，抽出

11、腹腔內(nèi)液體，搜集到一個 離心管中，反復(fù)操作3次左右;離心1000rpm ,5min ,棄上清，重懸細(xì)胞，鋪板密度2x105。實(shí)驗(yàn)流程4.2.2 預(yù)備豢養(yǎng)層細(xì)胞: 取靜止形狀的腹腔巨噬細(xì)胞4.2.1 骨髓瘤細(xì)胞SP2/0的培育：對數(shù)生長期.4.2.3 脾細(xì)胞B細(xì)胞的制備：交融前3天加強(qiáng)免疫小鼠1注射器反復(fù)吹打法2研磨法1生物方法：病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞交融2化學(xué)誘導(dǎo)：PEG誘導(dǎo) 50%PEG(10004000)3物理誘導(dǎo)：電交融4.2.4 脾細(xì)胞和SP2/0的交融：交融方法主要有以下幾種方法.細(xì)胞交融.交融過程中的本卷須知：1 SP2/0細(xì)胞和免疫脾細(xì)胞的數(shù)量比例適當(dāng)，1:5-1:10；2兩種細(xì)胞形狀要

12、好，洗吹細(xì)胞一定要輕柔；3PEG交融之后，加培育基中和時(shí)要緩慢，以免破壞交融的細(xì)胞。.雜交瘤細(xì)胞的挑選第一次挑選.5、陽性雜交瘤細(xì)胞的挑選第二次挑選：挑選時(shí)機(jī)的把握1免疫酶技術(shù)：ELISA運(yùn)用最多。.2免疫熒光技術(shù)：IFA3間接血凝實(shí)驗(yàn)4放射免疫檢測 5免疫印跡分析6免疫沉淀7免疫組化和功能中和實(shí)驗(yàn) 重要思索：“他的抗體用于什么就用什么去篩，挑選戰(zhàn)略必需可以反映所需抗體隨后的用途。.選擇挑選戰(zhàn)略時(shí)，必需求思索下面的要素：1可以處置多達(dá)1000個樣品約120ul/樣品的才干；248h內(nèi)可以完成鑒定的才干；3能否具備必要的試劑/設(shè)備；4反響的特異性；5實(shí)驗(yàn)體系的靈敏度；6最重要的能否能得到結(jié)果。挑

13、選時(shí)交融前的免疫血清作為陽性對照，這樣確保一切的技術(shù)、試劑、設(shè)備是最適宜的。同樣，用培育雜交瘤細(xì)胞的培育基作為陰性對照。.6、雜交瘤細(xì)胞的克隆化：指將抗體陽性孔進(jìn)展克隆化。目的是將抗體分泌細(xì)胞、抗體非分泌細(xì)胞、特異性抗體分泌細(xì)胞和無關(guān)抗體分泌細(xì)胞分開。6.1 克隆化的原那么：盡早進(jìn)展，普通要進(jìn)展2-3次克隆。6.3 克隆化的方法主要包括以下：克隆之前制備豢養(yǎng)細(xì)胞6.2.1有限稀釋法: 其原理是，將培育孔內(nèi)細(xì)胞用槍或吸管吹打使之懸浮，然后用計(jì)數(shù)板進(jìn)展計(jì)數(shù)，最后按每孔0.5-1個細(xì)胞的量將原孔細(xì)胞稀釋滴至新的培育板上事先制備好豢養(yǎng)層細(xì)胞，培育一段時(shí)間以后就可以看到部分孔有單個克隆構(gòu)成實(shí)際上講最終每

14、孔的細(xì)胞個數(shù)在整體上服從泊松分布 優(yōu)點(diǎn):a、最簡單的克隆化方法；b、不需求太多的儀器設(shè)備，操作也不復(fù)雜。 缺陷：a、由于計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確或者移液器的偏向，最終導(dǎo)致操作結(jié)果不理想； b、由于細(xì)胞經(jīng)過吹打的剪切力破壞，細(xì)胞也不一定可以按期望生長。.2半固體培育法: 原理和做分子克隆時(shí)的菌落挑選有點(diǎn)類似半固體培育原理和做分子克隆時(shí)的菌落挑選有點(diǎn)類似;其方法是將雜交瘤細(xì)胞與液體低融點(diǎn)的瓊脂糖或甲基化纖維素溶液混合，然后將其倒入含有事先制備的豢養(yǎng)層的培育板上，冷后后培育基呈固態(tài)，在37培育一段時(shí)間后，單個雜交瘤細(xì)胞會構(gòu)成類似菌落的小克隆，可以用槍頭將其挑出到培育板上在液體培育基里培育，這樣也可以實(shí)現(xiàn)克隆化。

15、優(yōu)點(diǎn)：a、操作比較直觀簡單， 缺陷：對半固體培育基的要求比較高，容易出現(xiàn)細(xì)胞不生長或者污染情況發(fā)生。3顯微操作法 把陽性孔里的細(xì)胞稀釋到足夠稀，靜置半小時(shí)后細(xì)胞會沉淀到孔底，然后在顯微鏡下用槍直接汲取一個單細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有豢養(yǎng)層細(xì)胞的孔內(nèi)培育即可。優(yōu)點(diǎn)：最初級、最直觀、最省腦力和人力的方法，步驟簡單。4熒光激活細(xì)胞分別法：流式細(xì)胞術(shù).7. 細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇及時(shí)對各階段陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)展凍存凍存步驟： 1吹下需凍存的細(xì)胞； 21000rpm 離心5 min，棄上清； 3用凍存液將細(xì)胞重懸，之后凍存； 4將細(xì)胞放入細(xì)胞凍存盒內(nèi)，然后將其直接放入-80冰箱 過夜不小于12h，之后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮中。.細(xì)

16、胞復(fù)蘇步驟：1從液氮中取出細(xì)胞，迅速置于37水浴鍋中融化細(xì)胞；-快！2直接將細(xì)胞參與瓶25cm2中，并參與含20% 胎牛血清的DMEM培育基貼壁培育,12小時(shí)后，充去上清，換入新穎培育基繼續(xù)培育。.8. 單克隆抗體的消費(fèi)8.1 在產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞分別、克隆并凍存建庫后，擴(kuò)增雜交瘤細(xì)胞可以消費(fèi)抗體。處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞培育上清可產(chǎn)生3-20ug/ml 的抗體。-抗體產(chǎn)量低8.2 目前單克隆抗體消費(fèi)包括腹水制備和細(xì)胞培育兩種方法。.8.2.1腹水制備流程：1提早7天，小鼠腹腔注射0.5ml石蠟油；2小心吹打細(xì)胞瓶底部，使細(xì)胞從瓶底零落，搜集細(xì)胞；3室溫1200r/min離心6 mi

17、n，棄上清；4用不完全培育液DMEM或生理鹽水按照0.5ml/只鼠懸浮細(xì)胞；5將細(xì)胞懸液注射到小鼠腹腔；67-10天后小鼠腹腔明顯鼓起后，采集腹水。.8.2.2 細(xì)胞培育消費(fèi)單抗：利用滾瓶、轉(zhuǎn)瓶和CELLine 瓶制備單抗。1在單克隆抗體的產(chǎn)量方面，滾瓶和轉(zhuǎn)瓶較普通的細(xì)胞培育瓶只需少許優(yōu)勢。2 CELLine ：膜式雙室技術(shù)的一種的體外細(xì)胞培育系統(tǒng)。 .9、單抗特性的檢測：9.1 抗體特異性：除用抗原進(jìn)展抗體檢測，還運(yùn)用與抗原成分相關(guān)的其他抗原進(jìn)展交叉實(shí)驗(yàn)，方法：ELISA等。9.2 單克隆抗體亞類的鑒定 商品化試劑盒9.3 Western Blot 分析9.4 抗體的中和活性9.5 抗體的親

18、和力9.6 抗體對應(yīng)抗原的分子量9.7 抗體的識別表位.10. 抗體純化 1初步純化鹽析法有機(jī)沉淀法凝膠過濾法2精細(xì)純化親和層析法離子交換層析法疏水層析法反向?qū)游龇?生物平安柜II級A2型生物平安柜最常用.生物平安程度與實(shí)驗(yàn)室類型世界通用生物平安程度規(guī)范是由美國疾病控制中心(CDC)和美國國家衛(wèi)生研討院(NIH)建立的。. 級生物平安柜是一種負(fù)壓過濾排風(fēng)柜。 防止操作者和環(huán)境暴露于實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的生物氣溶膠。1維護(hù)實(shí)驗(yàn)操作者在操作時(shí)，室內(nèi)空氣被抽入前面的格柵，產(chǎn)生一個空氣屏障，防止有生物危險(xiǎn)的懸浮微粒散入室內(nèi)。2維護(hù)實(shí)驗(yàn)樣品層流的、HEPA過濾的空氣向下，經(jīng)過任務(wù)面，防止室內(nèi)空氣進(jìn)入，防止樣品

19、存在交叉污染。3維護(hù)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境在空氣分開柜前，必需經(jīng)過一個排氣HEPA濾膜，確保排出柜體的氣流是干凈的，對環(huán)境無害。.細(xì)胞培育箱.倒置顯微鏡. 含血清的DMEM.96孔細(xì)胞板48孔細(xì)胞板24孔細(xì)胞板6孔細(xì)胞板.存在問題及處理方案1. 為什么免疫后沒有效價(jià)或免疫后效價(jià)低？1 設(shè)計(jì)的抗原與被免疫的動物內(nèi)源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質(zhì)。對于前一種情況應(yīng)該重新設(shè)計(jì)抗原，設(shè)計(jì)抗原時(shí)盡量選取目的蛋白特異性的序列，可以設(shè)計(jì)為短肽然后再與載體蛋白偶聯(lián)之后免疫；對于后一種情況，首先確認(rèn)抗原質(zhì)量能否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可思索改動抗原分子的部分構(gòu)造，或改良提

20、取方法；制備的免疫原能否符合要求，可從偶聯(lián)劑、載體、抗原與載體的銜接比例、 反響時(shí)間等多方面去思索，并加以改良；假設(shè)偶聯(lián)沒有問題，可以改換其它的載體蛋白，如 KLH 。.2 免疫的周期不正確。免疫周期過長或過短，各免疫步驟之間的間隔過長或過短都有能夠影響免疫效果。3免疫佐劑不適宜。弗氏佐劑也不能保證完全有效，TiterMax 等佐劑在免疫時(shí)，對于某些抗原能夠效果不佳，此時(shí)可以思索改換佐劑嘗試。4免疫劑量不合理。過大的免疫劑量能夠?qū)е旅庖吣褪埽^少的免疫劑量能夠無法激活免疫應(yīng)對。5免疫途徑不合理。6 測效價(jià)的過程存在錯誤操作，尤其思索包被能否勝利或二抗運(yùn)用能否正確。同時(shí)，一抗即血清稀釋梯度盡量放

21、寬，普通建議從1:500或1:1000開場作梯度稀釋。對于多肽和小分子物質(zhì)，效價(jià)到達(dá)1:2000甚至更低仍可視為免疫勝利。.7動物的豢養(yǎng)能否得當(dāng)，如營養(yǎng)飼料、飲水、環(huán)境衛(wèi)生通風(fēng)、采光、溫度能否符合要求，動物的安康情況能否良好等。 2. 為什么交融后細(xì)胞不長或者交融后克隆很少？ 1免疫用的動物品系不正確或者品系不純。免疫用的動物普通應(yīng)該與骨髓瘤來源的動物是一樣品系，例如運(yùn)用 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞時(shí)應(yīng)該選用 Balb/C 小鼠，同時(shí)必需運(yùn)用品系純粹的小鼠。2培育基中參與了過高濃度的 HAT，或者僅 A 的濃度過高或 HT 的濃度過低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作 HAT 濃度挑選。3培育基不正

22、確或血清濃度不正確或運(yùn)用了劣質(zhì)血清。4未正確制備豢養(yǎng)細(xì)胞。5接種雜交瘤細(xì)胞的培育板過多。普通在5-20塊96孔板為宜。.6 細(xì)胞被污染。在顯微鏡下仔細(xì)察看能否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應(yīng)該思索能否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測。7 細(xì)胞培育條件不正確。確保細(xì)胞培育在恒定的37較濕的環(huán)境，同時(shí)保證 CO2濃度在4-5%左右。8其它與交融條件相關(guān)的不恰當(dāng)?shù)囊亍?3. 為什么交融后得不到陽性克隆？ 1動物不免疫勝利就進(jìn)展了交融。 2 交融后得到的克隆較少，故得到陽性克隆的機(jī)率也較小。 3挑選克隆手段不正確。例如有些小分子物質(zhì)不可以直接包被到酶標(biāo)板上，再如運(yùn)用了不適當(dāng)?shù)?/p>

23、二抗等諸多要素，也有人直接不運(yùn)用 ELISA 作為挑選方法的，勝利率也有待商榷。4抗原成份與細(xì)胞培育條件中的物質(zhì)一樣或類似，或者與挑選過程中有同抗 原構(gòu)造一樣或類似的物質(zhì)產(chǎn)生了競爭反響。假設(shè)需求制備抗 BSA 的單抗，那么養(yǎng)雜交瘤的培育基中不可以運(yùn)用牛血清，否那么牛血清中的 BSA 直接與抗體相結(jié)合，最后做 ELISA 挑選的時(shí)候無法得到陽性結(jié)果。處理的方法只需運(yùn)用其它的動物的血清或者運(yùn)用無血清培育基。再如，假設(shè)需求制備酪蛋白的單抗，那么做 ELISA 挑選時(shí)，二抗的稀釋液不可以運(yùn)用脫脂奶粉。5 其它一切能影響 ELISA 等相關(guān)挑選手段的要素。.4 . 為什么細(xì)胞生長很慢？1運(yùn)用了劣質(zhì)的培育

24、耗材、培育基、血清、HAT 或 HT。建議新手運(yùn)用知名廠商的試劑或耗材。對于血清，能夠需求從多個廠家選用多個批次試用，選擇出比較好的批次進(jìn)展實(shí)驗(yàn)。在試用血清的時(shí)候，普通可以運(yùn)用相對較低濃度的血清進(jìn)展骨髓瘤細(xì)胞培育實(shí)驗(yàn)，根據(jù)骨髓瘤細(xì)胞的倍增速度確實(shí)血清質(zhì)量。2運(yùn)用的血清或培育基濃度不正確。仔細(xì)檢查配方能否正確。3制備豢養(yǎng)細(xì)胞的方法不正確。.5. 克隆原來檢測是陽性的，為什么后來轉(zhuǎn)為陰性了？ 首先要留意的是，正常情況下，雜交瘤也不是絕對穩(wěn)定的，確實(shí)容易發(fā)生染色體喪失的情況，尤其是當(dāng)細(xì)胞移到新環(huán)境中生長，如從小孔擴(kuò)展到大孔，或者復(fù)蘇操作時(shí)，更容易發(fā)生陽性變?yōu)殛幮浴５且灿幸恍┓椒ūM量減少陽性變?yōu)殛幮?/p>

25、，普通可以從這幾個方面加以留意：1永遠(yuǎn)保證細(xì)胞處在最正確的生長環(huán)境中。尤其是培育基不能長期不換，普通來說，當(dāng)細(xì)胞增長到一定密度的時(shí)候，培育基就開場變顏色，這個時(shí)候就要預(yù)備換培育基了。除了換培育基，同時(shí)應(yīng)該控制好細(xì)胞的密度，可以吹走過多的細(xì)胞，使新參與的培育基不至于很快被耗費(fèi)。2對于重要的細(xì)胞株，每一步都把陽性的細(xì)胞保種。3不要過于頻繁操作細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長密度不是很大的時(shí)候，不要頻繁操作，否那么細(xì)胞容易出現(xiàn)死亡或者生長形狀發(fā)生明顯變化。.4 對于傳代次數(shù)較多的細(xì)胞株需求經(jīng)常進(jìn)展亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。5當(dāng)細(xì)胞被支原體等微生物污染，也會發(fā)生由陽性轉(zhuǎn)為陰性的情況。6. 為什么亞克隆后長

26、不出克隆來？1亞克隆時(shí)，原始孔里的細(xì)胞形狀不好，經(jīng)過有限稀釋或其它手段亞克隆的細(xì)胞活性很差，以致于長不出克隆。2亞克隆時(shí)，沒有按照正確的數(shù)量取出細(xì)胞，亞克隆的過程服從泊松分布，假設(shè)取出的細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個細(xì)胞，或有效細(xì)胞遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均每孔一個細(xì)胞，那么也能夠出現(xiàn)長不出克隆的結(jié)果。3未添加豢養(yǎng)細(xì)胞。單個細(xì)胞在完全培育基中極難培育，假設(shè)不添加豢養(yǎng)細(xì)胞，那么它們很能夠很快就死亡，最終就長不出克隆。.4 運(yùn)用的 HAT 中 HT 失效或 A 的濃度過高，或者未添加 HT。 雖然 HT 對雜交瘤的生長并不是必需的，但是 HT 確實(shí)可以加快細(xì)胞生長，改善細(xì)胞生長形狀。 5運(yùn)用無血清培育基。這一點(diǎn)是很冷

27、僻的一個要素。雖然很少有人運(yùn)用無血清培育基制備單抗，但是在某些血清能夠干涉挑選步驟的實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，能夠會選用無血清培育基來培育雜交瘤，但是需求留意的是，在很多種無血清培育基中，單個細(xì)胞是很難長成克隆的。最好的處理方法就是先用含有血清的培育基培育它們，等克隆長出后再把培育基徹底改換為無血清培育基。.7. 為什么凍存的細(xì)胞很難復(fù)蘇或者復(fù)蘇不活？這個問題要從兩個方面來回答，一是凍存方面，二是復(fù)蘇問題。7.1 對于凍存過程，需求留意：1 凍存液的配方。這個問題很關(guān)鍵，一個良好的凍存液配方可以使細(xì)胞保管得非常好，而一個不好的凍存液配方能夠會讓細(xì)胞傾刻死亡。凍存維護(hù)劑 DMSO的含量非常重要，假設(shè)這個濃度過

28、低，那么起不到維護(hù)作用，凍存的細(xì)胞最終會死于冰晶構(gòu)成時(shí)的張力，假設(shè)濃度過高，那么細(xì)胞中毒而亡。2凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細(xì)胞的時(shí)候更是要輕柔，由于在 DMSO 存在的條件下，細(xì)胞膜變得非常脆弱，假設(shè)用力過猛，那么細(xì)胞膜很容易破，復(fù)蘇成活的時(shí)機(jī)就明顯會下降。3凍存的程序也非常重要。實(shí)際闡明，以每分鐘1的速度下降凍存細(xì)胞是最理想的。.5 保證被凍存的細(xì)胞處于良好的生長形狀，并且沒有被污染。4假設(shè)條件簡易，可以把細(xì)胞放在4半小時(shí)左右，然后再在-20放置1小時(shí)，最后轉(zhuǎn)入-80放置過夜，最終轉(zhuǎn)入液氮保管。需求短期保管的，直接放-80也行。如今有細(xì)胞凍存盒，把需求存放的細(xì)胞放進(jìn)去，然后直接

29、放-80就行，等時(shí)間夠長后直接轉(zhuǎn)至液氮中即可。.7.2 對于復(fù)蘇過程，需求留意：1快速融化。為了防止升溫中細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，劇烈建議加快融化過程。普通都要用足夠體積的 37熱水復(fù)蘇，并不斷晃動凍存管。2 復(fù)蘇過程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否那么熱水有能夠污染管口，呵斥復(fù)蘇的細(xì)胞被污染。3 假設(shè)復(fù)蘇細(xì)胞時(shí)，沒有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DMSO 帶到了新的培育體系里，容易對細(xì)胞呵斥毒害，所以對于貼壁細(xì)胞貼壁后換液或者細(xì)胞離心后去掉凍存液，然后用新的完全培育基重懸，再接種到新的容器內(nèi)培育。.8. 單克隆抗體制備細(xì)胞實(shí)驗(yàn)最棘手的問題-細(xì)胞污染細(xì)胞培育污染是指培育環(huán)境中侵入了對細(xì)胞

30、生存有害的成分和呵斥細(xì)胞變異的異物。細(xì)胞培育污染可分為以下三類: 物理性、化學(xué)性及生物性。 8.1 物理性污染的來源、危害及預(yù)防 物理性污染經(jīng)過影響細(xì)胞培育體系中的生化成分, 從而影響細(xì)胞的代謝。1培育環(huán)境中的物理要素，如溫度、放射線、振動、輻射( 紫外線或熒光) 會對細(xì)胞產(chǎn)生影響。2細(xì)胞、培育液或其它培育試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中， 可以引起細(xì)胞代謝發(fā)生改動, 如細(xì)胞同步化、細(xì)胞生長受抑制甚至細(xì)胞死亡。.3防備措施：經(jīng)過實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)計(jì)及建立規(guī)范的操作規(guī)程， 可以減少環(huán)境中物理要素對細(xì)胞的影響。培育箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機(jī)械振動的設(shè)備，如離心機(jī)。培育液及

31、培育試劑應(yīng)放在固定的位置，為防止光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培育液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時(shí)間后再進(jìn)展實(shí)驗(yàn)，以防止過冷的溫度對細(xì)胞的影響。.8.2 化學(xué)性污染的來源、危害及預(yù)防 培育環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染?；瘜W(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長， 某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細(xì)胞的生長。不同細(xì)胞對化學(xué)物質(zhì)污染的反響是不一樣的。 未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲存試劑的容器都能夠成為化學(xué)性污染的來源。 細(xì)胞培育的必需營養(yǎng)，如氨基酸，假設(shè)濃度超越了適宜的范圍，也會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細(xì)胞系其最正確培育條件下對血清和緩沖液的要求是不一樣的，

32、在培育中應(yīng)嚴(yán)厲控制。 玻璃制品清洗過程中殘留的變性劑或肥皂( 通常殘留在瓶蓋的內(nèi)外表) 是最常見的化學(xué)性污染。.8.2.1 水 水是獨(dú)一一種在凝固時(shí)膨脹的化合物。因此在選擇凍存細(xì)胞的容器時(shí)應(yīng)思索到這個要素。容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要緣由。為了防止金屬離子、有機(jī)分子、細(xì)胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對水的污染，在配制液體，清洗容器時(shí)必需運(yùn)用不含雜質(zhì)的超純水。需求留意的是, 超純水放置過久其純度會下降。 在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時(shí)水經(jīng)常被污染， 由于高壓蒸氣鍋及純水機(jī)的常規(guī)維護(hù)后能夠有少量的化學(xué)物質(zhì)殘留。為了保證水的純度, 我們應(yīng)采取措施盡量防止化學(xué)物質(zhì)的殘留。.8.2.2 血清 動物血清是細(xì)胞培

33、育中常用的天然培育基, 但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來源。 由于血清采集于多個動物, 而且不同廠商的消費(fèi)工藝及質(zhì)量各不一樣, 因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對不同細(xì)胞的促生長才干及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功能、組織來源及培養(yǎng)基的成分等要素。在進(jìn)展一系列實(shí)驗(yàn)時(shí), 為了保證明驗(yàn)的可反復(fù)性, 最好選用同一批次的血清。.8.3.3 培育液、培育附加成分、試劑 培育液、培育附加成分、試劑都能夠成為化學(xué)性污染的來源。細(xì)胞培育運(yùn)用的一切物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并經(jīng)過權(quán)威機(jī)構(gòu)的鑒定，實(shí)驗(yàn)者本人也應(yīng)對上述成分進(jìn)展純度鑒定。同時(shí), 正確配置和儲存培育液及試劑也非常重要的, 應(yīng)該采取規(guī)范的操作步驟

34、，防止液體體積計(jì)算錯誤, 混用類似化合物等錯誤。.8.3.4 培育器皿及容器 細(xì)胞培育過程中會運(yùn)用到各種不同的培育器皿及容器。培育器皿的大小,構(gòu)形設(shè)計(jì)能夠會影響到培育中氣體交換、濕度、培育液的 pH 值和細(xì)胞生長密度。培育器皿的工藝及滅菌過程中的差別能夠?qū)ε嘤w系產(chǎn)生影響。塑料制品在消費(fèi)過程中能夠殘留一些有毒成形劑，消費(fèi)工藝的不同能夠引起器皿外表附著才干的不同。儲存不同物質(zhì)時(shí)應(yīng)選用適宜的塑料或玻璃容器，由于酒精、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿可以溶解塑料或玻璃的某些成分。.8.3 生物性污染的來源、危害及預(yù)防 外界的微生物如昆蟲、節(jié)肢動物、原蟲、霉菌、病毒、細(xì)菌、無細(xì)胞壁的微生物( 通常指支原體) 和其它類型的細(xì)

35、胞都能夠侵入培育環(huán)境引起污染。只需在一個開放的環(huán)境中進(jìn)展培育, 都難以防止發(fā)生污染。.8.3.1 細(xì)菌污染細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培育中常見的污染，即使在細(xì)胞培育液中參與了抗菌素(普通為預(yù)防劑量)，也能夠由于操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培育細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會出現(xiàn)培育液變混濁，pH改動。也有的培育液肉眼察看無多少改動，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細(xì)察看。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改動，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓零落死亡，呵斥實(shí)驗(yàn)失敗和細(xì)胞株(系)喪失。.8.3.2 真菌污染真菌污染是細(xì)胞培育過程中最

36、常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進(jìn)展細(xì)胞培育更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培育細(xì)胞受真菌污染后，可見培育液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長，培育液普通不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細(xì)胞之間或培育基中，有的呈鏈狀陳列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間。個體細(xì)小，有增多趨勢。鏡下看時(shí)，要將培育瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細(xì)胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞零落死亡。.8.3.3 支原體污染支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的最小微生物，最小直徑0

37、.2m，普經(jīng)過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形狀構(gòu)造。開場不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.68.0)下生存，對青霉素有抗藥性，多吸附于細(xì)胞外表或散在于細(xì)胞之間。電鏡下可見其有三層構(gòu)造，無細(xì)胞壁，中央有電子密度大的密集顆粒或絲狀的中心囊。培育細(xì)胞受支原體污染后，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁零落。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化，或略有變化，假設(shè)不及時(shí)處置，還會產(chǎn)生交叉污染。.8.3.4 病毒污染采用組織細(xì)胞培育法消費(fèi)疫苗，假設(shè)沒有除去潛在病毒的組織培育物，會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細(xì)胞的培育中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。雖然病毒污染的細(xì)胞不影響原代培育，但消費(fèi)疫

38、苗是不平安的。假設(shè)二倍體細(xì)胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細(xì)胞含EB病毒，細(xì)胞和會發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，構(gòu)成異倍體的細(xì)胞系。因此潛在病毒是細(xì)胞大量消費(fèi)和疫苗、干擾素等生物制品制造中的難題。.8.3.5 非同種細(xì)胞污染由于細(xì)胞培育操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)厲分開，操作不當(dāng)，往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。如“靈長類細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細(xì)胞的混合物，ERK/KD細(xì)胞是從兔腎中分別出來的，而如今句卻以為是HeLa細(xì)胞。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效。非細(xì)胞培育物所呵斥的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培育所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物

39、質(zhì)所致。.預(yù)防措施：1在進(jìn)展多種細(xì)胞培育操作時(shí)，所用器具要嚴(yán)厲區(qū)分，最好做上標(biāo)志便 于區(qū)分。并按順序進(jìn)展操作，防止一同進(jìn)展時(shí)易發(fā)生混亂。2在進(jìn)展換液或傳代操作時(shí)，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培育瓶瓶口，以 免把細(xì)胞帶到培育液中污染其他細(xì)胞。3一切細(xì)胞一旦購置，或從別處引入，或本人建立，均應(yīng)及早留種凍存，一 旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培育。.9.單克隆抗面子臨的問題9.1 如何進(jìn)一步縮短單抗研發(fā)周期,降低消費(fèi)本錢 傳統(tǒng)方法制備單克隆抗體包括抗原制備、動物免疫、抗體檢測方法的建立、細(xì)胞交融、雜交瘤細(xì)胞的挑選、亞克隆、凍存復(fù)蘇、雜交瘤細(xì)胞及單克隆抗體特性的鑒定及單克隆抗體的大量消費(fèi)等一系列復(fù)雜步驟，普通

40、要破費(fèi)6個月以上的時(shí)間，研發(fā)周期較長。同時(shí)每只小鼠自始自終只能免疫一種純化抗原，將這種免疫小鼠的脾臟B淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)展交融后，構(gòu)成的雜交瘤細(xì)胞也只能分泌針對這一種純化抗原的單一單克隆抗體，任務(wù)效率低,消費(fèi)本錢高。因此，如何利用分子生物學(xué)技術(shù)，抑制現(xiàn)有消費(fèi)技術(shù)的局限性,縮短單抗研發(fā)周期，降低消費(fèi)本錢，建立消費(fèi)雜交瘤細(xì)胞株的高效方法，是當(dāng)前需 處理的問題。.9.2 如何進(jìn)一步提高體外用單抗的質(zhì)量 研制高親和性單抗是免疫化學(xué)技術(shù)的重要開展方向之一，將會進(jìn)一步提高單克隆抗體在微量分析領(lǐng)域內(nèi)的運(yùn)用。同時(shí)，隨著單抗在診斷與治療中運(yùn)用的快速開展，對單抗種類及數(shù)量的需求越來越多,如何進(jìn)展大規(guī)模的消費(fèi)也

41、已成為抗體純化的主要問題。另外，單克隆抗體對抗原的識別,與多克隆抗體有很大的不同。不同試劑盒因運(yùn)用的單克隆抗體不同,識別抗原的位點(diǎn)不同，導(dǎo)致檢測結(jié)果有一定差別。因此,體外用單抗規(guī)范化問題還需求進(jìn)一步研討。.9.3 如何進(jìn)一步提高治療用單抗的質(zhì)量 如何進(jìn)一步降低單抗藥物的免疫原性，提高單抗藥物在腫瘤組織的濃度是研制治療用單抗的開展方向。.一、鼠源性單克隆抗體開展歷程.二、人源化抗體1. 概念：是指抗體的可變區(qū)部分即Vh和Vl區(qū)或抗體一切全部由人類抗體基因所編碼。 2. 人源化抗體包括嵌合抗體、改型抗體、外表重塑 抗體和全人源化抗體等。.2.1 嵌合抗體1概念：是利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕

42、、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞表達(dá)出嵌合抗體，這樣表達(dá)的抗體分子中輕重鏈的V區(qū)是異源的，而C區(qū)是人源的，這樣整個抗體分子的近2/3部分都是人源的。2特點(diǎn)：減少了鼠源性抗體的免疫原性；保管了親本抗體特異性結(jié)合抗原的才干。.2.2 改型抗體1概念：改型抗體也稱CDR植入抗體(CDR grafting antibody)，抗體可變區(qū)的CDR是抗體識別和結(jié)合抗原的區(qū)域，直接決議抗體的特異性。將鼠源單抗的CDR移植至人源抗體可變區(qū)，替代人源抗體CDR，使人源抗體獲得鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性，同時(shí)減少其異源性。.2.3 外表重塑抗體 1概念：外表重塑抗體是指對異源抗體外

43、表氨基酸殘基進(jìn)展人源化改造。該方法的原那么是僅交換與人抗體SAR差別明顯的區(qū)域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性根底上選用與人抗體外表殘基類似的氨基酸交換。.2.4 全人源化抗體 1概念：是指將人類抗體基因經(jīng)過轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)，將人類編碼抗體的基因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達(dá)人類抗體，到達(dá)抗體全人源化的目的。 .三 、小分子抗體 完好抗體分子具有體積大相對分子質(zhì)量約為150103、組織穿透才干差等缺乏，促進(jìn)了抗體分子的小型化。小分子抗體具有組織穿透才干強(qiáng)、免疫原性弱、構(gòu)造穩(wěn)定、制備簡單和表達(dá)效率高等優(yōu)點(diǎn)，是基因工程中制備人源單抗的主要產(chǎn)物，目前小分子抗體主要用于放射免疫顯像或治療等方面。其缺陷是與抗原的結(jié)合力弱、半衰期短等。 小分子抗體主要包括：單價(jià)小分子抗體，如Fab 片段、Fv 片段最小識別單位等；多價(jià)小分子抗體，如雙鏈、三鏈抗體等；納米抗體，即只需一個重鏈可變區(qū)組成的單域抗體，其相對分子質(zhì)量只需單克隆