基因編輯技術(shù)精選

1、基因(jyn)編輯技術(shù)共四十二頁(yè)什么是基因編輯(binj)技術(shù)？基因編輯是指對(duì)基因組進(jìn)行定點(diǎn)修飾(xish)的一項(xiàng)新技術(shù)。利用該技術(shù)，可以精確地定位到基因組的某一位點(diǎn)上， 在這位點(diǎn)上剪斷靶標(biāo) DNA 片段并插入新的基因片段。此過(guò)程既模擬了基因的自然突變， 又修改并編輯了原有的基因組， 真正達(dá)成了“編輯基因” 。共四十二頁(yè)基因(jyn)編輯的研究背景傳統(tǒng)的動(dòng)物育種方法受到種源的限制，其程需要(xyo)耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，經(jīng)歷漫長(zhǎng)的培育過(guò)程。而且不同種間的雜交很困難，育種成果很難取得突破性進(jìn)展。 共四十二頁(yè)基因編輯的研究(ynji)背景現(xiàn)代動(dòng)物分子育種中，分子標(biāo)記技術(shù)能夠定位與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)

2、的分子標(biāo)記，鎖定基因與性狀的對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而快捷可靠地對(duì)動(dòng)物后代進(jìn)行篩選。但是，利用分子標(biāo)記技術(shù)輔助篩選，改良的程度(chngd)依然受限于品種自身已有的基因。所以，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行品種改良，可以突破種源的限制及種間雜交的瓶頸，獲取新品種，因此分子育種更為本質(zhì)和直接。共四十二頁(yè)基因編輯的研究(ynji)背景目前，獲得突變體的常見(jiàn)方法是利用T- DNA 或轉(zhuǎn)座子構(gòu)建(u jin)大規(guī)模的隨機(jī)插入突變體庫(kù)， 但是構(gòu)建(u jin)覆蓋全基因組的飽和突變體庫(kù)需要的工作量大且耗費(fèi)的時(shí)間長(zhǎng)。而通過(guò)定點(diǎn)突變的方法使目的基因完全失活，是一種最直接有效的研究特定基因功能的方法。共四十二頁(yè)基因編輯(binj)

3、的研究背景近年來(lái)，隨著高特異性及更具操作性的人工(rngng)核酸酶的出現(xiàn)和技術(shù)體系的完善，基因組編輯技術(shù)獲得了飛速發(fā)展，并將靶向基因操作推向高潮，使得定點(diǎn)基因敲除、敲入變得更為簡(jiǎn)單且高效。共四十二頁(yè)基因編輯(binj)的優(yōu)勢(shì)與傳統(tǒng)的以同源重組和胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)技術(shù)為基礎(chǔ)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯新技術(shù)保留了可定點(diǎn)修飾的特點(diǎn)，可應(yīng)用到更多的物種上，效率更高，構(gòu)建(u jin)時(shí)間更短，成本更低。共四十二頁(yè)基因(jyn)編輯原理現(xiàn)代基因組編輯技術(shù)的基本原理是相同的，即借助(jizh)特異性 DNA 雙鏈斷裂( DNA double-strand bre

4、aks DSBs) 激活細(xì)胞天然的修復(fù)機(jī)制，包括非同源末端連接( NHEJ)和同源重組修復(fù)(HDR) 兩條途徑。共四十二頁(yè)基因(jyn)編輯原理非同源末端連接（NHEJ ）是一種低保真度的修復(fù)過(guò)程，斷裂的DNA 修復(fù)重連的過(guò)程中會(huì)發(fā)生(fshng)堿基隨機(jī)的插入或丟失，造成移碼突變使基因失活,實(shí)現(xiàn)目的基因敲除。如果一個(gè)外源性供體基因序列存在，NHEJ 機(jī)制會(huì)將其連入雙鏈斷裂DSB 位點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)的基因敲入。共四十二頁(yè)基因(jyn)編輯原理同源重組修復(fù)（HR） 是一種相對(duì)高保真度的修復(fù)過(guò)程，在一個(gè)帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會(huì)通過(guò)同源重組過(guò)程完整的整合到靶位點(diǎn)，不會(huì)

5、出現(xiàn)隨機(jī)的堿基插入或丟失。如果(rgu)在一個(gè)基因兩側(cè)同時(shí)產(chǎn)生DSB，在一個(gè)同源供體存在的情況下，可以進(jìn)行原基因的替換。共四十二頁(yè)基因(jyn)編輯原理共四十二頁(yè)基因(jyn)編輯技術(shù)的種類目前主要有 3 種基因編輯技術(shù)， 分別(fnbi)為：人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)技術(shù)；轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases，TALEN)技術(shù)； RNA 引導(dǎo)的 CRISPR- Cas 核酸酶技術(shù)(CRISPR- Cas RGNs)。共四十二頁(yè)1. ZFN 基因組編輯

6、(binj)技術(shù)ZFN 技術(shù)是第一代基因組編輯技術(shù)，其功能的實(shí)現(xiàn)是基于具有獨(dú)特的DNA序列識(shí)別的鋅指蛋白發(fā)展起來(lái)的。1986年Diakun 等首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子家族的 DNA 結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2- His2鋅指模塊(m kui)，到1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對(duì)由4個(gè)鋅指連接而成的ZFN可識(shí)別24 bp的特異性序列，由此揭開(kāi)了ZFN在基因組編輯中的應(yīng)用。共四十二頁(yè)ZFN 由鋅指蛋白(ZFP)和 Fok核酸內(nèi)切酶組成。其中，由 ZFP 構(gòu)成的 DNA 識(shí)別(shbi)域能識(shí)別(shbi)特異位點(diǎn)并與之結(jié)合，而由Fok構(gòu)成的切割域能

7、執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點(diǎn)的雙鏈DNA 斷裂(DSB)。于是， 細(xì)胞可以通過(guò)同源重組(HR)修復(fù)機(jī)制和非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)機(jī)制來(lái)修復(fù) DNA。HR 修復(fù)有可能會(huì)對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修飾，而 NHEJ 修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達(dá)到基因敲除的目的。共四十二頁(yè)ZFN 誘導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基因位點(diǎn)，具有較好的發(fā)展?jié)摿?。但是目前?3 個(gè)方面的缺陷制約了該技術(shù)的推廣:(1)以現(xiàn)有的策略設(shè)計(jì)高親和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和時(shí)間;(2)在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá) ZFN 對(duì)細(xì)胞有毒性;(3)雖然三聯(lián)體設(shè)計(jì)具有一定特異性，但仍然存在

8、不同程度的脫靶(tu b)效應(yīng)。共四十二頁(yè)2. TALEN 基因組編輯(binj)技術(shù)2009 年，研究者在植物(zhw)病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子，它的蛋白核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有較恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。隨后，TALE特異識(shí)別 DNA 序列的特性被用來(lái)取代 ZFN技術(shù)中的鋅指蛋白。它可設(shè)計(jì)性更強(qiáng)，不受上下游序列影響，具備比ZFN 更廣闊的應(yīng)用潛力。共四十二頁(yè)TALENs 包含兩個(gè) TALEN 蛋白(dnbi), 每個(gè) TALEN 都是由 TALE array 與 Fok融合而成. 其中一個(gè) TALEN 靶向正義鏈上靶標(biāo)位點(diǎn), 另一個(gè)則

9、靶向反義鏈上的靶標(biāo)位點(diǎn). 然后 Fok形成二聚體, 在靶向序列中間的 spacer 處切割 DNA, 造成雙鏈 DNA 斷裂, 隨后細(xì)胞啟動(dòng) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制. 針對(duì)不同的TALEN 骨架, 其最適宜的spacer長(zhǎng)度不同, 其長(zhǎng)度范圍一般為1220 bp. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, TALENs在靶向DNA時(shí), 第一個(gè)堿基為 T 時(shí)其結(jié)合效果更佳。共四十二頁(yè)目前， TALEN 已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、 哺乳動(dòng)物和植物的位點(diǎn)特異性基因打靶， 與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)， 但仍然有些問(wèn)題需要解決，例如:脫靶效應(yīng)、TALEN 與基因組進(jìn)行特異結(jié)合與染色體位置及鄰近(ln jn)序列有關(guān)等。共四十二

10、頁(yè)3. CRISPR /Cas9 基因組編輯(binj)技術(shù)1987年，Ishino 等在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在(cnzi)于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中。經(jīng)過(guò)幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復(fù)序列與細(xì)菌獲得性免疫的關(guān)系。共四十二頁(yè)在這個(gè)系統(tǒng)中，只憑借一段 RNA 便能識(shí)別外來(lái)基因并將其降解的功能蛋白引起了研究者的興趣(xngq)。直到2012 年，Jinek 等第一次在體外系統(tǒng)中CRISPR/Cas9 為一種可編輯的短RNA 介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，標(biāo)志著 CRISPR /Cas9 基因組編輯技術(shù)成功問(wèn)世。3. CRISPR

11、 /Cas9 基因組編輯(binj)技術(shù)共四十二頁(yè)CRISPR/Cas 系統(tǒng)由 Cas9 核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成. 轉(zhuǎn)錄的 sgRNA 折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與 Cas9 蛋白(dnbi)形成復(fù)合體, 指導(dǎo) Cas9 核酸內(nèi)切酶識(shí)別特定靶標(biāo)位點(diǎn), 在 PAM 序列上游處切割 DNA 造成雙鏈 DNA 斷裂, 并啟動(dòng) DNA 損傷修復(fù)機(jī)制. 從不同菌種中分離的 CRISPR/Cas 系統(tǒng), 其 CrRNA(或者是人工構(gòu)建的sgRNA)靶向序列的長(zhǎng)度不同, PAM 序列也可能不同。共四十二頁(yè)三種(sn zhn)不同技術(shù)的比較共四十二頁(yè)續(xù)表共四十二頁(yè)基因(jyn)編輯新技術(shù)的用途基因功能研究基因

12、治療構(gòu)建模式動(dòng)物改造(gizo)和培育新品種共四十二頁(yè)1. 基因(jyn)功能研究基因敲除是在活體動(dòng)物上驗(yàn)證基因功能必不可少的邏輯環(huán)節(jié)， 但是傳統(tǒng)的基因敲除方法需要通過(guò)復(fù)雜的打靶(d b)載體構(gòu)建、 ES 細(xì)胞篩選、 嵌合體動(dòng)物模型選育等一系列步驟， 成功率受到多方面因素的限制。共四十二頁(yè)1. 基因功能研究(ynji)即使對(duì)于技術(shù)比較成熟的實(shí)驗(yàn)室， 利用傳統(tǒng)(chuntng)技術(shù)敲除大鼠或小鼠身上的某個(gè)基因一般也需要 1 年以上?；蚓庉嬓录夹g(shù)則不然， 敲除基因高效快速， 是研究基因功能的有力工具。共四十二頁(yè)1. 基因功能研究(ynji)ZFN 技術(shù)已在大鼠、小鼠、斑馬魚(yú)、果蠅、擬南芥、玉米、

13、煙草 等模式生物或經(jīng)濟(jì)物種的細(xì)胞或胚胎中以及包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)在內(nèi)的人體外培養(yǎng)細(xì)胞系中成功地實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源基因的定點(diǎn)突變(tbin)，其中在果蠅、 斑馬魚(yú)、大鼠等物種中還獲得了可以穩(wěn)定遺傳的突變體。共四十二頁(yè)1. 基因功能研究(ynji)2009 年， 威斯康辛醫(yī)學(xué)院、 Sangamo Biosciences、 Sigma- Aldrich 等多家機(jī)構(gòu)(jgu)使用 ZFN 技術(shù)，成功培育出首只靶基因敲除的大鼠，而且?guī)в性撏蛔兊拇笫笏暮蟠瑯訋в性摶蛲蛔?。共四十二?yè)2. 基因治療傳統(tǒng)的基因治療是將正常的基因片段引入細(xì)

14、胞中替代有缺陷(quxin)的基因， 但這種方法難以精準(zhǔn)控制， 可能產(chǎn)生很大的毒副作用。基因編輯新技術(shù)可以精確定位， 在靶位點(diǎn)進(jìn)行修正或進(jìn)行基因切除， 達(dá)到基因治療的目的。共四十二頁(yè)2. 基因治療Bacman 等人利用 TALEN 技術(shù)清除了來(lái)自于病人線粒體內(nèi)的有病 DNA。這是 TALEN 首次應(yīng)用于線粒體基因的編輯，這項(xiàng)研究有望用于治療(zhlio)母系遺傳的線粒體病。共四十二頁(yè)2. 基因治療Li 等人利用 ZFN 技術(shù)能在染色體上精確定位的優(yōu)勢(shì)， 通過(guò) “剪切” 和 “粘貼(zhnti)” 基因， 在實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了血友病治療， 避免了傳統(tǒng)基因療法帶來(lái)的插入誘變風(fēng)險(xiǎn)， 首次取得了基因組

15、編輯在基因療法上的突破。共四十二頁(yè)3. 構(gòu)建模式(msh)動(dòng)物根據(jù)人類疾病所構(gòu)建的動(dòng)物模型，對(duì)研究這些疾病的發(fā)生及其治療有著重要意義?；虼虬屑夹g(shù)是在 ES 和同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)(q li)的，模型構(gòu)建耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，且模式動(dòng)物的選擇受到 ES 細(xì)胞的限制。共四十二頁(yè)基因編輯新技術(shù)不受 ES 細(xì)胞(xbo)的限制，效率高，速度快，且定點(diǎn)編輯更加精確，可在多種細(xì)胞(xbo)及生物體的特定位點(diǎn)進(jìn)行切割和修飾。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠第一人 Jaenisch 與其同事最近利用 CRISPR- Cas 系統(tǒng)又構(gòu)建了攜帶特異性突變的小鼠模型。3. 構(gòu)建(u jin)模式動(dòng)物共四十二頁(yè)4. 改造(gizo

16、)和培育新品種傳統(tǒng)的改造動(dòng)植物品種的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將外源 DNA 片段插入受體的基因組中，改造基因功能，使其表達(dá)優(yōu)良的性狀，獲得人類需要的品種。基因編輯技術(shù)則可以(ky)進(jìn)行定點(diǎn)修飾， 達(dá)到高效定向。共四十二頁(yè)Shukla 等對(duì)玉米進(jìn)行肌醇磷酸激酶 1(inositol phosphate kinase 1，IPK1)基因的修飾，使其對(duì)除草劑的耐性增強(qiáng)，在發(fā)育的種子中肌醇磷酸鹽表達(dá)譜也發(fā)生了與預(yù)期一樣的改變(gibin)。Townsend等以煙草中的丙酮醇合酶(acetolactate synthase)基因 SuR (SuRA和SuRB)位點(diǎn)為靶標(biāo)，育成了對(duì)咪唑啉酮(imidazolinone

17、)除草劑和對(duì)磺脲(sulphonylurea)除草劑都有抵抗力的新品種。共四十二頁(yè)基因編輯(binj)的不足基因編輯是一項(xiàng)新技術(shù)， 還存在構(gòu)建復(fù)雜和價(jià)格(jig)的問(wèn)題， 其脫靶效應(yīng)限制了其在基因治療等應(yīng)用上的發(fā)展。共四十二頁(yè)基因(jyn)編輯技術(shù)的展望隨著越來(lái)越多物種基因組測(cè)序的完成，基因功能(gngnng)的研究成為后基因時(shí)代的重點(diǎn)?；蚓庉嫾夹g(shù)既可以用正常基因替代突變基因進(jìn)行性狀改良和基因治療，也可以用突變基因代替正常基因進(jìn)行基因功能的研究。共四十二頁(yè)基因編輯技術(shù)(jsh)的展望與傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)相比，基因編輯技術(shù)擺脫了對(duì) ES 細(xì)胞的限制，可以應(yīng)用于更多的物種，且定向修飾更加精確，效

18、率(xio l)更高，所需時(shí)間更短,得到的突變可以通過(guò)種系遺傳.其中，CRISPR 系統(tǒng)可以同時(shí)進(jìn)行多靶點(diǎn)的切割，易于得到純合子突變體。共四十二頁(yè)基因編輯技術(shù)(jsh)的展望基因組編輯技術(shù)對(duì)應(yīng)的友好位點(diǎn)的選擇，多基因連接策略，表達(dá)調(diào)控(dio kn)策略等配套的技術(shù)體系正在形成，為今后大規(guī)模，多基因的動(dòng)物改良奠定了基礎(chǔ)。更多基因組編輯畜禽的出現(xiàn)會(huì)給畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)，人類營(yíng)養(yǎng)水平和生活質(zhì)量帶來(lái)革命性地影響?？梢灶A(yù)見(jiàn)，以基因組編輯技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)將進(jìn)入黃金時(shí)期。共四十二頁(yè)基因編輯技術(shù)(jsh)的展望總之，基因編輯技術(shù)的研發(fā)還處于起步階段，但其已表現(xiàn)出的相對(duì)(xingdu)于基因打靶技術(shù)的優(yōu)勢(shì)已十分明顯。在未來(lái)的發(fā)展中，基因編輯技術(shù)必將成為生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究與應(yīng)用的重要工具。共四十二頁(yè)謝謝(xi xie)大家！