《儀器分析》課程：第12章 分子發(fā)光-熒光與磷光

1、儀器分析課程廈門大學(xué)精品課程儀器分析(含實驗)第十二章Chapter Twelve分子熒光:Fluorescence分子磷光:Phosphorescence分子發(fā)光-熒光、磷光12.1 分子發(fā)光的基本原理第一次記錄熒光現(xiàn)象的是16世紀西班牙的內(nèi)科醫(yī)生和植物學(xué)家N.Monardes，1575年他提到在含有一種稱為“Lignum Nephriticum”的木頭切片的水溶液中，呈現(xiàn)了極為可愛的天藍色。直到1852年，Stokes在考察奎寧和葉綠素的熒光時，用分光光度計觀察到其熒光的波長比入射光的波長稍微長些，才判斷這種現(xiàn)象是這些物質(zhì)在吸收光能后重新發(fā)射不同波長的光，而不是由光的漫射作用所引起的，從而

2、導(dǎo)入了熒光是光發(fā)射的概念，他還由發(fā)熒光的礦石“螢石”推演而提出“熒光”這一術(shù)語。1867年，Goppelsroder進行了歷史上首次的熒光分析工作，應(yīng)用鋁桑色素配合物的熒光進行鋁的測定。19世紀以前，熒光的觀察是靠肉眼進行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一臺熒光計。一. 分子熒光與磷光的產(chǎn)生1. 單重態(tài)與三重態(tài)2. 分子的活化與去活化3.分子發(fā)光的類型按激發(fā)的模式分類： 按分子激發(fā)態(tài)的類型分類： 光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光/生物發(fā)光熱致發(fā)光場致發(fā)光摩擦發(fā)光 分子發(fā)光分子發(fā)光熒光磷光瞬時熒光遲滯熒光按光子能量分類：斯托克斯熒光(Stokes)： ex em共振熒光(Resonance)

3、： ex = em 熒光 分子的活化與去活化S0S1T1S2紫外可見吸收光譜外轉(zhuǎn)移紫外可見共振熒光光譜內(nèi)轉(zhuǎn)移熒光系間竄躍磷光反系間竄躍遲滯熒光振動弛豫. 無輻射躍遷的類型振動弛豫: Vr 10-12sec外 轉(zhuǎn) 移:無輻射躍遷回到基態(tài)內(nèi) 轉(zhuǎn) 移:S2S1能級之間有重疊系間竄躍: S2T1能級之間有重疊反系間竄躍:由外部獲取能量后 T1 S2. 輻射躍遷的類型共振熒光：10-12 sec熒 光：10-8 sec磷 光：110-4 sec遲滯熒光:10210-4 sec二. 分子熒光(磷光)光譜1. 熒光(磷光)激發(fā)光譜與發(fā)射光譜熒光(磷光)均為光致發(fā)光，在光輻射的作用下，熒光物質(zhì)發(fā)射出不同波長的

4、熒光。A. 激發(fā)光譜固定em=620nm(MAX)ex =290nm (MAX)固定發(fā)射波長掃描激發(fā)波長熒光激發(fā)光譜與紫外-可見吸收光譜類似ex =290nm (MAX)固定em=620nm(MAX)固定ex=290nm (MAX)em= 620nm(MAX)B. 發(fā)射光譜(熒光光譜)固定激發(fā)波長 掃描發(fā)射波長C. 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的鏡像關(guān)系S04321S14321發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)：分子的激發(fā)光譜可能含有幾個激發(fā)帶，但發(fā)射光譜只含一個發(fā)射帶；即使分子被激發(fā)到高于S1的電子態(tài)，由于經(jīng)過極快的內(nèi)轉(zhuǎn)換和振動弛豫降到S1電子態(tài)的最低振動、轉(zhuǎn)動能級，然后以輻射形式釋放能量回到基態(tài)。1 41

5、 31 2111 41 41 21 1D.磷光光譜與發(fā)射光譜相同條件下的磷光光譜激發(fā)光譜發(fā)射光譜2. 三維熒光光譜I F f (ex 、em)蒽的激發(fā)光譜固定發(fā)射波長、掃描激發(fā)波長I F f (ex 、em)蒽的發(fā)射光譜固定激發(fā)波長、掃描發(fā)射波長蒽的三維等高線光譜圖 蒽的三維等熒光強度光譜VB1和VB2的三維熒光光譜RLSDSTSATSADS散射片三維共振光散射光譜3.三維共振光散射光譜ADSATSTSRLSDS散射片三維共振光散射等高線光譜圖共振光散射瑞利散射固定ex=270nm拉曼光二級共振光散射三級共振光散射熒光光譜有用區(qū)間三. 分子熒光(磷光)強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系1. 熒光強度(磷

6、光)與濃度的關(guān)系光吸收定律（Lambert Beer Law）相應(yīng)的吸光分數(shù)為：熒光強度（IF）與相應(yīng)的吸光分數(shù)成正比：按照級數(shù)展開式：對于稀溶液，當(dāng) bc0.05（磷光 bc1000 p(s)2.62.51.40.230.0140.00236.溶劑效應(yīng)藍移: E n * E n * 紅移: E* E* 在極性溶劑中：無溶劑化作用有溶劑化作用三. 金屬螯合物的熒光1. 螯合物中配位體的發(fā)光2. 螯合物中金屬離子的發(fā)光8-羥基喹啉弱熒光8-羥基喹啉-Zn螯合物黃綠色強熒光2,2-二羥基偶氮苯無熒光2,2-二羥基偶氮苯-Al螯合物強熒光T1系間竄躍S0S1d *、f* d * d f* f 熒光分

7、子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移四. 熒光的熄滅1. 碰撞熄滅熒 光 熄 滅：熒光分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低或消失的現(xiàn)象。熒光熄滅劑：這些溶劑分子或其它溶質(zhì)分子稱為熒光熄滅劑。相對速率 1K1 M*K2 M* Q 與分子的直徑、粘度、溫度等因素有關(guān)。2. 能量轉(zhuǎn)移熄滅再吸收過程：共振能量轉(zhuǎn)移：分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移：hv激發(fā)發(fā)射熄滅3. 氧的熄滅作用氧分子是熒光、磷光的熄滅劑，4. 自熄滅與自吸收當(dāng)熒光物質(zhì)的濃度大于1g/L時，常發(fā)生熒光的自熄滅(濃度熄滅)自吸收：沒有除氧，溶液中難以觀察到磷光由于F 1，使熒光強度減弱或消失.形成二聚體：由于二聚體不發(fā)熒光，或發(fā)射熒光的能量有改變，造成自熄滅現(xiàn)

8、象。12.3 熒光(磷光)分光光度計一. 主要組成及部件的功能熒光分光光度計工作原理基及儀器結(jié)構(gòu)框圖光源氙燈激發(fā)單色器樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理儀器控制光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器發(fā)射單色器問題：熒光分光光度計與紫外-可見分光光度計有何異同點？二. 光源1. 光源的要求：發(fā)射強度足夠且穩(wěn)定的連續(xù)光譜光輻射強度隨波長的變化小有足夠長的使用壽命2.氙燈光源常用氣體放電燈類型： 氙燈光源 高壓汞光源波長范圍：2001000nm工作壓力：520 atm啟動電壓：2040KV使用壽命：10002000h最廣泛應(yīng)用的連續(xù)光源： 發(fā)射波長范圍寬 發(fā)射光強度大3. 高壓汞燈光源應(yīng)用廣泛的

9、線光源：253.7 296.5 302.2 312.6313.2 365.0 365.5 366.3404.7 435.8 546.1 557.0579.0 (nm )光源樣品池激發(fā)濾光片檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器光源樣品池激發(fā)濾光片檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射濾光片玻璃濾光片的透射率干涉濾光片的透射率截止涉濾光片的透射率三. 單色器平面衍射光柵線色散率聚光本領(lǐng)分辨率四. 檢測器光電倍增管 放大倍數(shù)：2n5n;n=10,103107， 最大108109五.樣品池：液池、熒光池1.樣品池的材料：與紫外-可見分光光度計的吸收池一樣2. 吸收池的形狀：紫外-可見分光光度計的吸收池兩面透光 熒光分

10、光光度計的樣品池四面透光波長范圍3. 使用注意事項容易破碎問題：紫外-可見分光光度計的吸收池與熒光分光光度計的樣品池有什么區(qū)別？沾污問題閃躍特性六. 磷光分光光度計1. 光學(xué)系統(tǒng)與熒光分光光度計的區(qū)別光源樣品池激發(fā)單色器檢測器數(shù)據(jù)處理儀器控制發(fā)射單色器切光器（斬波器）共振熒光：10-12 sec熒 光：10-8 sec磷 光：110-4 sec遲滯熒光：10010-4 sec2. 樣品池與熒光分光光度計的區(qū)別通常情況下，樣品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶內(nèi)，來測定低溫磷光。12. 熒光分析法的應(yīng)用一. 工作曲線法熒光分析的靈敏度比紫外可見分光光度法高103104.熒光熄滅工作曲線法FxFCsCx

11、直接熒光標準曲線法FCsFxCx二. 熒光分析法的靈敏度在紫外光照射下會發(fā)生熒光的無機化合物很少，主要依賴于有機試劑形成的螯合物。三. 熒光分析的應(yīng)用1. 無機化合物直接熒光測定法其中，較常測定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd與某些稀土元素；測定的靈敏度有些可以達到10-10;某些元素雖然不與有機試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是它會與發(fā)熒光的配合物爭奪配位體，組成不發(fā)熒光的配合，使其產(chǎn)生熒光熄滅，由熒光熄滅的強度此該元素的含量。較常測定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W熒光熄滅測定法 自從1867年Goppelsroder進行了歷史上首次的熒光分析工作，

12、應(yīng)用鋁桑色素配合物的熒光進行鋁的測定以來，采用有機試劑可以測定70多種元素。催化熒光測定法較常測定的元素有：Cr、Nb、U、Te、Pb某些元素雖然與有機試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是反應(yīng)速度慢，在某些微量元素的催化下，反應(yīng)速度會加快，在特定的時間內(nèi)可用來測定微量元素。低溫?zé)晒鉁y定法常測定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2O2、CN某些微量元素存在，會催化發(fā)熒光的配合物產(chǎn)生熒光熄滅，在特定的時間內(nèi)可用來測定微量元素。溶液溫度的降低，顯著增強溶液的熒光強度。液氮 1960C較常測定的元素有：Ce、Sm、Tb 等稀土元素Sb、V、Pb、Bi、Nb、Mn固體熒光測定法固體熒光發(fā)在熒光分析中也經(jīng)常用到。芳香族化合物存在共軛的不飽和體系，是有機化合物熒光測定的主要類型。. 有機化合物待測物試劑 exmaxemmax測定范圍 ppm丙三醇苯胺紫外藍色0.12糠醛蒽酮4655051.515氨基酸氧化酶3154250.0150維生素A無水乙醇345490020蛋白質(zhì)曙紅丫紫外5400.066腎上腺素乙二胺4205250.0010.02 青霉素-甲氧基-氯-(-氨乙基)-氨基氮雜