《衛(wèi)生化學(xué)》課件11.色譜分析導(dǎo)論

1、第15章 色譜分析方法導(dǎo)論15.1 概述歷史、色譜分離過程、分類15.2 色譜流出曲線色譜圖及相關(guān)術(shù)語15.3 色譜法基本原理描述分配過程參數(shù)、峰間距、峰形狀和峰寬的理論描述(塔板理論及速率理論)15.4 分離度及色譜分離方程分離度及色譜分離方程、影響分離的因素15.1 概述 化學(xué)分析方法的基本要求是其選擇性要高。即，在分析過程中，待測物與潛在的干擾物的分離是最為重要的步驟！20 世紀(jì)中期，大量采用一些經(jīng)典的分離方法：沉淀、蒸餾和萃取 現(xiàn)代分析中，大量采用色譜和電泳分離方法。迄今為止，色譜方法是最為有效的分離手段！其應(yīng)用涉及每個科學(xué)領(lǐng)域。歷史：1903年，俄國植物學(xué)家Mikhail Tswet

2、t 最先發(fā)明。他采用填充有固 體CaCO3細(xì)粒子的玻璃柱，將植物色素的混合物(葉綠素和葉黃素 chlorophylls & xanthophylls)加于柱頂端，然后以溶劑淋洗，被分 離的組份在柱中顯示了不同的色帶，他稱之為色譜 (希臘語中 “chroma”=color; “graphein”=write) 。 50年代，色譜發(fā)展最快（一些新型色譜技術(shù)的發(fā)展；復(fù)雜組分分析發(fā)展的要求。 1937-1972年，15年中有12個Nobel獎是有關(guān)色譜研究的！色譜分離基本原理： 使用外力使含有樣品的流動相（氣體、液體或超臨界流體）通過一固定于柱或平板上、與流動相互不相溶的固定相表面。樣品中各組份在兩相

3、中進(jìn)行不同程度的作用。與固定相作用強(qiáng)的組份隨流動相流出的速度慢，反之，與固定相作用弱的組份隨流動相流出的速度快。由于流出的速度的差異，使得混合組份最終形成各個單組份的“帶(band)”或“區(qū)(zone)”，對依次流出的各個單組份物質(zhì)可分別進(jìn)行定性、定量分析。色譜分類方法：1. 按固定相外形分： 柱色譜（填充柱、空心柱）、平板色譜（薄層色譜和紙色譜。2. 按組份在固定相上的分離機(jī)理分： 吸附色譜：不同組份在固定相的吸附作用不同； 分配色譜：不同組份在固定相上的溶解能力不同； 離子交換色譜：不同組份在固定相（離子交換劑）上的親和力不同； 凝膠色譜（尺寸排阻色譜）不同尺寸分子在固定相上的滲透作用。3

4、. 按兩相狀態(tài)分15.2 色譜流出曲線（色譜圖） 混合組分的分離過程及檢測器對各組份在不同階段的響應(yīng)色譜術(shù)語：1）基線：在實驗條件下，色譜柱后僅有純流動相進(jìn)入檢測器時的流出曲線稱為基線，S/N大的、穩(wěn)定的基線為水平直線。2）峰高：色譜峰頂點與基線的距離。3）保留值(Retention value, R) a. 死時間(Dead time, t0) ：不與固定相作用的物質(zhì)從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間，它與色譜柱的空隙體積成正比。由于該物質(zhì)不與固定相作用，因此，其流速與流動相的流速相近。據(jù) t0 可求出流動相平均流速 b. 保留時間tr：試樣從進(jìn)樣到出現(xiàn)峰極大值時的時間。它包括組份隨流動相通過柱子

5、的時間t0和組份在固定相中滯留的時間。 c. 調(diào)整保留時間 ：某組份的保留時間扣除死時間后的保留時間，它是組份在固定相中的滯留時間。即 由于時間為色譜定性依據(jù)。但同一組份的保留時間與流速有關(guān)，因此有時需用保留體積來表示保留值。 d. 死體積V0：色譜柱管內(nèi)固定相顆粒間空隙、色譜儀管路和連接頭間空隙和檢測器間隙的總和。勿略后兩項可得到：其中，F(xiàn)co為柱出口的載氣流速（mL/min)，其值為：F0-檢測器出口流速；Tr-室溫；Tc-柱溫；p0-大氣壓；pw-室溫時水蒸汽壓。 e. 保留體積Vr：指從進(jìn)樣到待測物在柱后出現(xiàn)濃度極大點時所通過的流動相的體積。 f. 調(diào)整保留體積 ：某組份的保留體積扣除

6、死體積后的體積。 g. 相對保留值r2,1：組份2的調(diào)整保留值與組份1的調(diào)整保留值之比。注意： r2,1只與柱溫和固定相性質(zhì)有關(guān)，而與柱內(nèi)徑、柱長L、填充情況及流動相流速無關(guān)，因此，在色譜分析中，尤其是GC中廣泛用于定性的依據(jù)！具體做法：固定一個色譜峰為標(biāo)準(zhǔn)s，然后再求其它峰 i 對標(biāo)準(zhǔn)峰的相對保留值，此時以 表示： 1, 又稱選擇因子(Selectivity factor)。 h. 區(qū)域?qū)挾龋河糜诤饬恐Ъ胺从成V操作條件下的動力學(xué)因素。通常有三種表示方法：標(biāo)準(zhǔn)偏差：0.607倍峰寬處的一半。半峰寬W1/2：峰高一半處的峰寬。W1/2=2.354 峰底寬W：色譜峰兩側(cè)拐點上切線與基線的交點間

7、的距離。W= 4色譜流出曲線的意義： 色譜峰數(shù)=樣品中單組份的最少個數(shù)； 色譜保留值定性依據(jù)； 色譜峰高或面積定量依據(jù)； 色譜保留值或區(qū)域?qū)挾壬V柱分離效能評價指標(biāo)； 色譜峰間距固定相或流動相選擇是否合適的依據(jù)。15.3 色譜法基本原理兩組份峰間距足夠遠(yuǎn)：由各組份在兩相間的分配系數(shù)決定，即由色譜過程的 熱力學(xué)性質(zhì)決定。每個組份峰寬足夠?。河山M份在色譜柱中的傳質(zhì)和擴(kuò)散決定，即由色譜過程 動力學(xué)性質(zhì)決定。 因此，研究、解釋色譜分離行為應(yīng)從熱力學(xué)和動力學(xué)兩方面進(jìn)行。一、描述分配過程的參數(shù) 分配系數(shù)(Distribution constant, K)： 描述組份在固定相和流動相間的分配過程或吸附-脫附

8、過程的參數(shù)，稱為分配系數(shù)。K 只與固定相和溫度有關(guān)，與兩相體積、柱管特性和所用儀器無關(guān)。2. 分配比(Retention factor or capacity factor, k)： 在一定溫度和壓力下，組份在兩相間的分配達(dá)平衡時，分配在固定相和流動相中的質(zhì)量比，稱為分配比它反映了組分在柱中的遷移速率。又稱保留因子。其中VmV0，Vs為固定相體積。分配比 k 的求算：1）組分滯留因子：2）又，3）因此，3. K 與 k 的關(guān)系： 稱為相比率，它也是反映色譜柱柱型特點的參數(shù)。對填充柱，=635；對毛細(xì)管柱， =60600。4. 選擇因子 ：色譜柱對A、B兩組分的選擇因子 定義如下：A為先流出的組

9、分，B為后流出的組分。注意：K 或 k 反映的是某一組分在兩相間的分配；而 是反映兩組分間的分離情況！當(dāng)兩組分 K 或 k 相同時， =1 時，兩組分不能分開；當(dāng)兩組分 K 或 k 相差越大時， 越大，分離得越好。也就是說，兩組分在兩相間的分配系數(shù)不同，是色譜分離的先決條件。 和 k 是計算色譜柱分離效能的重要參數(shù)！二、峰間距、峰形狀和峰寬的理論描述1. 塔板理論（Plate theory) 1952年，Martin等人提出的塔板理論將一根色譜柱當(dāng)作一個由許多塔板組成的精餾塔，用塔板概念來描述組分在柱中的分配行為。塔板是從精餾中借用的，是一種半經(jīng)驗理論，但它成功地解釋了色譜流出曲線呈正態(tài)分布。

10、 塔板理論假定：1）塔板之間不連續(xù)；2）塔板之間無分子擴(kuò)散；3）組分在各塔板內(nèi)兩相間的分配瞬間達(dá)至平衡，達(dá)一次平衡所需柱長為理論 塔板高度H；4）某組分在所有塔板上的分配系數(shù)相同；5）流動相以不連續(xù)方式加入，即以一個一個的塔板體積加入。 當(dāng)塔板數(shù)n較少時，組分在柱內(nèi)達(dá)分配平衡的次數(shù)較少，流出曲線呈峰形，但不對稱；當(dāng)塔板數(shù)n50時，峰形接近正態(tài)分布。2 氣相色譜基本理論一、塔板理論 根據(jù)呈正態(tài)分布的色譜流出曲線可以導(dǎo)出計算塔板數(shù)n的公式，用以評價一根柱子的柱效。由于色譜柱并無真正的塔板，故塔板數(shù)又稱理論塔板數(shù)：可見理論塔板數(shù)由組分保留值和峰寬決定。 若柱長為L，則每塊理論塔板高度H為 由上述兩式

11、知道，理論塔板數(shù)n越多、理論塔板高度H越小、色譜峰越窄，則柱效越高。 但上述兩式包含死時間t0，它與組分在柱內(nèi)的分配無關(guān)，因此不能真正反映色譜柱的柱效。通常以有效塔板數(shù)neff 和有效塔板高度Heff 表示：有關(guān)塔板理論的說明：1）說明柱效時，必須注明該柱效是針對何種物質(zhì)、固定液種類及其含量、流動相種類及流速、操作條件等；2）應(yīng)定期對柱效進(jìn)行評價，以防柱效下降、延長柱壽命。3）塔板理論描述了組分在柱內(nèi)的分配平衡和分離過程、導(dǎo)出流出曲線的數(shù)學(xué)模型、解釋了流出曲線形狀和位置、提出了計算和評價柱效的參數(shù)。 但該理論是在理想情況下導(dǎo)出的，未考慮分子擴(kuò)散因素、其它動力學(xué)因素對柱內(nèi)傳質(zhì)的影響。因此它不能解

12、釋： 峰形為什么會擴(kuò)張？ 影響柱效的動力學(xué)因素是什么？2. 速率理論（Rate theory） 1956年，荷蘭化學(xué)工程師van Deemter提出了色譜過程動力學(xué)速率理論：吸收了塔板理論中的板高H概念，考慮了組分在兩相間的擴(kuò)散和傳質(zhì)過程，從而給出了van Deemter方程： u 為流動相線速度； A，B，C為常數(shù)，其中 A分別表示渦流擴(kuò)散系數(shù)； B分子擴(kuò)散系數(shù)； C傳質(zhì)阻力系數(shù)（包括液相和固相傳質(zhì)阻力系數(shù)）。 該式從動力學(xué)角度很好地解釋了影響板高（柱效）的各種因素！任何減少方程右邊三項數(shù)值的方法，都可降低H，從而提高柱效。1）渦流擴(kuò)散項(Multipath term, A) 在填充柱中，由

13、于受到固定相顆粒的阻礙，組份在遷移過程中隨流動相不斷改變方向，形成紊亂的“渦流”：從圖中可見，因填充物顆粒大小及填充的不均勻性同一組分運(yùn)行路線長短不同流出時間不同峰形展寬。展寬程度以A表示：A=2dp其中dp填充物平均直徑；填充不規(guī)則因子。 可見，使用細(xì)粒的固定相并填充均勻可減小A，提高柱效。對于空心毛細(xì)管柱，無渦流擴(kuò)散，即A=0。流動方向2）分子擴(kuò)散項(Longitudinal diffusion term, B/u) 縱向分子擴(kuò)散是由于濃度梯度引起的。當(dāng)樣品被注入色譜柱時，它呈“塞子”狀分布。隨著流動相的推進(jìn)， “塞子”因濃度梯度而向前后自發(fā)地擴(kuò)散，使譜峰展寬。其大小為B=2D 稱為彎曲因

14、子，它表示固定相幾何形狀對自由分子擴(kuò)散的阻礙情況；D組分在流動相中的擴(kuò)散系數(shù)。組份為氣體或液體時，分別以Dg或Dm表示；討論： 分子量大的組分，Dg小，即B小 Dg 隨柱溫升高而增加，隨柱壓降低而減小； 流動相分子量大，Dg 小，即 B ?。?u 增加，組份停留時間短，縱向擴(kuò)散??；（B/u） 對于液相色譜，因Dm 較小，B 項可勿略。球狀顆粒；大分子量流動相；適當(dāng)增加流速；短柱；低溫。3）傳質(zhì)阻力項(Mass-transfer term, Cu) 因傳質(zhì)阻力的存在，使分配不能“瞬間”達(dá)至平衡，因此產(chǎn)生峰形展寬。氣相色譜以氣體為流動相，液相色譜以液體為流動相，二者傳質(zhì)過程不完全相同。下面分別作討

15、論。a）氣液色譜：傳質(zhì)阻力項C包括氣相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cs和液相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cl。流動相固液界面固定液組分分子ClCg討論： 減小填充顆粒直徑dp； 采用分子量小的流動相，使Dg增加； 減小液膜厚度df，Cl下降。但此時k又減小。 因此，當(dāng)保持固定液含量不變時，可通過 增加固定液載體的比表面來降低df。但比 表面過大又會因吸附過強(qiáng)使峰拖尾。 增加柱溫，可增加Dl，但k值也減小，為保 持合適Cl值，應(yīng)控制柱溫。b）液液色譜：傳質(zhì)阻力項C包括流動相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cm和固定相傳質(zhì)阻力系數(shù)Cs。討論： 流動相傳質(zhì)阻力包括兩方面：流動相中的傳質(zhì)阻力Cm、滯留的流動相傳 質(zhì)阻Cs力。分別與填充物大小 dp、擴(kuò)散

16、系數(shù)(Dm)、微孔大小及其數(shù)量等有 關(guān)。 因此，降低流動相傳質(zhì)阻力的方法有：細(xì)顆粒固定相、增加組分在 固定相和流動相中的擴(kuò)散系數(shù)D、適當(dāng)降低線速度、短柱。 固定相傳質(zhì)阻力與液膜厚度df、保留因子 k 和擴(kuò)散系數(shù)Ds等有關(guān)。 因此，降低固定相傳質(zhì)阻力的方法有：與氣液色譜中的表述相同。sm4）流速u 由van Deemter方程 H = A + B/u + Cu知道： 當(dāng)u一定時，僅在A、B、C較小時，H較小，柱效較高；反之則柱效較低，色譜峰將展寬。 以u對H作圖，可得H-u曲線（如圖），從該曲線得到：渦流擴(kuò)散項A與流速u無關(guān)；低流速區(qū)(u小)，B/u大，分子擴(kuò)散項占主導(dǎo)， 此時選擇分子量大的氣體

17、如N2和Ar為載氣，可 減小擴(kuò)散，提高柱效； 高流速區(qū)(u大)，Cu大，傳質(zhì)阻力項占主導(dǎo)， 此時選擇分子量小的氣體如H2和He為載氣， 可增加擴(kuò)散系數(shù)，提高柱效； 曲線的最低點對應(yīng)最佳線速uopt( ) 下的 最小板高Hmin( )； LC的Hmin和uopt均比GC的小一個數(shù)量級，即在 LC中，較低流速可獲得較大的柱效。板高，H(cm)HminA+B/u+CuCmuCsuAB/u5）固定相顆粒大小對板高的影響 實驗表明，顆粒越細(xì)，板高越小，受線速影響越小。即，在HPLC分析中采用細(xì)粒作固定相的理論根據(jù)！ 但顆粒細(xì)導(dǎo)致柱流速慢，當(dāng)采用高壓技術(shù)，才能實現(xiàn)HPLC的分析要求。 上面分別介紹了影響色

18、譜分離的基本原理以及影響柱效的各種因素，但是如何從總體上定量描述色譜分離效能？如何將各種影響因素對分離的影響定量地表述出來呢？板高, H(cm)15.4 分離度及色譜分離方程一、分離度(Resolution, R) 同時反映色譜柱效能和選擇性的一個綜合指標(biāo)。也稱總分離效能指標(biāo)或分辨率。其定義為： 利用此式，可直接從色譜流出曲線上求出分離度R。 R 越大，相鄰組分分離越好。當(dāng)R=1.5時，分離程度可達(dá)99.7%，因此R=1.5通常用作是否分開的判據(jù)。R=1.5R=0.75R=1.0響應(yīng)信號保留時間 t, min二、色譜分離方程 R 的定義并未反映影響分離度的各種因素。也就是說，R 未與影響其大小的因素：柱效n、選擇因子 和保留因子 k 聯(lián)系起來。 對于相鄰的難分離組分，由于它們的分配系數(shù) K 相差小，可合理假設(shè)k1k2=k，W1 W2=W。因此可導(dǎo)出R與n（neff）、 和 k 的關(guān)系：附：具體推導(dǎo)過程如下：有關(guān)色譜方程的討論：1）分離度R與柱效的關(guān)系 分離度R與理論塔板數(shù)n有關(guān)，即R受熱力學(xué)性質(zhì)的影響。 對具一定相對保留值的物質(zhì)對，R與有效塔板數(shù)neff有關(guān)，說明neff可正確代表柱效能。 由色譜方程可得： 因此可通過增加柱長提高分離度。然而，分析時間也相應(yīng)增加，且峰寬