檢測(cè)蛋白質(zhì)中氨基酸的含量的各種方法及優(yōu)劣討論

1、蛋白質(zhì)中氨基酸的含量測(cè)定組成蛋白質(zhì)的基本單位是氨基酸，氨基酸通過脫水縮合形成肽鏈。蛋白質(zhì)是由一條或多條多肽鏈組成的生物大分子，其含量測(cè)定是生化藥品研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前其常用的測(cè)定方法有凱氏定氮法、福林酚法、雙縮月尿法、BcA法、考馬斯亮藍(lán)法、紫外分光光度法及熒光法。凱氏定氮法1方法本法系依據(jù)蛋白質(zhì)為含氮的有機(jī)化合物，當(dāng)與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化時(shí)使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以氮轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。本法各國藥典收載的方法一致。故參照中國藥典2005年版三部41附

2、錄方法，按純蛋白類供試品及添加無機(jī)含氮物質(zhì)及有機(jī)非蛋白質(zhì)含氮物質(zhì)的供試品分別擬定各測(cè)定方法。2討論21凱氏定氮法雖耗時(shí)較長，但它是蛋白質(zhì)測(cè)定方法中最經(jīng)典的測(cè)定方法，本法所測(cè)的結(jié)果為蛋白質(zhì)絕對(duì)濃度而非相對(duì)濃度，可用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確測(cè)定。22本法靈敏度較低，適用于O.2omg氮的測(cè)定，干擾少。123蛋白質(zhì)是復(fù)雜的含氮有機(jī)化合物，一般蛋白質(zhì)的含氮量為16，故含氮量轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的系數(shù)為625。但由于不同蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)差異，其換算系數(shù)會(huì)稍有區(qū)別，如乳制品為638，動(dòng)物膠為5。65等，因此一些特殊蛋白質(zhì)應(yīng)在各論中相應(yīng)說吩其轉(zhuǎn)化系數(shù)。24在本法附注中起草了非蛋白氮供試品溶液制備的兩種常用方法用于非氮的測(cè)

3、定，一般采用鎢酸沉淀法，但當(dāng)供試品中含有氨基酸(精氨酸)時(shí)，由于其會(huì)影響蛋白質(zhì)的沉淀，故建議采用三氯醋酸沉淀法方法(1)與方法(3)的線性相關(guān)系數(shù)均能達(dá)到0999以上，較理想；方法(1)試劑配制繁瑣且整個(gè)實(shí)驗(yàn)費(fèi)時(shí)長，而方法(3)操作更簡(jiǎn)便快速。按各方法測(cè)試后的溶液放置30min后重新測(cè)定其吸光度，3種方法溶液的吸光度均略有降低，結(jié)果變異均在1以內(nèi)。根據(jù)上述考察結(jié)果，故本文參照國家藥品標(biāo)準(zhǔn)地標(biāo)升國標(biāo)制定本法。2xx酚xx(lowryxx)1本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cu2播合形成蛋白質(zhì)銅復(fù)合物，此復(fù)合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，同時(shí)在堿性條件下酚試劑易被蛋白質(zhì)中酪

4、氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍(lán)色反應(yīng)，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測(cè)定供試品中蛋白質(zhì)的含量。本法各收載的方法中堿陛銅試液的配制、福林酚試液的酸濃度、測(cè)定波長及比色條件略有不同。本文對(duì)各種方法的線性、穩(wěn)定陡進(jìn)行了考察。2討論21本法福林酚試液中使用的福林試液貯備液的配制在中國藥典二部附錄中有收載，其酸濃度為2m01.L，目前也有市售產(chǎn)品，但酸濃度可能有所差異，故應(yīng)根據(jù)實(shí)際福林試液貯備液酸濃度的高低對(duì)最終福林酚試液的配制進(jìn)行調(diào)整。22福林-酚試液僅在酸性pH條件下穩(wěn)定，但第二步的還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)酚試劑加到堿性銅一蛋白質(zhì)溶

5、液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生，否則會(huì)使顯色程度減弱。2.3本法干擾物質(zhì)較多，還原物質(zhì)、酚類、檸檬酸、硫酸鏤、%s緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。3.4本法靈敏度高，比雙縮月尿法高100倍，通常測(cè)定范圍為20250“g。雙縮腺法1本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有的兩個(gè)以上肽鍵在堿性溶液中與cu2+形成紫紅色絡(luò)合物，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測(cè)定供試品中蛋白質(zhì)的含量。本法各收載的方法中雙縮脲試液的配制、測(cè)定波長及比色條件略有不同。本文對(duì)各種方法的線性、穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。方法(1)與方法(3)的

6、線性相關(guān)系數(shù)均能達(dá)到0999以上，較理想；方法(1)溶液的吸光度偏高同時(shí)其操作過程中需分別加入兩種反應(yīng)試劑，而方法(3)操作更簡(jiǎn)便，比色條件為室溫。按各方法測(cè)試后的溶液放置30min后重新測(cè)定其吸光度，方法(1)和方法(2)溶液的吸光度略有增加，方法(3)溶液的吸光度基本不變。2討論21加人雙縮脲試劑后需立即快速混勻。22本法測(cè)定較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，干擾物質(zhì)較少，干擾測(cè)定的物質(zhì)主要有：硫酸鏤、%s緩沖液和某些氨基酸等。.2.3本法靈敏度差，測(cè)定范圍為110mg。2,2-聯(lián)唾咻_4,4-二竣酸法(BCA法)41本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子在堿性溶液中將Cu2鏈原為cu+,BCA(22

7、一聯(lián)唾咻4,4一二竣酸)與Cu+結(jié)合形成紫色復(fù)合物，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測(cè)定供試品中蛋白質(zhì)的含量。本法僅收載于歐洲藥典60版、英國藥典2009年版與美國藥典32版附錄中且方法基本一致。故本文參照國外藥典制定本法。經(jīng)試驗(yàn)，牛血清白蛋白對(duì)照品在84.74236峭濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，吸光度為0.1870907，相關(guān)系數(shù)為09991。42討論421本法顯色后溶液吸光度隨時(shí)間的增加而明顯增加，故溶液顯色后應(yīng)于562nm的波長處立即測(cè)定吸光度。422本法干擾物質(zhì)少。但樣品中不能有還原劑和銅螯合物，否則影響測(cè)定。.2.3本法靈敏度較高，測(cè)定范

8、圍為80400斗g?？紉xxxxx(Bmdfordxx)1本法系依據(jù)在酸性溶液中考馬斯亮藍(lán)G笛。與蛋白質(zhì)分子中的堿性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物，在一定范圍內(nèi)其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度呈正比，以蛋白質(zhì)對(duì)照品溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用比色法測(cè)定供試品中蛋白質(zhì)的含量。本法僅收載于歐洲藥典.。版、英國藥典2009年版與美國藥典32版附錄中且方法基本一致。故本文參照國外藥典制定本法。經(jīng)試驗(yàn)，牛血清白蛋白對(duì)照品在1.0591059斗g濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，吸光度為0.0050630，相關(guān)系數(shù)為09996。52討論521本法測(cè)定吸光度時(shí)不可使用石英比色皿（因石英中的二氧化硅會(huì)與染色物結(jié)合，不易

9、洗去），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95的乙醇蕩洗，以洗去染色。5.2.2加入考馬斯亮藍(lán)G-2S0試劑來回翻轉(zhuǎn)混勻時(shí)，注意不要太劇烈，以免產(chǎn)生大量氣泡而難于消除，干擾測(cè)定。523本法顯色后溶液不穩(wěn)定，故溶液顯色后應(yīng)于595nm的波長處立即測(cè)定吸光度。主要的干擾物質(zhì)有去污劑、TritonX-100、七二烷基硫酸鈉（SDS等，樣品緩沖液呈強(qiáng)堿性時(shí)也會(huì)影響顯色。524本法蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)一染料復(fù)合物有更高的吸光系數(shù)，吸光度隨蛋白質(zhì)濃度的變化比福林-酚法要大。因而靈敏度高，可測(cè)定1200斗g的蛋白濃度71。6紫外分光光度法61本法系依據(jù)蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪

10、氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸：其在280nm波長處具最大吸光度，在一定范圍內(nèi)其吸光度大小與蛋白質(zhì)濃度呈正比。本法歐洲藥典60版、英國藥典2009年版與美國藥典32版附錄中均收載且方法基本一致，而中國藥典2005年版未收載該方法，僅在國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中一些少量品種檢查項(xiàng)下用于蛋白質(zhì)的檢查。本文參照國外藥典及相關(guān)文獻(xiàn)制定本法。62討論621紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，但操作簡(jiǎn)便快速，適用于純化蛋白質(zhì)的微量檢測(cè)，如用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度變化而不需要其絕對(duì)值或中間體的快速測(cè)定。622用對(duì)照品比較法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，當(dāng)供試品與對(duì)照品中酪氨酸和色氨酸含量差異較大時(shí)會(huì)產(chǎn)生一定的誤差。故適用于測(cè)定與對(duì)照蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。623由于蛋白質(zhì)吸收峰常因pH值的改變而有所變化，因此要注意溶液的pH值。624蛋白質(zhì)濃度（mg。mL“尸1.45XA28&0.74XAs,此公式是通過一系列已知不同濃度比例的蛋白質(zhì)（酵母烯醇化酶）和核酸（酵母核酸）的混合液所測(cè)定的數(shù)據(jù)來建立的。7小結(jié)71蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法中各國藥典常用的對(duì)照品有牛血清白蛋白、人血白蛋白、酪蛋白、免疫球蛋白及各品種的自身對(duì)照品等。本文采用牛血清白蛋白對(duì)各測(cè)定方法進(jìn)行了考察，建議在中國藥典各論中應(yīng)根據(jù)品種盡可能選用與品種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相近的蛋白質(zhì)對(duì)照品。72本文建立的蛋白質(zhì)含量測(cè)定