高效液相色譜法基本知識培訓(xùn)-化驗員入門培訓(xùn)ppt課件

1、高效液相色譜法.第一節(jié) 高效液相色譜的定義及基本參數(shù).定義 高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入色譜柱內(nèi)，各組分在色譜柱內(nèi)被分離，并依次進入檢測器，由積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。 .基本參數(shù) （一）保留值 保留值是用來描述樣品組分在色譜柱中保留程度的參數(shù),并作為色譜定性的指標。其表示方法有保留時間、保留體積、調(diào)整保留時間和調(diào)整保留體積。.保留時間和保留體積 一般認為,當進樣量很小時,樣品從柱中流出呈高斯曲線分布。從進樣開始到峰極大值所需時間時間稱為保留時間,以tR表示。由于流出時間與流動相流速成反比

2、,因此又可用保留體積作為保留值參數(shù),以VR表示。VR=tRFC 式中, tR為保留時間(min), FC為流動相流速（ml/min)。 . 某一組分的保留體積就是該組分從柱中流出所需流動相體積,一般情況下常以ml為單位。細內(nèi)徑柱和毛細管柱,由于所需流動相流量很小, FC的單位用1/min表示,此時VR可采用為1單位。 不保留物質(zhì)流出時間以tM表示,又稱死時間。而tMFC即為保留物質(zhì)死體積,簡稱死體積(VM)。死體積不僅與柱結(jié)構(gòu)有關(guān),而且與進樣系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)的體積有關(guān)。只有當柱外體積忽略不計時, tMFC才表示柱內(nèi)流動相所占的體積。以VM表示。任何色譜過程的基本保留方程式為VR=VM+KVS式中

3、,K為平衡分配系數(shù), VS為固定相體積,Vm為柱內(nèi)流動相所占體積(當柱外體積不容忽略時,Vm表示柱內(nèi)空隙及柱外體積之總和)。. 溶質(zhì)的色譜保留行為主要是由該溶質(zhì)在固定相和流動相中的平衡分配系數(shù)K所決定的,而K是溶質(zhì)在兩相間達到平衡分配時性質(zhì)上的度量。其定義為,溶質(zhì)在兩相間達到平衡時在固定相和流動相中的濃度比。 K= 溶質(zhì)在固定相中的濃度(ms/Vs) = ms Vm 溶質(zhì)在流動相中的濃度(mm/Vm) mm Vs 式中,ms、mm分別為溶質(zhì)在固定相和流動相中的質(zhì)量。.調(diào)整保留時間和調(diào)整保留體積 扣除死時間或死體積的保留值,定義為調(diào)整保留時間(tR)和調(diào)整保留體積(VR),如下式所示。 tR =

4、tR-tM VR =VR-VM 保留值是色譜過程熱力學(xué)的重要參數(shù)。當色譜操作條件一定時,不同物質(zhì)的有其特定的保留值。這是色譜定性分析的基本依據(jù)。在液相色譜中,由于流動相參與了溶質(zhì)分配過程,因此,樣品組分的保留值不僅與固定相的性質(zhì)有關(guān),而且受流動相性質(zhì)變化的影響很大。因此研究液相色譜中流動相組成對保留值的影響,是分離條件最佳化的基礎(chǔ)。.容量因子(k) 容量因子是色譜法中廣泛采用的保留值參數(shù),它是樣品組分的質(zhì)量在兩相中分配的比值,定義為 k=固定相中溶質(zhì)的質(zhì)量(ms) = kVs 流動相中溶質(zhì)的質(zhì)量(mm) Vm VR=Vm+k(Vm/Vs)Vs= Vm+kVms = Vms(1+k) 式兩邊除以

5、沖洗劑流速Fc則得 tR = tM(1+k) k= tR/tM-1= tR/tM 可見,容量因子就是調(diào)整保留時間與死時間的比值。在液相色譜中，k只與固定相、流動相性質(zhì)及柱溫有關(guān),而與流速和柱尺寸無關(guān)。.理論塔板數(shù)n和塔板高度H 理論塔板數(shù)n是反映物質(zhì)在固定相和流動相中動力學(xué)特性的重要色譜參數(shù),它是代表色譜柱分離效能的指標。 計算公式為: n=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2 tR為保留時間, W為峰寬， Wh/2為半高峰寬 塔板高度H計算公式為： H=L/n L為色譜柱長度。.分離因子()及分離度（R） 1.分離因子() = k2/k1=tR2/tR1 代表了二個物質(zhì)在相同的色

6、譜條件下的分離選擇性。物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)或結(jié)構(gòu)上的差異,反映在與固定相和流動相之間作用力也有所差異上。這就是色譜分離的基礎(chǔ)。. 改變是改變后一組分相對于前一組分的保留時間。的改變可以選擇不同的固定相或流動相來實現(xiàn)。但改變固定相在液相色譜中比較麻煩。如在一個色譜系統(tǒng)中,用二根不同固定的柱子,則又必須考慮到流動相的適應(yīng)性。比較行之有效的辦法是改變流動相的極性,如采用連續(xù)改變流動相極性的梯度洗脫或溫度程序等方法來提高分離選擇性。. 2.分離度（R） 用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程度,是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標?？梢酝ㄟ^測定待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度,也可以通過測定待測組分與某一添

7、加的指標性成分(內(nèi)標物質(zhì)或其他難分離物質(zhì))的分離度,或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當?shù)姆椒ń到?通過測定待測組分與某一降解產(chǎn)物的分離度,對色譜系統(tǒng)進行評價與控制。.無論是定性鑒別還是定量分析,均要求待測峰與其他峰、內(nèi)標峰或特定的雜質(zhì)對照峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外,待測組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5。.計算公式為：.首先，可以通過增加分離因子（）值的方法提高分離度，可通過以下方法實現(xiàn)：（1）改變流動相的組成；（2）改變流動相的pH值；（3）改變固定相的種類；（4）改變分離溫度。其次，提高理論板數(shù)（N）可以提高分離度：（1）柱長增加1倍，柱效也增加1倍，但相應(yīng)的分離時間也增加1倍；（2）

8、減少固定相粒徑，可以提高柱效，相應(yīng)的柱壓增高，可進行快速分離。第三，提高容量因子（k）方法提高分離度，可通過以下方法實現(xiàn)：（1）調(diào)節(jié)流動相極性、pH值、離子強度等；（2）梯度洗脫。另外，如果k值過大，會造成分離時間過長，并且譜帶擴散嚴重，因此，比較適宜的k值范圍為1k10。.拖尾因子T 用于評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度,應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規(guī)定。.重復(fù)性 用于評價連續(xù)進樣中,色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標法時,通常取各品種項下的對照品溶液,連續(xù)進樣5次,除另有規(guī)定外,其峰面積測量值的相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%；采用內(nèi)標法時,通常配制相當于80%、10

9、0%和120%的對照品溶液,加入規(guī)定量的內(nèi)標溶液,配成3種不同濃度的溶液,分別至少進樣2次,計算平均校正因子。其相對標準偏差應(yīng)不大于2.0%。.第二節(jié) 化學(xué)健合相色譜. 在液相色譜中,液一液分配色譜,(liquid-liquid chromatography,LLc)具有較高的分離效能和溫和的色譜條件。但最大的缺點是擔體表面涂漬的有機液相容易流失,并污染分離后的組分?；瘜W(xué)鍵合固定相是克服這一主要缺點而產(chǎn)生的。它的出現(xiàn),使得以液-固吸附色譜和液-液分配色譜為主要操作模式的液相柱色譜大量地被鍵合相色譜所取代,某些離子型化合物也改用了離子交換鍵合相或反相離子對色譜進行分離。因而,化學(xué)鍵合相色譜是現(xiàn)代

10、液相色譜中的一個重要方法。.特點 （一）柱子不“嬌” 化學(xué)鍵合相是借助于化學(xué)反應(yīng)的方法,將有機分子以共價鍵連接在色譜擔體上。因此,在很大程度上減弱了表面活性作用點,清除了某些可能的催化活性,從而減少了復(fù)雜樣品的表面上的不可逆化學(xué)吸附,使得操作簡化、峰形對稱、對溶劑中微量水分含量的變化要求不苛刻。此外,溶劑的殘留效應(yīng)小,梯度沖洗平衡快,和液-固色譜相比較,流動相可用價廉的甲醇-水混合液。 . （二）耐溶劑沖洗 這是傳統(tǒng)的液-液分配色譜逐漸被鍵合相色譜(bonded phase chromatography,BPC)取代的根本原因。在現(xiàn)代液相色譜發(fā)展的初期,常和氣相色譜一樣,把有限的幾種固定液,例

11、如、-氧二丙腈、聚乙二醇、角鯊?fù)榈韧繚n的擔體表面上,用一種性質(zhì)相差很大的溶劑沖洗,進行LLC分離。由于兩種完全互不相溶的溶劑體系實際上幾乎不存在,因而在LLC中固定液相的流失就十分嚴重。為了克服這個缺點,曾采用流動相預(yù)先被固定液飽和,以及柱前增加預(yù)飽和柱的方法,但這樣做既不方便,柱系統(tǒng)的穩(wěn)定性也差?；瘜W(xué)鍵合相是通過化學(xué)反應(yīng)將有機分子鍵合到擔體上,因而具有不可抽提性,也就是不存在固定液流失問題,使得柱壽命大大延長,并且擴大了可用溶劑的范圍。 . （三）熱穩(wěn)定性好 這一點在氣相色譜中很重要。每種固定液有最高使用溫度。例如十八烷作為固定液時,只能在常溫下使用,但十八烷基鍵合相的流失溫度在200以上。

12、在HPLC中,熱穩(wěn)定必也有一定意義,因為某些分離是升溫條件下進行的。 （四）表面改性靈活,容易獲得重復(fù)性的產(chǎn)品 改變鍵合用有機硅烷,可以得到不同鍵合相的填料,以適用于各種類型的試樣分離,有助于提高分離選擇性。.分類 化學(xué)鍵合相的分類可以有不同的依據(jù)。按鍵合相的表面結(jié)構(gòu)為單分子鍵合和聚合鍵合；按性質(zhì)分為Si-O-C,Si-O-Si-N,Si-O-S-C；按鍵合有機硅烷的功能團分為極性鍵合相、非極性鍵合相和離子性鍵合相三種。.極性鍵合相色譜 極性鍵合相指鍵合有機分子中含有某種極性基團。和空白硅膠相比,這種極性鍵合相表面上能量分布相對均勻,因而吸附活性也比硅膠低，可以看成是一種改性過的硅膠。最常見的

13、極性鍵合相有氰基（-CN，cyano-)、二醇基(diol)、氨基（-NH2，amion-）等。商品鍵合相以上述基團命名,如LiChrosorb NH2,LiChrosorb DiOl等。也有的商品鍵合相并不注明是什么基團,而是稱為Vydac polar(即氨基)或BondapaK Carbohydrate(也即氨基)等。 . 對極性鍵合相來講,一般鍵合表面的基團是由三部組成: 鍵型 如Si-O-Si-C或Si-O-Si-N。這是整個極性鍵合基團與硅膠母體直接相連的橋梁。主體基團 一般由直鏈烴基或醚基所組成,其作用為使在硅膠表面與特定的極性基團之間保持一定距離。極性的端基 由帶極性基團(如NH

14、2、OH)的烴基或芳基所組成。. 大多數(shù)情況下,極性鍵合相的制備分二步進行。第一步是在硅膠表面先接上一個正烴基或正芳基硅烷,然后再以相應(yīng)的取代反應(yīng)引入極性基團。由于空間位阻的影響,上述取代反應(yīng)往往不能象均相溶液中反應(yīng)那樣完全,一般靠碳和氮含量來計算表面覆蓋程度。. 上述三種極性鍵合相都是主要以氫鍵力作用,其中氰基是一種氫鍵接受體,而后二種兼具氫鍵接受體和給予體兩種性能。對于有較強氫鍵作用力的樣品,在后兩種鍵合相上所得的k就大。如聯(lián)苯胺和苯胺，在正相洗脫的條件下,在氨基固定相上所得的k比氰基固定相顯著增大。. 極性鍵合相一般都用作正相色譜,即用非極性或極性小的溶劑(如烴類溶劑)加入適量的極性溶劑

15、(如三氯甲烷、醇、乙腈等),以調(diào)節(jié)控制洗脫液的洗脫強度。分離組分的出峰順序與組分的極性大小順序相同,即極性弱的先出峰,極性強的后出峰。但對強極性的化合物,上述極性鍵合相也可用反相色譜,如在分離糖類或多肽化合物時,用乙腈-水作洗脫液也可以得到良好的分離效果。 在極性鍵合相上的分離機理,有吸附和分配之爭。但一般都認為吸附過程是主要的相互作用過程,通過填料表面極性基團的偶極誘導(dǎo),或氫鍵,或靜電作用和溶質(zhì)分子發(fā)生相互作用,達到混合物的分離目的。.離子交換鍵合相色譜 離子交換色譜早期都采用高分子聚合物(如苯乙烯-二乙烯苯)為基質(zhì)的離子交換樹脂作固定相。在高效液相色譜中,這種固定相由于溶脹性,不耐高壓,以

16、及表面的微孔型結(jié)構(gòu)影響傳質(zhì)速率,現(xiàn)已逐漸被離子交換鍵合相所代替。 在化學(xué)鍵合的有機硅烷分子中帶上固定的離子交換基團,便成了離子交換鍵合相。若帶上磺酸基(-SO3H)、羧酸基(-COOH)就是陽離子交換劑，若帶上季銨基（-R4H+)或氨基（-NH2)就是陰離子交換劑。. 上述離子交換鍵合相,多以薄殼型或全多孔微粒硅膠為基質(zhì),具有較高的耐壓性、化學(xué)與熱穩(wěn)定性。由于硅膠有好的機械強度,耐壓,這類微粒型鍵合固定相可以高壓勻漿裝柱。但它對pH的適用范圍只能在pH08。pH9硅膠便容易溶解。特別是未鍵合的殘留硅羥基容易生成硅酸鹽。. 離子性鍵合固定相的交換容量與固定相的表面積直接有關(guān)。全多孔微粒型固定相的

17、交換容量，一般在毫克當量的水平；薄殼型由于表面積較小,一般只有微克當量級。交換容易可用酸堿滴定法測定。 在鍵合離子交換色譜中，流動相中往往還加入有機成分作為改性劑。溶質(zhì)的保留值受流動相溶液的pH值、離子強度以及有機改性的影響,溶質(zhì)的保留值兼有離子交換和吸附雙重機理。.非極性鍵合相色譜 又稱反相鍵合相色譜。鍵合相表面都是極性很小的烴基,如十八烷基、辛烷基、甲基、苯基等。最常用的是十八烷基硅烷鍵合硅膠,又稱ODS。而洗脫液大都采用強極性溶劑(水、醇、乙腈)或無機鹽的緩沖液。在這種鍵合相色譜中,洗脫次序恰與正相色譜相反，即極性大的化合物先洗脫(k小)，極性小的化合物不易洗脫(k大)。. 反相色譜是高

18、效液相色譜中應(yīng)用最廣泛的-個分支,其主要原因是這個操作系統(tǒng)的簡單性和靈活性。用作流動相的水和能與水互溶的有機溶劑在價格和獲取方便的程度上都比相色譜中的烴類溶劑有利。特別是化學(xué)鍵合固定相上樣品的不可逆吸附和溶劑的記憶效應(yīng)小,所以更換溶劑或梯度淋洗非常方便。更為突出的是分析對象多樣化,靈活牲大大提高。 .第三節(jié) 儀器裝置 . 所使用的儀器為高效液相色譜儀，基本是由高壓輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、柱溫箱、檢測器、數(shù)據(jù)采集及處理等幾部分構(gòu)成。儀器應(yīng)定期檢定并符合有關(guān)規(guī)定。.高壓輸液系統(tǒng) 高效液相色譜輸液系統(tǒng)包括貯液罐、高壓輸液泵、梯度洗脫裝置等。.貯液罐及流動相 貯液罐 貯液罐是一個存放流動相（洗脫液）的容器

19、,所以其結(jié)構(gòu)材料必須對流動相是化學(xué)惰性的。常用的材料為玻璃、不銹鋼或表面噴涂聚四氟乙烯的不銹鋼等。容積一般為0.52升。 . 流動相 流動相的配制應(yīng)首選色譜純試劑，水應(yīng)用純化水。流動相使用前應(yīng)先用0.45m或更小孔徑微孔濾膜過濾，目的是除去溶劑中的微小顆粒，避免堵塞色譜柱，尤其是使用無機鹽配制的緩沖液。其次，流動相進入高壓泵前應(yīng)脫氣，目的是除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡，如果不去除氣泡，會有以下情況發(fā)生：（1）泵中氣泡使液流波動，改變保留時間和峰面積；（2）柱中氣泡使流動相繞流，峰變形；（3）檢測器中的氣泡產(chǎn)生基線波動。脫氣的方法有加熱法、加壓法、超聲去除法、惰性氣體置換法及在線脫氣法。

20、 . 反相色譜系統(tǒng)的流動相首選甲醇水系統(tǒng)（采用紫外末端波長檢測時首選乙腈水系統(tǒng)）。乙腈與甲醇相比較，具有以下優(yōu)點：（1）乙腈洗脫能力較強（40%乙腈約相當于50%甲醇，相當于30%四氫呋喃）；（2）乙腈具有良好的溶解能力，能使色譜峰的峰形更加對稱；（3）乙腈與水能夠較好的互溶，并且黏度較甲醇水??；（4）乙腈的截止波長是有機溶劑中最低的，高純度乙腈截止波長為190nm。.但同時具有以下缺點：（1）乙腈價格較甲醇昂貴；（2）在低pH條件下，磷酸鹽在乙腈溶液中溶解度較小，有研究表明，當乙腈接近50%（體積分數(shù)）且磷酸鹽緩沖鹽達0.050mmol/L時會生成沉淀，而且這種沉淀是逐步形成的；（3）乙腈不

21、很穩(wěn)定，易與強酸反應(yīng)，如硫酸；（4）與醇類溶劑相比，乙腈毒性較大，但在正常操作下，基本是安全的。. 如經(jīng)試用不適合時，再選用其它溶劑系統(tǒng)。如在上述二元流動相中加入少量的四氫呋喃，能夠改善某些難分離的物質(zhì)的分離度，還可加入少量有機堿類（如三乙胺等）可改善色譜峰峰拖尾現(xiàn)象。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動相，必須使用時，應(yīng)盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動相。另外，由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展狀態(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常應(yīng)不低于5%，否則C18鏈的隨機卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。.高壓輸液泵 高壓輸液泵是高效液相色譜儀中的關(guān)

22、鍵部件之一。它將洗脫液在高壓下連續(xù)不斷地送入柱系統(tǒng)，使樣品在色譜柱中完成分離過程。在高效液相色譜儀中,對高壓輸液泵的性能有如下要求： 1.流量穩(wěn)定。為使色譜過程具有良好的重現(xiàn)性,泵的輸出流量要恒定。其流量精度為1%左右。 2.輸出壓力高。由于色譜柱填料顆粒細,為使洗脫液以一定的流速流過色譜柱,泵必具有一定輸出壓力。不同的儀器，所使用的輸出壓力單位不同，最高的輸出壓力為500kg/cm2。另外,輸出壓力應(yīng)平衡,脈動小,有利于降低檢檢測器的噪音,提高信噪比和柱效。 . 3.流量范圍寬。流量可調(diào)范圍大,一般在0.0110ml/min范圍內(nèi)任選。 4.耐酸、堿緩沖液腐蝕。 5.泵體易于清洗。具有梯度洗

23、脫功能，操作方便，容易維修。. 目前在高效液相色譜儀中所采用的高壓輸液泵,按排液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵;按工作方式又可分為液壓隔膜泵、氣動放大泵、螺旋注射泵和往復(fù)柱塞泵四種。前兩種為恒壓泵,后兩種為恒流泵。 目前在高效液相色譜儀上采用最廣泛的為往復(fù)柱塞泵。. 由驅(qū)動機構(gòu)(馬達、減速器、驅(qū)動凸輪)帶動的小柱塞(34mm),在以密封環(huán)密封的液缸內(nèi)，以每分鐘數(shù)十次至一百多次的頻率作往復(fù)運動。當小柱塞自液缸內(nèi)抽出時,出口單向閥由于管路中液體的外壓力迫使它關(guān)死,液體自入口單向閥吸入液缸;當小柱塞被推入時,入口單向閥關(guān)死,液體經(jīng)壓縮自出口單向閥排出,如此周而復(fù)始,壓力逐漸上升。泵的輸出流量,可借柱塞往復(fù)

24、運動的沖程或馬達的轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)。由于泵的柱塞往復(fù)運動的頻率較高,所以對密封環(huán)的耐磨性及單向閥的剛度和精度要求很高。密封環(huán)一般采用聚四氟乙烯加添加劑材料制造,而單向閥的球、閥座及柱塞桿則用人造紅寶石材料。 . 往復(fù)柱塞泵因為它的液缸容積小,易于清洗和更換溶劑系統(tǒng),因此特別適合于梯度淋洗,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于高效液相色譜中。但由于泵體本身的結(jié)構(gòu),決定了它的輸出壓力是隨柱塞運動位置的變化而變化的,因此輸出壓力有明顯的起伏脈動。為了克服此缺點,目前儀器中使用的泵,大致用以下幾種方法減少它的壓力脈動。 采用多頭泵(二頭或二頭以上)交替聯(lián)動壓力脈動阻滯器改進驅(qū)動凸輪的幾何形狀.梯度洗脫裝置 梯度洗脫,又稱溶劑程序

25、。在色譜分離過程中,洗脫液的組成按一定的速率連續(xù)改變,其作用相當于氣相色譜中的程序升溫。由于液相色譜中洗脫液的極性變化直接影響樣品組分的保留值(或k值),因此梯度洗脫可改善復(fù)雜樣品的分離度,縮短分析周期,改善峰形和提高樣品的最小檢測量。一般在液相色譜中,梯度洗脫比程序升溫、流速程序、重復(fù)分離和聯(lián)用柱等幾種方法有效得多。梯度洗脫裝置可分為以下兩類: . 1.低壓梯度洗脫裝置 低壓梯度又稱外梯度。它是一種在常壓下洗脫液按預(yù)先規(guī)定的比例混合后,再由高壓泵輸入色譜柱,所以也稱為泵前混合。 最簡單的低壓梯度裝置。是利用兩個直角三角形容器,其幾何位置不同,兩種洗脫液的混合比例曲線也不同。由于其重復(fù)性差,現(xiàn)

26、已很少采用。 電磁比例閥的開關(guān)頻率,由控制器控制。改變控制器程序,即可得到任意混合濃度的曲線。. 2.高壓梯度洗脫裝置 高壓梯度又稱內(nèi)梯度。它是將溶劑經(jīng)高壓泵加壓后再混合的梯度洗脫裝置。常見的一種是由兩臺高壓泵、梯度程序控制器、混合器等部件組成。兩臺泵分別將兩種極性不同的溶劑輸入混合器,經(jīng)充分混合后進入色譜柱。這是一種泵后高壓混合形式。 高壓梯度所采用的泵,多為往復(fù)柱塞泵或螺旋泵。由此所獲得的流量精度高,梯度洗脫曲線重復(fù)性好。梯度洗脫的溶劑混合器應(yīng)具備容積小、無死區(qū)、清洗方便、混合效率高等性能，才能獲得重復(fù)的、滯后時間短的梯度洗脫曲線。. 3.注意事項 （1）溶劑的純度要高，否則梯度洗脫的重現(xiàn)

27、性差； （2）梯度混合的溶劑互溶性要好； （3）梯度洗脫應(yīng)使用對流動相組成變化不敏感的選擇性檢測器（如紫外吸收檢測器或熒光檢測器），而不能使用對流動相組成變化敏感的通用型檢測器（如示差折光檢測器）。.進樣系統(tǒng) 進樣系統(tǒng)是將被分析試樣導(dǎo)入色譜柱的裝置。對于液相色譜的進樣裝置，要求重復(fù)性好，死體積小，保證中心進樣,進樣時對色譜柱系統(tǒng)流量波動要小，便于實現(xiàn)自動化等。 進樣系統(tǒng)包括取樣、進樣兩個功能,而實現(xiàn)這兩個功能又分手動和自動兩種方式。.手動進樣 1.注射器進樣 這種進樣方式同氣相色譜一樣，樣品用微量注射器刺過色譜柱上端進樣器的隔膜，直接注入到與色譜柱相聯(lián)的進樣頭內(nèi)。這種進樣方式，可以獲得比其它任

28、何一種進樣方式都要高的柱效，而且價廉，結(jié)構(gòu)簡單，操作方便。但是操作壓力不能過高，進樣量有限(小于1001)，特別是進樣重復(fù)性差，只能達至12%。 若采用停流進樣方式，則無法獲得精確的保留時間，重復(fù)性也差。只是在沒有進樣閥的情況下，才采用這種進樣方式。. 2.閥進樣 采用進樣閥進樣，可以在常壓下將樣品溶液導(dǎo)入進樣閥，經(jīng)閥切換操作直接在高壓狀態(tài)下把樣品液送入色譜柱，不需要停流。進樣量由固定體積的定量管或微量注射器控制，所以重復(fù)性好。但是柱效比注射器進樣下降10%左右。 . 六通進樣閥是目前最常用的進樣閥，其結(jié)構(gòu)如下圖所示。它由閥體、閥芯、貯樣管、手柄。旋轉(zhuǎn)密封環(huán)組成，閥體和閥芯為不銹鋼制成，閥芯以

29、及用聚四氟乙烯等材料制成的旋轉(zhuǎn)密封環(huán)，由同一手柄帶動旋轉(zhuǎn)。密封環(huán)上刻有在三個互不相通的溝槽供樣品和洗脫液流動。當閥處于A位置時，樣品用注射器注入到一定容積的貯樣管中，可按進樣量大小，采用不同容積的貯樣管，然后手柄轉(zhuǎn)至圖中B位置，貯樣管內(nèi)的樣品即被洗脫液帶入色譜柱中。. 六通迸樣閥的優(yōu)點是進樣量可變范圍大，進樣量也較大，可適用于制備分離，重復(fù)性好(0.5%)，耐壓高(可達200Kg/cm2)和易于自動化。缺點是閥的死體積大，進樣后清洗麻煩，且容易引起色譜峰的展寬。另外，這種閥的結(jié)構(gòu)，為使它的高壓密封性能好，在制造時往往使旋轉(zhuǎn)密封環(huán)和閥體的配合較緊，所以操作時費力大。. 進樣閥定量環(huán)有10、20、

30、50l等規(guī)格，若要用定量環(huán)進樣，應(yīng)超體積注入樣品溶液，以保證進樣量的正確。如果樣品溶液與流動相差距較大，例如樣品溶液為甲醇，而流動相為較復(fù)雜的乙腈緩沖液系統(tǒng)，進樣后可能導(dǎo)致M峰的出現(xiàn)，可以采用將樣品溶液用流動相稀釋后以定量環(huán)進樣，或者用微量注射器定量進樣（進樣體積小于定量環(huán)體積）。.自動進樣器進樣 目前，自動進樣器也越來越多地應(yīng)用于高效液相色譜儀上，自動進樣器是在在程序控制器或工作站軟件控制下,可自動進行取樣、進樣、清洗取樣系統(tǒng)等一系列動作，并且較為先進的自動進樣器可以控制樣品架溫度，保證低溫進樣，甚至于進行程序進樣。操作者只須將樣品按順序裝入貯樣裝置，設(shè)定進樣程序即可。 .柱溫箱 柱溫箱為放

31、置色譜柱的地方，一般可以存放13根色譜柱。應(yīng)用柱溫箱可以保持色譜柱溫度，不受外界環(huán)境影響，主要表現(xiàn)為分析結(jié)果重現(xiàn)性好、提高柱效、降低柱壓、保證檢測穩(wěn)定性。較為先進的柱溫箱不但可以保持較高溫度（80100），也可以保持較低溫度（低于室溫10 ），同時可設(shè)置溫度程序控制。 .色譜柱 色譜柱是高效液相色譜儀的核心部件，要求分離度高、柱容量大、分析速度快。要達到如此好的性能，不僅與固定相本身的性能有關(guān)，而且與色譜柱結(jié)構(gòu)、裝填和使用技術(shù)等有關(guān)。 .色譜柱填充劑 反相色譜系統(tǒng)使用非極性添充劑，常用的色譜柱填充劑為化學(xué)鍵合硅膠。以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基

32、硅烷鍵合相和氨基硅烷鍵合相等）也有使用,正相色譜系統(tǒng)使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統(tǒng)使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構(gòu)體的分離通常使用手性填充劑。. 填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含炭量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響待測物的保留行為和分離效果。分析分子量小于2000的化合物應(yīng)選擇孔徑在15nm（1nm=10埃）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在30nm以上的填料。 除另有規(guī)定外，普通分析柱的填充劑粒度一般在310m之間，粒徑更?。s2m）的填充劑常用于填裝微徑柱

33、（內(nèi)徑約2mm）。.色譜柱的使用及保養(yǎng) 1.使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當?shù)恼{(diào)整。當對其測定結(jié)果產(chǎn)生爭議時，應(yīng)以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準。 2.以硅膠為載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40，為改善分離效果可適當提高色譜柱使用溫度，但不宜超過60。 . 3.流動相的pH值應(yīng)控制在28之間。當pH值大于8時，可使載體硅膠溶解；當pH值小于2時，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當色譜系統(tǒng)中需使用pH值大于8的流動相時，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包裹聚合物填充

34、劑、有機無機雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當需使用pH值小于2的流動相時，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠、有機無機雜化填充劑等。. 4.在取得一根新的色譜柱時，應(yīng)先閱讀使用說明。 5.供試品溶液應(yīng)用0.45m甚至更小孔徑的微孔濾膜過濾，同時應(yīng)盡可能在色譜柱前使用預(yù)柱（微徑柱必須使用），可保證供試品溶液中微粒不進入色譜柱，延長色譜柱壽命。. 6.試驗過程中，應(yīng)避免流動相組成及極性的劇烈變化。 7.試驗后，應(yīng)用適當溶劑沖洗色譜柱，尤其是含有緩沖鹽的流動相，應(yīng)先用含少量有機試劑的水溶液沖洗，再逐步置換到保存色譜柱用有機溶劑。

35、色譜柱沖好后，應(yīng)用柱塞密封保存，同時注意保存溫度。. 8.色譜柱常見毛病為柱壓增高，柱效降低，此時應(yīng)進行色譜柱維修，一般說明書中會提供色譜柱再生方法，按其操作即可；或者將色譜柱反沖一定時間，若柱壓仍不下降，可將色譜柱進口處篩板拆下，用5%稀硝酸超聲處理10分鐘后再換用純水超聲處理10分鐘，同時用相應(yīng)的固定相修補柱頭，最后將篩板裝回即可。如果是因為流動相pH值及組成不合適造成固定相流失引起的毛病，則色譜柱基本無法修復(fù)。 .檢測器 高效液相色譜法具有高效、高速、高靈敏度的特點。微量組分經(jīng)色譜柱分離后的檢測既不能用人的肉眼也不能分段取樣后用儀器檢測，只能采用檢測器在色譜柱后直接檢測。樣品組分洗脫液中

36、的濃度或物理量變化，由檢測器連續(xù)地轉(zhuǎn)換成電信號，在記錄儀上迅速地給出直觀的信息。操作者可按照所描繪的色譜峰位置來定量地判斷分離情況的優(yōu)劣,并根據(jù)峰面積定量地測定各組分的含量。. 最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器、其他常見的檢測器有熒光檢測器、示差折光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。. 紫外、熒光、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與待測溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散檢測器對結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與待測物的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收

37、光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。. 紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測器的響應(yīng)值與供試品的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進行計算時，一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換。 . 不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應(yīng)符合紫外可見分光光度法項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應(yīng)考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)鹽組分的流動相。.餾分收集器 如果所進行的色譜分離不是為了純粹的色譜分析，而是為了做了其他波譜鑒定,或獲得少量試驗樣品的小型制備，餾分

38、收集是必要的。用小試管收集、手工操作，只適合于少數(shù)幾個餾分，手續(xù)麻煩，易出差錯。餾分收集器比較理想，因為便于用微處理機控制，按預(yù)先規(guī)定好的程序，或按時間，或按色譜峰的起落信號逐一收集和重復(fù)多次收集。.數(shù)據(jù)采集及處理 把檢測器的信號轉(zhuǎn)換為色譜圖，一般采用色譜積分儀及色譜工作站進行。積分儀較為簡單，可以設(shè)定積分參數(shù)，記錄保留時間、峰號以及峰面積，但是分離度和理論板數(shù)需手工計算，偏差較大；積分儀可儲存少量色譜圖，但關(guān)機后儲存的色譜圖即不再保存；積分儀記錄介質(zhì)多為熱敏紙，保存時間較長后顏色消退，需另行復(fù)印后保存。. 目前大部分高效液相色譜儀數(shù)據(jù)采集多用色譜工作站。較為簡單的色譜工作站一般為國內(nèi)開發(fā)，價

39、格較為便宜，但只能進行數(shù)據(jù)采集，色譜條件只能由儀器設(shè)定。相對于積分儀來說，由于使用計算機控制，色譜圖比較一目了然，改變積分參數(shù)后，可清晰看出色譜圖的變化；可以進行分離度、理論板數(shù)等簡單計算。. 較為先進的色譜工作站一般為購買儀器時同時購買，價格較為昂貴，但是功能強大，可用來控制整個儀器的運轉(zhuǎn)，從設(shè)定色譜條件、控制進樣、處理色譜圖直至計算含量結(jié)果均可由工作站完成。色譜工作站作為軟件安裝在計算機上，通過計算機硬盤或者刻成CD、DVD光盤保存，理論上可永久保存，色譜圖亦可通過打印機打印出來后保存。. 需要注明的是，采用高效液相色譜法測定樣品時，各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組成、檢測器類型

40、不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、載體粒度 、流動相流速、混合流動相各組成的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應(yīng)具體的色譜系統(tǒng)并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。對于必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項下注明。.第四節(jié) 檢測方法.紫外檢測法 紫外檢測法是高效液相色譜中最常用的檢測方法。由于有機化合物中近百分之八十都具有紫外吸收，因此紫外檢測器的應(yīng)用最早也最廣。這種檢測器具有很高的靈敏度，對環(huán)境溫度及流速波動不甚敏感，適用于梯度洗脫操作。但是紫外檢測器一次只能得到一個波長的色譜圖，而二極管陣列檢測器可以采集三維圖譜，針對每一個色譜峰可以進行光譜掃描，進行峰

41、純度測定。.熒光檢測法 在液相色譜中，熒光檢測法的應(yīng)用僅次于紫外吸收檢測法。熒光檢測法最吸引人的特點是它固有的靈敏度和選擇性。它的最小檢測限往往要比紫外檢測法低一個數(shù)量級以上；選擇性也優(yōu)于紫外檢測法或至少一樣。但是熒光檢測法不如紫外檢測法應(yīng)用那么廣泛，因為能產(chǎn)生熒光的化合物比較有限。許多生物物質(zhì)包括某些代謝產(chǎn)物、藥物、氨基酸、胺類、維生素等，都可用熒光檢測法檢測。有些化合物本身不產(chǎn)生熒光，但卻含有適當?shù)墓倌軋F，可與熒光試劑發(fā)生反應(yīng)生成熒光衍生物，這時就可用熒光檢測法檢測。. 許多化合物存在光致發(fā)光現(xiàn)象，即它們可被入射光(稱激發(fā)光)所激發(fā)，并再發(fā)出波長相同的共振輻射或波長較長的特征輻射，即熒光。被這些化合物所吸收的紫外光稱為激發(fā)光，產(chǎn)生的熒光稱為發(fā)射光。熒光檢測器，是在樣品的激發(fā)波長處測量發(fā)射光的強弱。當被分析的樣品濃度足夠低時，熒光強度與入