免疫組織化學(xué)染色和凋亡檢測(cè)技術(shù)概述

1、免疫組織化學(xué)染色和凋亡檢測(cè)技術(shù)概述第一節(jié) 常規(guī)組織學(xué)染色技術(shù)概述 宏觀 微觀 超微結(jié)構(gòu) 基因水平 組織形態(tài)學(xué)研究技術(shù)的種類： 一、病理大體組織標(biāo)本的染色方法 在標(biāo)本制作中，為了某種特殊目的，突出顯示標(biāo)本的重要部分，借助組織切片的特殊染色方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染色，將病變器官及不同組織成分用染料染成不同的顏色，以便于區(qū)分大體標(biāo)本的不同成分和病變特點(diǎn)，如： 脂肪組織染色法 目的：主要用于心、肝、腎脂肪變性，動(dòng)脈粥樣硬化大體標(biāo)本的染色 試劑：蘇丹或蘇丹 結(jié)果：病變處脂肪組織呈橙黃色 早期心肌梗死染色法 目的：顯示早期心肌梗死的區(qū)域 試劑：0.1% NBT(硝基四唑藍(lán)) / 0.2 mol / L PBS (

2、pH 7.6) 方法：將2-3 mm 厚新鮮心肌大片放入試劑中，37 C 孵育20 min。 結(jié)果：正常心肌呈藍(lán)色，早期心肌梗死區(qū)、纖維結(jié)締 組織、瘢痕組織呈淺藍(lán)色或不顯色。 注意 ：新鮮標(biāo)本，尸檢心肌不超過(guò)6小時(shí)。 二、光學(xué)顯微鏡下的組織學(xué)染色方法常規(guī)HE染色（hematoxylin and eosin staining）組織學(xué)特殊染色 1. Mallory 三染色、Masson三染色 2. 神經(jīng)纖維的鍍銀染色 3. 其他的特殊染色，包括鈣、鐵、鉛、銅、黑色素和脂褐素、細(xì)胞DNA和RNA的染色等 上述的各種染色方法只能在細(xì)胞水平上顯示組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)改變。三、超微結(jié)構(gòu)的觀察光線波長(zhǎng)的限制，光學(xué)

3、顯微鏡的分辨率極限為m 有效放大倍數(shù)最高不超過(guò)2000倍。電鏡的分辨率最佳可達(dá)m，放大倍率最高可達(dá)100萬(wàn)倍。 第二節(jié) 免疫組織化學(xué)染色技術(shù) Immunohistochemical technique 該技術(shù)主要是用于研究和觀察細(xì)胞中的某些結(jié)構(gòu)或分子物質(zhì)和組織細(xì)胞間的成分，因此現(xiàn)又稱為免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。 根據(jù)標(biāo)記物的不同，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)可分為： 1. 免疫酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 2. 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 3. 免疫鐵蛋白技術(shù) 4. 免疫金-銀細(xì)胞化學(xué)技術(shù) 5. 免疫電子顯微鏡技術(shù)一、免疫組織化學(xué)染色方法的原理抗原（antigen） 1. 定義：是一類在適合條件下能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能

4、與免疫應(yīng)答產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)（抗體和效應(yīng)細(xì)胞）在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)?？乖哂袃煞N性能： （1）免疫原性（immunogenicity） 指抗原分子具有誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的特性。 （2）反應(yīng)原性（reactogenicity）指抗原分子與抗體或效應(yīng) T 細(xì)胞等免疫應(yīng)答產(chǎn)物發(fā)生特異性反應(yīng)的特性。2. 抗原的分類 完全抗原、半抗原免疫學(xué)分類 胸腺依賴抗原與非依賴抗原 外源性抗原：微生物、花粉等 內(nèi)源性抗原：隱蔽的自身抗原、腫 瘤相關(guān)抗原等臨 床 分 類 同種異型抗原：人類白細(xì)胞抗原、 血型抗原 異嗜性抗原：人與其他動(dòng)物、植物 等之間存在的共同抗原抗體（antibody） 1. 定義：機(jī)

5、體受到抗原刺激后，通過(guò)體液免疫應(yīng)答，B淋巴細(xì)胞活化、增殖，分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的球蛋白，稱為抗體。 大部分抗體電泳后位于區(qū)帶，1972年國(guó)際免疫學(xué)聯(lián)合會(huì)正式將化學(xué)結(jié)構(gòu)相同或相似的一類球蛋白分子統(tǒng)一命名為免疫球蛋白(immunoglobin，Ig)。 2. 抗體的種類: 五類，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM 免疫組織化學(xué)染色技術(shù)中，使用的抗體主要是IgG，個(gè)別情況下使用IgG的亞型，多為IgG1。免疫組織化學(xué)染色的反應(yīng)原理及顯色原理 1. 免疫組織化學(xué)染色的反應(yīng)原理 染色反應(yīng)的最基本原理是抗原抗體的反應(yīng)。 通過(guò)對(duì)針對(duì)標(biāo)本中相應(yīng)抗原的抗體上標(biāo)記某種發(fā)

6、色劑或酶類，再通過(guò)激發(fā)發(fā)色劑或使用某種顯色劑，在顯微鏡下使標(biāo)本中抗原抗體反應(yīng)的部位產(chǎn)生肉眼可觀察到的顏色，以確定所要檢測(cè)的抗原是否存在。 通過(guò)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)，在光學(xué)顯微鏡下即可檢測(cè)到所要研究的蛋白分子類物質(zhì)的存在與否。2. 免疫組織化學(xué)染色的顯色原理 (1) 基本原理 熒光標(biāo)記或酶標(biāo)抗體的染色分為直接法和間接法。其中以酶標(biāo)抗體法應(yīng)用最為廣泛。 直接法：是將酶直接標(biāo)記在第一抗體上，用酶標(biāo)抗體與切片上待檢測(cè)的組織或細(xì)胞中抗原反應(yīng)，再用底物顯色，顯示出所檢測(cè)的目的抗原的部位。 間接法：是將酶標(biāo)記在第二抗體或與第二抗體具有親和性的某種分子上，檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的特異性抗原物質(zhì)。 間接法中所用的一抗

7、是針對(duì)組織或細(xì)胞中某種抗原的特異性抗體，多數(shù)抗體是由家兔制備的多克隆抗體或由小鼠制備的單克隆抗體。 第二抗體是第一抗體的抗體，所以只要不同的第一抗體均來(lái)自同一種屬動(dòng)物，與標(biāo)記的第二抗體結(jié)合就能用來(lái)顯示不同特異性抗原的存在。這樣可避免直接法中標(biāo)記每一種第一抗體的麻煩。 通過(guò)某種技術(shù)增加第二抗體上標(biāo)記酶的含量，可提高免疫組織化學(xué)染色的敏感度。 IHC技術(shù)中，絕大多數(shù)以間接法為常用。（2）顯色的基本程序 1抗孵育切片或細(xì)胞涂片 2抗（酶標(biāo)抗體）孵育切片 發(fā)色劑顯色 （核復(fù)染）（3）酶標(biāo)抗體法的顯色原理及顯色劑 辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） HRP + H2O

8、2 HRP H2O2 HRP H2O2 + DH2 HRP + D + 2H2O HRP催化的酶促反應(yīng)第一步是特異的，其余反應(yīng)是非特異的，因此，可選用各種供氫體作為顯色劑，可使反應(yīng)的終產(chǎn)物呈現(xiàn)不同的顏色，如： CN（4-chloro-1-naphthol）為藍(lán)色 TMB（tetramethyl- benzidine）為深藍(lán)色 AEC（3-amino-9-ethyl-carbazole）為紅色 DAB（3，3-diamino benzidine）為棕色堿性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 以AS-Mx（色酚AS-MX磷酸鹽）為底物，F(xiàn)B/FR (Fast blue/

9、Fast red)為發(fā)色劑，生成藍(lán)色 / 紅色不容性沉淀物。 ALP標(biāo)記的抗體主要用于內(nèi)源性過(guò)氧化物酶含量較高的血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等的ICC染色。 由于組織細(xì)胞內(nèi)含有內(nèi)源性ALP，在顯色液中需加入終濃度為2-4mol/L的左旋咪唑 (levamisole)，大多數(shù)內(nèi)源性ALP活性可被抑制。葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase，GOD ) 以葡萄糖為底物的酶，其顯色方法為-D-葡萄糖67mg、 PMS(吩嗪硫酸甲酯、，37C孵育1小時(shí)，生成藍(lán)色不溶性沉淀物，該終產(chǎn)物不溶于有機(jī)溶劑，切片可經(jīng)脫水、透明后封片，長(zhǎng)期保存。 （4）核復(fù)染 在顯色后，特別是用DAB顯色后，切片可用蘇木素染料進(jìn)行核

10、復(fù)染，經(jīng)水化后細(xì)胞核顯示藍(lán)色，與胞質(zhì)中的DAB棕色形成對(duì)比。但用AEC顯色后不能用蘇木素做核復(fù)染，因?yàn)榕渲铺K木素染料中使用酒精作為介質(zhì)，可使AEC的紅色終產(chǎn)物褪色，且AEC顯色后只能用水溶性封固劑封片。第三節(jié) 免疫組織化學(xué)染色步驟（一）ABC或SP法進(jìn)行石蠟切片染色的主要步驟 1. 組織材料的采??； 2. 組織塊的固定； 3. 組織塊的脫水、透明及石蠟包埋； 4. 石蠟切片的制備； 5. 石蠟切片的脫蠟及水化； 6. 抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性； 7. PBS洗滌切片； 8. 抗原修復(fù)或蛋白酶消化切片，修復(fù)或暴露抗原； 9. PBS洗滌切片；10.用與二抗來(lái)源相同的動(dòng)物非免疫正常血清（或同時(shí) 加

11、入BSA）孵育切片，防止抗體的非特異性吸附；11. 用特異性一抗(單克隆、多克隆)孵育切片；12. PBS（可加入Tween 20#，PBST）洗滌切片；13. 用針對(duì)一抗的生物素化的二抗孵育切片；14. 用PBS或PBST洗滌切片；15. 滴加SP試劑或ABC試劑；16. PBS或PBST洗滌切片；17. DAB或AEC顯色；18. 自來(lái)水洗滌切片，終止顯色；19. 用蘇木素做核復(fù)染；20. 切片脫水、透明，樹(shù)膠封片。（二）各染色步驟的具體操作及注意事項(xiàng)1. 組織材料的采取 活檢組織 手術(shù)切除標(biāo)本 尸檢標(biāo)本 實(shí)驗(yàn)組織或培養(yǎng)細(xì)胞 活檢組織：宮頸、鼻咽、口腔、喉、皮膚和內(nèi)窺鏡鉗取的組織 體積小，

12、因活檢鉗直接鉗取，常受壓過(guò)度而變性。因此， 活檢鉗的刃口必須銳利，以免組織受壓，活檢時(shí)應(yīng)采取主要的病灶區(qū)。 抗原在組織中的分布不均一，故病灶較大的切除標(biāo)本應(yīng)考慮切取主要病灶。病灶與正常組織交界區(qū)及遠(yuǎn)距病灶的正常區(qū)。組織標(biāo)本 尸檢組織 由于取材時(shí)一般均已超過(guò)死亡后2小時(shí)以上，組織有不同程度自溶，其抗原或變性消失或有嚴(yán)重的彌散現(xiàn)象。法醫(yī)尸檢一般多在24小時(shí)以上，甚至數(shù)月后，檢材受死后變化影響嚴(yán)重，而影響染色結(jié)果。手術(shù)切除的組織較新鮮，取材后應(yīng)立即固定，以保存組織結(jié)構(gòu)和抗原。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)本 新鮮，按需要取材；很多情況下是在灌流固定后取材，組織結(jié)構(gòu)和抗原保持良好，非常適用于免疫組織化學(xué)染色。取材標(biāo)本的大

13、小 尸檢組織材料大小以1cm1cm0.2cm 為宜。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常用大鼠或小鼠，其臟器體積小，有利于取材。一般標(biāo)本體積不宜過(guò)大，防止固定不透，影響抗原的保存，也浪費(fèi)試劑。 2. 組織塊的固定、水洗（1）固定液：種類較多，常用的有以下2種： 4% 甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法： 10 ml 40% 甲醛 (formalin) + 90ml PBS 使用新鮮甲醛，久存甲醛可分解，形成白色沉淀(多聚甲醛)，還可形成甲酸，影響染色結(jié)果。 4% 多聚甲醛/PBS (pH 7.2-7.4) 配制方法：40g多聚甲醛(paraformaldehyde)+500 ml 0.1 mol/L PB

14、 (pH 7.2-7.4)，攪拌、加熱至60 C，同時(shí)滴入1N NaOH 至溶液完全透明。冷卻后用1N HCl 調(diào)PH 值至，再用將溶液加至1000ml。 固定時(shí)間：一般根據(jù)組織塊大小及性質(zhì)，固定2-24小時(shí)。 固定原理：甲醛通過(guò)使蛋白分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生固定作用。 甲醛與蛋白質(zhì)中的許多氨基酸反應(yīng)，并能保存脂類和類脂體。 不利作用：甲醛使組織中蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，使所檢測(cè)的 抗原決定簇被封閉，影響抗原抗體的結(jié)合。（2）水洗 沖洗時(shí)間與標(biāo)本的種類、組織塊的大小和固定時(shí) 間長(zhǎng)短有關(guān)。尸檢組織和大動(dòng)物組織一般沖洗24 小時(shí)，小動(dòng)物組織沖洗210小時(shí)。 新鮮標(biāo)本固定時(shí)間短，沖洗時(shí)間也相應(yīng)縮短，固 定時(shí)間長(zhǎng)

15、的標(biāo)本，沖洗時(shí)間也需延長(zhǎng)。 沖洗時(shí)組織放在廣口瓶中，瓶口用紗布罩好并扎 緊，防止組織塊漏出。用一根適當(dāng)?shù)哪z管，一端 接自來(lái)水，一端插入瓶底，使水緩慢流出，或?qū)?組織塊放入洗滌筐中，放在水盆內(nèi)沖洗。 對(duì)于過(guò)小組織或穿刺組織和小動(dòng)物組織多次換水 浸泡即可。3. 組織塊的脫水、透明、浸蠟和包埋（1）脫水 脫水劑：酒精、丙酮、異丙醇、正丁醇，最常用酒精。 酒精可以與水以任何比例混合，脫水能力強(qiáng)，并可硬化組織。酒精對(duì)組織的穿透速度很快，對(duì)組織有較明顯的收縮作用。為避免組織過(guò)度收縮，應(yīng)從低濃度開(kāi)始，然后再依次增加其濃度。在常溫下或4 C下進(jìn)行，以減少抗原的損失。 70% 80% 90% 95% 100%

16、100% （2）透明 為使石蠟?zāi)芙虢M織塊，組織經(jīng)脫水后，必須經(jīng)過(guò)一種既能與酒精相溶，又能溶解與石蠟相溶。通過(guò)溶劑的媒介作用而達(dá)到石蠟浸入組織塊的目的。 透明劑：二甲苯、苯、甲苯、氯仿等，最常用 二甲苯。 一般經(jīng)過(guò)23次純二甲苯溶液透明，每次10 15分鐘，同時(shí)應(yīng)根據(jù)組織的種類和組織塊大小以及二甲苯的新鮮程度加以調(diào)整，不應(yīng)機(jī)械照搬。（3）浸蠟 組織塊經(jīng)透明后在熔化的石蠟內(nèi)浸漬的過(guò)程稱浸蠟。 為使石蠟充分滲入組織中，常需經(jīng)過(guò)23次石蠟浸漬。 用于免疫組織化學(xué)染色的組織塊浸蠟應(yīng)使用低熔點(diǎn)蠟，在60 C以下浸透。（4）包埋 浸蠟后的組織塊放入包埋盒中，將熔化的石蠟到入包埋盒，冷卻后取出，修塊。4.

17、石蠟切片的制作（1）載玻片涂片的制作 防脫片劑：3-氨基丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxy silane, APES）、多聚賴氨酸（Poly-L-lysine）、甲醛-甘油明膠。 APES 涂片的制作 原理：APES是一種新型玻片粘附劑，與一般的粘附劑不同，它是通過(guò)對(duì)玻璃表面起化學(xué)修飾作用，改變其表面的化學(xué)物理特性，使組織切片牢固地貼于玻璃片上，不易脫落，保留時(shí)間較久。 具體操作方法： 將載玻片用酸處理后，用95%酒精浸泡，再用綢布擦干，清除表面的污漬； 將干凈的載玻片放入丙酮內(nèi)5min； 將載玻片用鑷子夾住浸入APES試劑（1ml APES+50ml丙酮）1 2次

18、； 純丙酮內(nèi)洗2次后，37 C過(guò)夜，干燥； 用鋁箔包好，室溫下存放，可存放半年。 多聚賴氨酸（Poly-L-lysine，PLL） 試劑配制：PLL 0.5g + 蒸餾水 100 ml 也可根據(jù)提供的方法配制。可于4 C或20C 保存?zhèn)溆?，可反?fù)凍存，效果無(wú)明顯影響。 涂片前將其稀釋10 50倍，均勻涂在處理后干凈的載玻 片上，37 C下干燥過(guò)夜。甲醛-甘油明膠 試劑：40%甲醛 ，明膠，蒸餾水加至100ml。 配制方法：用一部分蒸餾水（約80ml）加熱溶解明 膠，待完全溶化后加入甲醛，最后補(bǔ)充蒸餾水至 100ml，混勻即可。 粘附切片的效果較上述兩種方法差，特別是切片經(jīng)抗原熱修復(fù)或酶消化后，

19、有時(shí)易脫片。（2）制做切片 切片機(jī)：旋轉(zhuǎn)式或滑動(dòng)式切片機(jī)。 切片厚度：5-7m。 展片：切片放入玻璃平皿中的溫水中展 開(kāi)切片（水浴鍋上加熱平皿）。 撈片：用涂有防脫片劑的載玻片撈取切片。 切片干燥： 37 C過(guò)夜，干燥。 5石蠟切片的脫臘及水化 脫蠟：將切片放入染色筐中，二甲苯 、 各15分鐘脫臘， 水化：100%酒精、中各10分鐘、95% ALC 5分鐘、90% ALC 5分鐘、80% ALC 5分鐘、70% ALC 5分鐘，蒸餾水浸洗。6清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性 由于常規(guī)免疫組織化學(xué)染色的最后顯色是用辣根過(guò)氧化物酶 (horseradish peroxidase, HRP)和DAB (3,

20、 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride)，而組織中常含有內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，為防止出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)和減少背景染色，需要先清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。 染 色 框 具體方法：將切片置入甲醇(PBS)-H2O2 液中2030分鐘 試劑：純甲醇 99 ml 30%+H2O2 1ml 充分混勻，使最后濃 度為0.3%，或0.01ml PBS (pH 7.27.4) 99ml + 30% H2O2 1ml7PBS洗滌切片 經(jīng)甲醇H2O2或PBSH2O2 處理后的切片先用蒸餾水洗一次5min，再用PBS洗5min3次。 0.01mol/L PBS (pH7.27.4) 的配

21、制： NaH2PO4 2H2O 0.45 g Na2HPO4 12H2 蒸餾水 加至1000 ml 為防止抗體與組織發(fā)生靜電吸附而產(chǎn)生非特異性染色，可在PBS中加入Tween 20#，制成含0.1% Tween 20# 的PBS。Tween 20# 為一種除污劑，可清除和封閉組織中的靜電荷。 8抗原修復(fù)（antigen retrieval, AR） 某些抗原的免疫組化染色不需要此步驟即可染色，如橫紋肌中的myoglobin (Mb)、actin、myosin、腦組織中的S-100蛋白、GFAP、血型抗原A、B、H、生長(zhǎng)激素(growth hormone)、胰島素、波形蛋白(vimentin)、

22、降鈣素(calcitonin)等。但有一部分抗原物質(zhì)或檢測(cè)的因子等由于組織經(jīng)甲醛固定后，因蛋白質(zhì)的交聯(lián)，將抗原封閉或發(fā)生變性，因此需要熱修復(fù)或蛋白酶消化。 目前機(jī)理不清楚，但是以高溫、高壓對(duì)常規(guī)固定的石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)處理經(jīng)驗(yàn)表明，可以提高抗原抗體陽(yáng)性檢測(cè)率，同時(shí)也會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。尤其對(duì)原來(lái)僅表達(dá)在冰凍切片上的抗原，經(jīng)抗原修復(fù)后大部分抗體能用于常規(guī)甲醛固定的石蠟切片上。 （1）抗原熱修復(fù) 方 法 微波中 96 1020 min 直接加熱法 100 10 min 高壓鍋 / 消毒鍋 120 10 min 其他：水浴鍋 100 10 min2 及真空加熱 10 min 等。 熱修復(fù)的介質(zhì) 0.01

23、 mol/L pH 6.0 檸檬酸緩沖液 0.05 mol/L Tris-HCl 緩沖液 (pH 112) 0.01 mol/L pH 7.0 PBS 2 % 硫酸鋁 2 % 硝酸鉛 生理鹽水 蒸餾水 溶液的摩爾濃度對(duì)修復(fù)效果無(wú)任何影響，而pH值則影響較大，緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCl緩沖液較常用。 溫度與修復(fù)時(shí)間的關(guān)系： 許多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：溫度高修復(fù)時(shí)間短，如Ki-67和P-gp的檢測(cè)，利用同一切片，達(dá)到相同染色結(jié)果需要： 100 20min； 90 30min； 80 50min； 70 20h 操作流程 微波處理：將切片插入25 片塑料架上，在250 ml塑盒內(nèi)加入200 m

24、l緩沖液，將微波高檔加溫緩沖液至90+，取出后自然冷卻至室溫后蒸餾水洗，PBS洗。 水浴鍋法：一種傳統(tǒng)的抗原修復(fù)方法，首先調(diào)節(jié)水溫達(dá) 95左右，將切片置入內(nèi)含200ml緩沖液的塑料盒或燒杯內(nèi)，放入水浴鍋，溫度平衡后開(kāi)始計(jì)算時(shí)間20 min，取出容器后自然冷卻到室溫。 壓力鍋法：不銹鋼高壓鍋內(nèi)加入一定量的緩沖液，加熱鍋使液體煮沸，將切片加入切片架并置入鍋內(nèi)，蓋上鍋蓋，不加閥，開(kāi)始冒氣計(jì)時(shí)50 min，關(guān)閉氣閥，使之加壓10 min。再將壓力鍋置于流水槽中沖洗10 min，冷卻后取出切片，PBS洗。 最佳修復(fù)方法的選擇 選擇最佳的修復(fù)方法設(shè)計(jì)表 檸檬酸 Buffer pH 12 pH 6 pH 1

25、0-11Tris-HCl Buffer pH 12 pH 7-8 pH 10-11微波100 10min2 slide 1 slide 2 slide 3壓力鍋120 10min slide 4 slide 5 slide 6微波或水浴90 30min slide 7 slide 8 slide 9 slide 10 作對(duì)照，不作任何處理 抗原熱修復(fù)應(yīng)注意的問(wèn)題 有些抗體在石蠟或冰凍切片上呈陰性反應(yīng)，但石蠟切片用抗原修復(fù)后卻能很好顯示，對(duì)某些應(yīng)表達(dá)在胞漿或膜上的抗原，經(jīng)修復(fù)后，絕大部分表達(dá)在核內(nèi)。而有些表達(dá)在核內(nèi)的抗原經(jīng)修復(fù)后會(huì)出現(xiàn)在胞漿內(nèi)，因此，在使用該方法時(shí)一定要小心，對(duì)結(jié)果的判定也要做出

26、客觀的分析，同時(shí)在操作過(guò)程中還注意以下問(wèn)題： 熱處理后應(yīng)自然冷卻切片。 不能煮干修復(fù)液。 不要任何抗原的檢測(cè)都使用該方法。 一批抗原的檢測(cè)其溫度和時(shí)間應(yīng)保持一致。 一般經(jīng)高溫修復(fù)后胞漿無(wú)明顯的破壞，但對(duì)細(xì)胞核的影響較大，會(huì)出現(xiàn)核破裂，蘇木素淡染現(xiàn)象。 如果在常用的緩沖（修復(fù)）液中無(wú)法實(shí)現(xiàn)抗原修復(fù)，得不出好的染色結(jié)果，或經(jīng)修復(fù)后，抗原定位發(fā)生改變，可改用一些不常用的緩沖液或加一些鰲合劑，如EDTA或EGTA等可能取得較好的效果。 （2）蛋白酶消化法 原理：蛋白酶消化可以去除覆蓋在抗原決定簇表面的雜蛋白，更為重要的是因甲醛固定而引起的交聯(lián)被酶消化打開(kāi)而引起暴露抗原決定簇的作用，使第一抗體能與抗原部

27、分結(jié)合，提高陽(yáng)性檢測(cè)率。 注意事項(xiàng)：用于IHC切片消化的酶有多種，所選擇酶的種類、使用的濃度、pH值、消化時(shí)間及溫度等均要視組織固定的不同、所檢測(cè)抗原的性質(zhì)、組織類型的不同而異，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。 常用的消化酶類： 胰蛋白酶和蛋白酶K：檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原切片的消化，如 Keratin、CEA、GFAP等。 胃蛋白酶：細(xì)胞間質(zhì)抗原檢測(cè)切片的消化，如纖連蛋白 (fibronectin)，各型膠原等。 消化時(shí)間及溫度：一般消化時(shí)間與組織固定的長(zhǎng)短呈正比。蛋白酶的消化時(shí)間51020min，視切片固定時(shí)間的長(zhǎng)短而定。（3）酶消化液的配制 除了商業(yè)銷售的成品，可按說(shuō)明書(shū)使用外，還可自行配制。 0.1% 胰蛋白酶

28、 胰蛋白酶 0.1% 氯化鈣 (pH 7.8) 100 ml 配制方法：先配制0.1%的CaCl2，用的NaOH將其pH調(diào)至，然后加入胰蛋白酶，溶解之。用前將胰蛋白酶液過(guò)濾，并在水浴中預(yù)熱至37，室溫下消化時(shí)間530min，多用于細(xì)胞內(nèi)抗原的暴露。 0.4 % 胃蛋白酶 胃蛋白酶 400 mg 0.1N HCl 100 ml 多用于間質(zhì)組織免疫組化染色切片的消化， 37下消化時(shí)間約30 min。 0.06 % 蛋白酶K 蛋白酶K 0.06 g 0.05mol/L Tris-HCl (PH7.5) 100 ml 用法同上。 在免疫組化染色中，有時(shí)經(jīng)過(guò)度固定的標(biāo)本，影響一抗與抗原的結(jié)合，用蛋白酶溶

29、液消化，起到暴露抗原部分的作用。消化時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同組織而異?？傊诒３纸M織形態(tài)不破壞的前提下，宜盡量消化時(shí)間延長(zhǎng)。以上三種酶消化液，以第一種最為常用。 9. 經(jīng)熱修復(fù)抗原或蛋白酶消化的切片經(jīng)洗滌后進(jìn)行下一步。10. 用與制備二抗相同的動(dòng)物非免疫血清孵育切片防止一抗的非特異性吸附。 組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽(yáng)性染色稱為非特異性背景染色。 最常見(jiàn)的原因是蛋白 (第一抗體) 吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上。 最有效的方法是在用第一抗體孵育切片前，用與制備第二抗體相同動(dòng)物的非免疫血清封閉組織上帶電荷基團(tuán)，而除去與第一抗體的非特異性結(jié)合 (在室溫下進(jìn)行)。 非免疫血清的稀釋度1:51:20，還可

30、加入BSA (bovine serum albumin) 使稀釋后的非免疫血清中含0.16%的BSA，可取得更佳的染色效果，阻止非特異性背景染色。該方法是減少非特異性背景染色的有效方法。 11用特異性一抗孵育切片 研究組織細(xì)胞中的某種抗原是否存在，應(yīng)用免疫組化染色，就要選用針對(duì)這種抗原的特異性抗體。現(xiàn)在國(guó)際上有許多公司生產(chǎn)免疫組化試劑，包括一抗、二抗、顯色劑，并制成了成套的試劑盒，但一般試劑盒中不包括一抗，研究者可根據(jù)一抗的種屬性，選擇含有與一抗相匹配的二抗的試劑盒。 一抗的種屬來(lái)源 一抗可來(lái)源于各種種屬的動(dòng)物，常見(jiàn)是來(lái)自家兔、山羊或小鼠，偶見(jiàn)來(lái)自馬。一般來(lái)自家兔和山羊的一抗都是多克隆的IgG

31、抗體，而來(lái)自小鼠的多是單克隆的IgG抗體。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或標(biāo)本種屬的不同，選擇針對(duì)大鼠、小鼠或人的抗體。 抗體劑型及滴度檢驗(yàn) 我國(guó)現(xiàn)在使用的多數(shù)抗體等試劑是由國(guó)外進(jìn)口，包括一抗和含二抗的試劑盒。 國(guó)外生產(chǎn)的一抗一般濃度都是100-200g/ml，但國(guó)內(nèi)各經(jīng)銷商將進(jìn)口的原裝抗體又進(jìn)行了分裝，如分成瓶等，也經(jīng)銷1ml/瓶抗體，價(jià)格各不相同。 國(guó)內(nèi)各經(jīng)銷商又根據(jù)需要將進(jìn)口抗體進(jìn)行稀釋，銷售的品種又分為即用型和濃縮型(進(jìn)口原裝的抗體)兩種。 在免疫組化染色中，使用即用型一抗和試劑盒一般不需稀釋，直接在切片上滴加即可。 濃縮型必須在稀釋后才能使用，因?yàn)闈饪s型抗體濃度高，可引起嚴(yán)重的非特異性染色，因此，必須

32、在正式染色前先用切片對(duì)不同滴度的抗體染色效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，選擇濃度強(qiáng)度最好，非特異性反應(yīng)（背景染色）最低的抗體稀釋度來(lái)進(jìn)行正式染色。 一抗稀釋滴度的評(píng)價(jià)切片編號(hào) slide 1 slide 2 slide 3 slide 4 slide 5抗體稀釋度 1: 50 1: 100 1: 200 1: 400 1: 800特異性染色 + + + + + + + + + + + + + + +背景染色 + + + + + 一抗體的稀釋 一般稀釋一抗的液體與洗滌切片的液體相同，即 ，為進(jìn)一步保證減少背景染色，用于稀釋一抗的PBS中也應(yīng)加入制備二抗的同種動(dòng)物的非免疫正常血清，有條件的還可加入BSA，兩者的濃度

33、在1 2 5% 即可。 一抗的孵育時(shí)間及條件 加入適當(dāng)稀釋的一抗的切片，可在常溫下或37下保溫盒內(nèi)孵育。經(jīng)過(guò)正常二抗同種動(dòng)物非免疫血清孵育后的切片不能用PBS洗滌，在去除多余的非免疫血清后，直接向切片上滴加稀釋好的第一抗體。孵育時(shí)間：30-60分鐘或更長(zhǎng)。 如果待檢的抗原量很少，而增加一抗的濃度又能引起較明顯的背景染色，可增加一抗的稀釋倍數(shù)，將切片放在保濕盒中置于4冰箱內(nèi)過(guò)夜孵育，可達(dá)到滿意的效果。 保 濕 盒12PBS洗滌切片 將用一抗孵育后的切片用PBST洗滌3次，每次5min，用冷PBS洗滌，可減少非特異性反應(yīng)。13用針對(duì)一抗的生物素化二抗孵育切片 根據(jù)一抗的種屬來(lái)源，選擇相應(yīng)的二抗。如

34、：一抗是家兔抗某種抗原抗體，二抗一般選用山羊抗家兔IgG抗體。二抗分濃縮型和即用型兩種。即用型二抗不需稀釋，直接使用。濃縮型者一般用PBS直接以1: 200400倍稀釋使用，室溫下保濕盒內(nèi)孵育30 60min。 試劑盒：濃縮型或即用型 SP試劑盒、ABC試劑盒 試劑盒中包含：內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑 二抗的同種動(dòng)物非免疫血清 生物素標(biāo)記的抗IgG抗體（二抗） SP試劑 ABC試劑（單獨(dú)購(gòu)買(mǎi)）Kits for Immunostaining14PBS洗滌切片5min3次15滴加SP試劑或ABC試劑（1）生物素-抗生物素染色（ABC或SP法）的顯色原理 ABC法的染色原理 很早以前研究者就注意到給動(dòng)物

35、飼以大量的雞蛋白，會(huì)引起明顯的“維生素H 缺乏癥”，也稱為“蛋白質(zhì)傷害”。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在雞蛋白中含有一種堿性蛋白，分子量為68kD，屬于糖蛋白，當(dāng)時(shí)命名為卵白素（avidin）。機(jī)體中還有一種物質(zhì)叫生物素（biotin），又稱維生素H，是一種小分子的維生素，廣泛分布于動(dòng)植物組織中，以輔酶的形式參與各種羥化酶反應(yīng)，分子量為244 D。 卵白素具有4個(gè)同生物素（維生素H）親和力極高的結(jié)合點(diǎn)。給動(dòng)物飼以大量的雞蛋白所致的維生素H缺乏，就是由于卵白素和大量維生素H結(jié)合所致。研究者根據(jù)這兩種物質(zhì)的特點(diǎn)，提出了卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)。由于習(xí)慣上將維生素H稱為生物素，為便于理解，我國(guó)免疫細(xì)胞化學(xué)作者將卵

36、白素稱為抗生物素或親和素，因此卵白素-生物素免疫染色系統(tǒng)又稱為抗生物素-生物素免疫染色法。 生物素的另一特點(diǎn)是它可以和抗體IgG的Fc段結(jié)合，不影響IgG的活性。同時(shí)，生物素經(jīng)活化后還可同過(guò)氧化物酶或ALP等結(jié)合，而不影響酶的活性。根據(jù)上述這些抗生物素-生物素的反應(yīng)原理和特性，1981年許世明設(shè)計(jì)出了免疫組織化學(xué)染色的ABC法（avidin-biotin peroxidase complex method， ABC ），并已制成了商品化的試劑盒。 ABC法免疫組化的試劑盒中除包括制備二抗的同一種屬動(dòng)物的非免疫血清、生物素標(biāo)記的二抗外，還包括：A試劑 (抗生物素) 和B試劑 (生物素-過(guò)氧化物酶

37、復(fù)合物)。在使用前半小時(shí)，將兩種試劑按說(shuō)明書(shū)要求相互混合，形成復(fù)合物，一般是在5ml 的PBS中加一滴A試劑 (約50l)，混勻后再加一滴B試劑 (約50l)，混勻，半小時(shí)后加至經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記的二抗孵育的切片上，室溫下保濕盒內(nèi)孵育30-60 分鐘。 Biotinylated second antibodyP-OP-OP-OP-OAntigenBiotinAvidinHRPPrimary antibodyIllustration of ABC methodAvidin-biotin-peroxidase complex SABC 法的染色原理及特點(diǎn) (1) 基本原理 鏈酶親和素是一種從鏈霉菌培養(yǎng)

38、物中提取的蛋白質(zhì)，分子量60kD，不含糖鏈，等電點(diǎn) 。與親和素（卵白素）相同也有四個(gè)生物素結(jié)合點(diǎn)，親和力極高。與親和素相比是一種更近于完美的生物素結(jié)合蛋白。鏈酶親和素（鏈霉卵白素）同一定濃度的生物素化酶混合后，就能形成鏈酶卵白素-生物素-酶復(fù)合物。這種復(fù)合物中至少存在一個(gè)尚未被生物素占據(jù)的親和素結(jié)合位點(diǎn)，可以和各種生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合。這種復(fù)合物即是SABC (streptavidin-biotin complex)。 (2) SABC的特點(diǎn) 高敏感性； 低背景； 簡(jiǎn)便快速； 結(jié)果穩(wěn)定 SP 法的染色原理 基本原理與ABC法相似，但與ABC法稍有不同，是采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉卵白素連接

39、的過(guò)氧化物酶及基質(zhì)素混合液來(lái)測(cè)定細(xì)胞和組織中的抗原。AgAgBiotinStreptavidinEnzyme: HRP or APPrimary antibodyBiotinylated secondary antibodyIllustration of SP methodSP complex EnVison系統(tǒng)染色原理 與ABC法、SP法及SABC法的染色原理均不同，是將二抗與多聚螯合物酶（HRP或AP）通過(guò)化學(xué)方法連接在一起，形成多聚螯合物，在多聚螯合物上含有大量的酶分子和二抗，因此，比ABC法、SP法和SABC法具有更顯著的放大作用，可高出幾十倍。由于多聚物在人或動(dòng)物體內(nèi)不存在，因此，無(wú)

40、非特異性染色，背景著色極輕。 染色步驟簡(jiǎn)便，在一抗反應(yīng)后，切片經(jīng)PBS洗滌后即可加入EnVison系統(tǒng)試劑，再經(jīng)PBS洗滌后，可進(jìn)行顯色。AgAgPrimary antibodySecondary antibodyEnzyme, AP or HRPIllustration of EnVision method 16PBS洗滌切片，5 min3。 17DAB顯色或AEC顯色，或堿性磷酸酶標(biāo)記的NBT顯色。 （1）DAB顯色液配置 DAB 20-50 mg 0.01mol/LPBS (pH 7.2-7.4) 100ml 或0.05mol/L Tris-HCl(pH 7.6) 30% H2O2 20

41、-40l 配置方法：先以少量PBS或Tris-HCl緩沖液溶解DAB，然后再加入余量緩沖液，在顯色前加入30% H2O2。將洗滌后的切片浸入顯色液中51020min，應(yīng)閉光下反應(yīng)，并隨時(shí)在顯微鏡下觀察結(jié)果，隨時(shí)終止反應(yīng)，也可使用商品化的即用型DAB。陽(yáng)性反應(yīng)部分為棕色，經(jīng)核復(fù)染后，脫水、透明、樹(shù)膠封片，但由于有致癌作用，配置時(shí)應(yīng)注意防護(hù)。 （2）AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) 顯色液 AEC 20mg 二甲基甲酰胺 0.05 mol/L 醋酸緩沖液 (pH 5.5) 50ml 30% H2O2 5l 配置方法：先將AEC溶于DMF中，再加入醋酸緩沖液充分混勻過(guò)濾。

42、臨顯色前加入H2O2, 顯色時(shí)間5-20 min，也可使用商品化的AEC顯色。該顯色液作用后，陽(yáng)性部分為紅色，如以蘇木素或亮綠復(fù)染核后，效果更佳，但終產(chǎn)物溶于酒精和水，故需用甘油封固。（3）堿性磷酸酶（AKP）標(biāo)記的NBT顯色液 預(yù)先配置以下試劑： A 液：5% NBT（Nitro-blue-tetrazolium） 稱取溶于10ml 70% 的DMF，充分混合，保存于4，也可分裝成小份，-20保存，用前復(fù)至室溫。 B 液：5% BCIP（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate） 稱取，溶于10ml DMF內(nèi)，混勻，4成分裝，保存于-20，用前復(fù)至室溫。 顯色

43、液：取A 液 40l，加入到裝有10ml 的緩沖液（，含，5mmol/L MgCl2）管內(nèi)充分混勻，再加入B液40mol，輕輕混勻即可，最好臨用前就配置，但在顯色液中需加入Levamisole（左旋咪唑）在顯微鏡下隨時(shí)觀察顯色反應(yīng)，陽(yáng)性結(jié)果為藍(lán)色或紫色沉淀。 上述所提及的各種顯色液目前均有以試劑盒形式出售，只要按說(shuō)明操作即可，但價(jià)格較貴。 18. 自來(lái)水洗滌切片、核復(fù)染、脫水、透明、 樹(shù)膠封片 經(jīng)顯色后，將切片放入自來(lái)水中，流水輕沖洗10分鐘，再經(jīng)蒸餾水洗后，放入蘇木素中做核復(fù)染（顯色切片）20s-1min，經(jīng)酒精-HCl分化后，在放入自來(lái)水中繼續(xù)分化細(xì)胞核至滿意為止。 經(jīng)70%、80%、90

44、%、95%、100%、100% 酒精脫水各5min，二甲苯透明后，用樹(shù)膠封片。Immunostaining of GFAP and IL-8GFAP, SPGFAP, SPIL-8, ABCIL-8, ABC 400 400 400 200Immunostaining of Fas , Fas L and CaspasesFas, EnVisonFas L, EnVison 400 400 400 400Caspase-3, SABCCaspase-6, SABC 第三節(jié) 免疫組化染色的對(duì)照設(shè)置 在進(jìn)行免疫組化染色時(shí)，必須證實(shí)組織內(nèi)顯示的反應(yīng)產(chǎn)物，確實(shí)是抗原與相應(yīng)的特異性抗體反應(yīng)所產(chǎn)生的。由于

45、免疫組織化學(xué)染色中影響抗原、抗體和免疫反應(yīng)的因素很多，因此對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果的評(píng)價(jià)必須設(shè)置對(duì)照組才能做出正確的判斷。 常用的對(duì)照組有以下幾種： 一、 陽(yáng)性對(duì)照 用已證實(shí)含用待測(cè)抗原的組織，與待檢標(biāo)本做同樣處理后，進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，稱為陽(yáng)性對(duì)照。每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)做陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)陽(yáng)性對(duì)照可證明靶抗原有一定活性，染色過(guò)程中各個(gè)步驟以及所用的試劑都合乎標(biāo)準(zhǔn)，染色方法可靠。特別是當(dāng)待檢的標(biāo)本為陰性結(jié)果時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照呈陽(yáng)性反應(yīng)，可排除待檢標(biāo)本假陽(yáng)性的可能。所以若預(yù)期染色結(jié)果是陰性時(shí)，就必須設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。 二、陰性對(duì)照 用確知不存在待檢抗原的組織切片染色，結(jié)果為陰性。陰性對(duì)照可證實(shí)組織內(nèi)若不含靶抗

46、原，就不應(yīng)染色，可排除在染色過(guò)程中由于非特異性染色或交叉反應(yīng)等因素造成的“假陽(yáng)性”結(jié)果。 三、空白對(duì)照 是最常用的對(duì)照，用不加一抗的緩沖液，如PBS替代一抗，染色結(jié)果應(yīng)為陰性，說(shuō)明染色方法可靠，可排除組織的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、自發(fā)熒光等物質(zhì)引起的非特異性顯色。 四、替代對(duì)照 用與第一抗體來(lái)源的同一動(dòng)物免疫前血清，如第一抗體用的是兔抗人GFAP的 IgG抗體，對(duì)照中用非免疫性的正常兔IgG血清來(lái)替代一抗，以相同的稀釋倍數(shù)進(jìn)行對(duì)照染色。這可證明待檢切片中陽(yáng)性結(jié)果不是抗體以外混雜的血清成分所致，而是所用特異性抗體與組織細(xì)胞內(nèi)待檢抗原的特異性反應(yīng)的結(jié)果。但使用的商品抗體往往不能用同一種動(dòng)物的

47、免疫前血清做替代對(duì)照，也可用未經(jīng)免疫的同種動(dòng)物血清，即非免疫血清替代一抗。 五、吸收試驗(yàn)對(duì)照 用過(guò)量已知相應(yīng)的純化抗原與第一抗體反應(yīng)，抗體結(jié)合點(diǎn)全部被抗原結(jié)合，這種被抗原吸收的抗體不能再與組織內(nèi)的抗原反應(yīng)，故再做免疫組化染色時(shí)，結(jié)果應(yīng)為陰性。 六、自身對(duì)照 用同一組織切片上與待檢抗原無(wú)關(guān)的其它結(jié)構(gòu)做對(duì)照。陰性反應(yīng)與陰性結(jié)構(gòu)同在一個(gè)視野中，相互印證，這本身就是對(duì)陽(yáng)性反應(yīng)的特異性對(duì)照。但進(jìn)行科研工作中，單純用這種對(duì)照是不科學(xué)的。必須增加如空白對(duì)照、替代對(duì)照等，才能使染色結(jié)果得到承認(rèn)。 在國(guó)際上發(fā)表文章，做免疫組化染色的同時(shí)，還須有Western blotting做相應(yīng)蛋白質(zhì)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果加以證實(shí)。

48、 冰凍切片的免疫組織化學(xué)染色 冰凍切片的免疫組織化學(xué)染色也是常用的技術(shù)，但一般情況下不用，因?yàn)楸鶅銮衅僮鬏^復(fù)雜，不易操作，要求標(biāo)本必須是深低溫快速冷凍，標(biāo)本不如石蠟塊易保存等，但優(yōu)點(diǎn)是組織的各種抗原保存好。因此一般情況下，只有在應(yīng)用石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，包括經(jīng)過(guò)抗原熱修復(fù)或蛋白酶消化后，仍不能得到陽(yáng)性染色結(jié)果時(shí)，才考慮使用冰凍切片染色。第四節(jié) 雙重免疫組織化學(xué)染色 應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法在同一張組織切片或細(xì)胞涂片上同時(shí)或先后顯示兩種抗原成分，即為雙重免疫標(biāo)記。光鏡下通過(guò)標(biāo)記物或其反應(yīng)生成物的顏色來(lái)標(biāo)記不同的抗原成分，以幫助研究者了解含有這些不同抗原的各類細(xì)胞、組織之間的相互關(guān)系。 可能

49、遇到的問(wèn)題是：后一種免疫染色所用的抗體系統(tǒng)可能與前一種染色所用的抗體系統(tǒng)發(fā)生交叉反應(yīng)，從而造成疊加污染，失去雙重染色的準(zhǔn)確性和意義。為避免這種交叉反應(yīng)，研究者建立了一些方法，按其作用原理和方式，可分為洗脫法和非洗脫法。 一、洗脫法 1. 基本原理： 可選用同種動(dòng)物產(chǎn)生的特異性抗體（如兔抗X和兔抗Y IgG 抗體）為一抗，另一種動(dòng)物相應(yīng)的抗體（如生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體）為二抗，用ABC、SP或SABC方法，或應(yīng)用EnVison方法進(jìn)行染色，用不同的酶和底物系統(tǒng)呈色。在完成第一種免疫組化染色后，將抗原抗體復(fù)合物洗脫，再做第二種染色。 2. 洗脫液： （1）甘氨酸-鹽酸溶液(pH 2.2)：0

50、.1 mol/L鹽酸+0.757%（）甘氨酸溶液95ml（的氯化鈉溶液配制）。用該溶液洗切片2h，一般能夠消除第一種染色的抗體系統(tǒng)與下一種染色的交叉反應(yīng)，但保留顯色反應(yīng)所得的顏色。 （2）高錳酸鉀-硫酸洗脫液：1 ml 2.5% KMnO4，1ml 5% H2S04，加140ml蒸餾水混勻。 3. 洗脫法的一般步驟 按常規(guī)做第一種免疫組化染色，可選用HRP為標(biāo)記物，顯色底物為4-氯萘酚，陽(yáng)性部位反應(yīng)產(chǎn)物為藍(lán)色。 開(kāi)始第二種染色前，先將切片經(jīng)蒸餾水洗，再用酸性溶液洗脫。如用的甘氨酸-鹽酸溶液須浸洗2h左右，如用高錳酸鉀-硫酸洗脫液則要5min左右，再將切片移入0.5%的焦亞硫酸鈉（Na2S2O5

51、）水溶液中還原30s，經(jīng)水洗10-20min，蒸餾水洗5min， 按常規(guī)進(jìn)行下一種免疫組化染色。第二種染色選用DAB為顯色底物，生成物呈棕褐色，與第一種染色中生成的藍(lán)色可形成比較鮮明的對(duì)比。 二、非洗脫法 （一）直接法 如果采用不同種酶標(biāo)記在不同的第一抗體上，則只能用順序染色法。即先做第一種染色，用第一種底物與已定位的酶反應(yīng)呈色，再進(jìn)行第二種染色。 （二）標(biāo)記雙抗原法 兩種一抗分別來(lái)自不同種動(dòng)物，二抗分別來(lái)自另外兩種不同動(dòng)物，且標(biāo)記兩種酶分別作為標(biāo)記物做雙重染色時(shí)，一般第一種染色選用HRP，而在第二種染色中可按需要選擇不同的酶。如選用ALP，還可用不同的底物呈現(xiàn)不同的顏色，如堅(jiān)固藍(lán)呈現(xiàn)的藍(lán)色可

52、與DAB的棕色形成良好的對(duì)比，堅(jiān)固紅雖然與DAB的棕色對(duì)比相對(duì)較差，但也可選用。 （三）活性滅活法 是一種新建立的方法，主要是根據(jù)通過(guò)在溶液中加熱滅活第一次染色中的抗原、抗體和酶活性后再進(jìn)行第二種染色的原理而設(shè)計(jì)的。用于滅活的溶液介質(zhì)一般是檸檬酸緩沖液（），滅活的溫度一般是96左右。本法的優(yōu)點(diǎn)是用于染色的一抗、二抗可分別來(lái)自于同一種動(dòng)物，方便了抗體的選擇，只是選用不同的顯色酶和底物。但缺點(diǎn)是所要顯示的第二種抗原必須耐熱。Double Immunostaining of Fas and Fas LEnVisonEnVisonEnVisonEnVison 400 400 400 400免疫熒光染色

53、及多重染色技術(shù)Single and multiple immunofluorescent labeling原理：是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗體或抗原標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。方法：直接法、間接法。 檢測(cè)方法 一、直接法 用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合，制成特異性熒光抗體，直接與細(xì)胞或組織中相應(yīng)抗原結(jié)合，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)抗原存在部位呈現(xiàn)的特異性熒光。此法特異和簡(jiǎn)便，但一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。 二、間接法 是直接法的重要改進(jìn)，先用特異性第一抗體抗體與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng)，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結(jié)合

54、的抗體，再用標(biāo)記熒光的第二抗體與結(jié)合在抗原上的抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法，從而提高了敏感性，與直接法相比熒光亮度可增強(qiáng)34倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，適用于多種抗原的標(biāo)記顯示，是目前最廣泛應(yīng)用的技術(shù)。 間接法染色原理標(biāo)記不同熒光發(fā)色劑的商品化二抗：1. Alexa Fluor 555，顯示紅色熒光； 吸收光譜峰值：555nm ，激發(fā)光譜峰值：565nm 。2. Alexa Fluor 488，顯示綠色熒光； 吸收光譜峰值：495nm ，激發(fā)光譜峰值： 519 nm 。 3. Alexa Fluor

55、350，顯示藍(lán)色熒光。 吸收光譜峰值：346nm ，激發(fā)光譜峰值： 442nm 。4. Hoechst 33258，標(biāo)記細(xì)胞核，或細(xì)胞凋亡檢測(cè)，藍(lán)色。 吸收光譜峰值： 346nm，激發(fā)光譜峰值： 460nm 雙重或三重免疫熒光標(biāo)記法 Double and triple immunofluorescent labeling目的：1. 雙重染色：同時(shí)顯示細(xì)胞中的兩種抗原或一種抗原+標(biāo)記細(xì)胞種類；2. 三重染色：同時(shí)顯示細(xì)胞中的三種抗原或兩種抗原+標(biāo)記細(xì)胞種類。方法：直接法、間接法 直接法：將兩種或三種來(lái)自不同種屬，并標(biāo)記了可發(fā)出不同顏色熒光的抗體（如抗A、抗B、抗C）以適當(dāng)比例混合，加在標(biāo)本上孵育

56、后，按直接法洗去未結(jié)合的熒光抗體，抗A抗體用發(fā)黃綠色熒光素標(biāo)記，抗B抗體用發(fā)紅色熒光素標(biāo)記，抗C抗體用發(fā)藍(lán)色熒光素標(biāo)記明確顯示兩種或三種抗原的定位。 間接法：將兩種或三種來(lái)自不同種屬的抗體（如抗A、抗B、抗C的IgG抗體）同時(shí)或分別孵育切片后，再選用標(biāo)記了可發(fā)出不同顏色熒光另外不同種屬的抗IgG抗體孵育切片，進(jìn)行雙重或三重免疫熒光染色，是目前常用的檢測(cè)技術(shù)。Double immunostaining of Nrf1 in distinct cell types Co-localization of F4/80 and nAChR7 by double immunofluorescent lab

57、eling during skin wound healing in mice The samples were immunostained with anti-F4/80 (a, green) and anti-nAChRa7 (b, red). Nuclei were counterstained with Hoechst33258 (c, blue). Signals in ac were digitally merged in d. The nAChRa7+/F4/80+ cells presented as yellow signals in the merged image.免疫熒

58、光染色注意事項(xiàng) 免疫熒光染色的基本程序近似于酶免疫組織化學(xué)染色，但應(yīng)注意以下問(wèn)題：1. 免疫熒光不需要用雙氧水處理，封閉和一抗孵育與其相同。2. 二抗孵育之后充分洗片后即可貼片、封片和觀察。3. 免疫熒光在封片時(shí)常使用專用封片劑或甘油（0.01M PBS 1:1）。建議購(gòu)買(mǎi)抗淬滅的封片液，使切片可以保存更久。4. 熒光抗體的孵育以及后續(xù)處理需要避光。5. 免疫熒光染色假陽(yáng)性可能多，需分別設(shè)定陽(yáng)性和陰性對(duì)照。6. 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4保存4h，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可能會(huì)使熒光提前衰退。 第五節(jié)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)技術(shù) 一、凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變 細(xì)胞表面：偽足、微絨毛等消失 細(xì)胞體形態(tài)：細(xì)胞皺縮

59、、變形，體積變小 細(xì)胞核：染色質(zhì)濃縮、早期染色質(zhì)聚集于核膜邊，呈新月形 或環(huán)形，晚期碎裂 細(xì)胞器：密集但形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整，早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短暫擴(kuò)張 細(xì)胞膜：完好，晚期包裹細(xì)胞器或核碎片，形成凋亡小體 在組織中表現(xiàn)：常常以單個(gè)細(xì)胞散在發(fā)生 周?chē)M織反應(yīng)：凋亡細(xì)胞或小體被鄰近巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞 吞噬、降解，不發(fā)生炎癥反應(yīng) 發(fā)生條件：屬于基因控制的程序性細(xì)胞死亡，多發(fā)生于器官 萎縮、細(xì)胞介導(dǎo)的免疫殺傷機(jī)制、小劑量毒素作 用以及多種病理生理狀態(tài) 二、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法（一）凋亡細(xì)胞的光鏡和熒光顯微鏡檢測(cè) 1制片 （1）常規(guī)組織學(xué)切片，進(jìn)行脫蠟和水化。 （2）培養(yǎng)細(xì)胞可用細(xì)胞離心儀制片。由于凋亡細(xì)胞在制片

60、中容易破碎，所以應(yīng)采用低速離心制片（250g，離心5min），并事先將載玻片用1%BSA處理，使細(xì)胞易于貼附。離心后涂片，稍經(jīng)空氣中干燥后，迅速用1%多聚甲醛4下固定15-30min，然后轉(zhuǎn)入80%乙醇后固定1-2h，保存于-20待用。 2染色方法 可用多種方法進(jìn)行染色。 （1）可采用常規(guī)的組織學(xué)染色方法，如Giemsa染色、HE 染色或Mayer蘇木素染色。 （2）采用熒光染料染色 Hoechst 33258 。 DAPI（4, 6 -diamidino- 2-phenylindole; 4,6- 二脒基-2-苯基吲哚 ）。 DAPI是含有特定AT序列DNA的一種嵌入劑，能像 Hoechst