維真生物-WesternBlot試驗(yàn)方法及注意事項(xiàng)

1、WesternBlot 實(shí)驗(yàn)方法及注意事項(xiàng) 實(shí)驗(yàn)原理：WesternBlot印跡方法，又稱為免疫印記，是將獲得的蛋白質(zhì)樣品 通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，對不同分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，并 通過轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上分離到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至固相支持物（NC膜或PVD用莫）上，用抗靶蛋白的非標(biāo)記抗體（一抗）與轉(zhuǎn)印后膜上的靶蛋 白進(jìn)行特異性結(jié)合，再與經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記（偶聯(lián)）的二抗結(jié)合， 最后用ECU敏發(fā)光液試劑檢測。如果車印膜上含有靶蛋白，經(jīng)X光片曝光、顯影后，則會在 X-光片上出現(xiàn)特異性蛋白條帶。 實(shí)驗(yàn)材料：分離膠及積層膠溶液、水飽和異丁醇、iXTris ?Cl/SDS,pH8,8、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)混合

2、物 、1XSDS電泳緩沖液、電 泳裝置及夾子、玻璃板、灌膠支架、緩沖液梢等附件、0.75mmfef邊墊片、0.75mmt羊品梳子、50膜微量加樣器、恒流電源 常用試劑：30%f烯酰胺/0.8% N,N-亞甲丙烯酰胺將30克丙烯酰胺和0.8克N,N-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml 水中，加熱至37c溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。0.45 m微孔濾 膜過濾除菌，查證該溶液pH應(yīng)不大于7.0 ,置棕色瓶中保存。小心：丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可通過皮膚吸收，具作用 具有累積性。稱量丙烯酰胺和N,N-亞甲丙烯酰胺時(shí)應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因?yàn)樗€可能含有少量未

3、聚合材料。4x Tris ? Cl/SDS,pH8.8,在 300mlH2計(jì)溶解 91g Tris 堿(1.5mol/L),用 1mol/L 調(diào)節(jié) pH 至8.8,補(bǔ)加H2O至體積500ml。用0.45止m濾膜過濾溶液，再加入2g SDS0.4%(w/v),于 4 c 可保存 1 月。4x Tris ? Cl/SDS,pH6.8,在 40mlH2計(jì)溶解 6.05g Tris 堿(0.5mol/L),用 1mol/L 調(diào)節(jié) pH 至6.8,補(bǔ)加H2O至體積100ml。用0.45 m濾膜過濾溶液，再加入0.4g SDS0.4%(w/v),于 4 c 可保存 1 月。4XSDS電泳緩沖液Tris b

4、ase 24.2 g 、Glycerin 115.3 g 、20%SDS 20 ml加水至總體積1000ml。應(yīng)用時(shí)稀釋4倍即為1XSDS電泳緩沖液(Tris 0.05M,Glycerin 0.38M,SDS 0.1%)。TEMED (N,N,N ,N-四甲基乙二胺)TEMEDI過催化過硫酸鏤形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N-亞甲丙烯酰胺的聚合。10%硫酸鏤過硫酸鏤提供驅(qū)動丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需配自由 基?？捎萌ルx子水配制小量10%(w/v)配貯存液并保存于4C。由于過 硫酸鏤會緩慢分解，故應(yīng)隔周新鮮配制。實(shí)驗(yàn)步驟: 轉(zhuǎn)染后的樣品，收毒，12000rpm離心，2min,去上清，細(xì)胞碎

5、片就直接進(jìn)行下面步驟：(1)力口入 10 x RIPA buffer/ 每孑L 200 , 4 裂解 30min。(2)準(zhǔn)備熱變性，用八連管，每孔加入 5 x loading buffer 5(3)用20膜 移液槍，將裂解后的細(xì)胞取出20屋，力口入對應(yīng)的八連管 中，并吹打混勻。(4)封口，用PCFa進(jìn)行熱變性處理：97 8min。(5) 4儲存變性后的樣品，待檢。1、 SDS膠的配制預(yù)先配制混合液(Tris-HCL/Acr-bis/SDS/H2O ) ,APS 以及 TEMED 在配制凝膠時(shí)現(xiàn)加。分離膠：用1.5M Tris-HCL 8.8、10粉離膠。(所謂的10麻度為Acr-Bis的濃度，

6、即丙烯酰胺的濃度，用水定容，其他成分不變)；濃縮膠：用 1M Tirs-HCL 6.8、濃度：5%2、上樣電泳：所用梳子為15孔，Marker占用一孔，故每塊凝膠可以檢測14支樣品。上樣量：Marker： 5屋/孔； 樣品：20區(qū)l/孔；參數(shù)：80V,待樣品跑出上樣孔；120V,樣品進(jìn)入分離膠；200V,直至結(jié)束(藍(lán)色指示帶 到凝膠底部即完成電泳)3、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)順序：黑色板、網(wǎng)墊、一層濾紙、凝膠（習(xí)慣將Marker 放在右側(cè)）、NC膜（在膜的蛋白面左上角做好標(biāo)記）、兩層濾紙、網(wǎng)墊、白色板。備注：所用的濾紙也分粗糙面和細(xì)膩面，細(xì)膩面對著凝膠和NC膜，粗糙面對著網(wǎng)墊。將三明治結(jié)構(gòu)的夾子放

7、入電極時(shí)，黑色板對應(yīng)電極的黑色一面（負(fù)極）、白色版對應(yīng)電極的紅色一面（正極）。強(qiáng)調(diào)：凝膠和NCI （硝化纖維素膜）的順序千萬不要放反，所用的 NC 膜分粗糙面和光滑面，粗糙面為接受蛋白面，該面和凝膠直接接觸。蓋梢蓋時(shí)，同樣注意黑色對應(yīng)黑色、紅色對應(yīng)紅色；同樣導(dǎo)線電極連接電源的時(shí)候，也是黑色對黑色、紅色對紅色。上述任何一步弄反，都會導(dǎo)致蛋白轉(zhuǎn)膜失敗，切記。轉(zhuǎn)膜所用參數(shù)：穩(wěn)流45mA過夜（999min）。4、封閉所用封閉液：5% Nonfat milk ,用 TBSTt己制，RT （室溫），30min1h（根據(jù)實(shí)際情況確定時(shí)間，比如封閉液已使用次數(shù)、ECL顯色的背景）。為了防止奶粉變質(zhì)，加入疊氮鈉

8、即 NaN3（ 一種光譜的防腐劑），終濃度為0.02% （本實(shí)驗(yàn)室疊氮鈉儲存液濃度為 2%洗：TBST洗去殘余的奶粉。5、一抗孵育所用抗體：mouse Anti-Flag。一抗稀釋：4%BSA by Super Block, 1:1000。亦加入 0.02% 的疊氮鈉NaN3孵育：R1 23h。洗：TBST 3 x 5min6、二抗孵育所用抗體：HRP anti-mouse。二抗稀釋：5%Nonfat milk by TBST , 1:2000.（二抗一般用兩次或三 次就更新）（強(qiáng)調(diào)：二抗中不可以加NaN3，因?yàn)槠鋾种艸R用勺活性） 孵育：RT, 1h。洗：TBST 6 x 5min。7、顯

9、色：ECLA液/B液，各取300屋等體積混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。用熒光筆標(biāo)記好 NC 膜上的Marker以及上樣孔的位置。將反應(yīng)液均勻的加到膜上（蛋白面）， 浸濕整張膜，然后輕輕的將膜的蛋白面向下放入顯色儀，蓋上蓋子， 點(diǎn)擊開始。注意事項(xiàng)1、開始配膠的板子一定得夾緊，防止漏膠。2、上樣的板子也得夾緊，防止漏電緩液，在跑膠出現(xiàn)膠的快慢不一樣， 原因上樣前兩塊膠的板子沒有加緊漏電緩液，還有就是膠的濃度不一 樣。3、上樣時(shí)，marker5ul加5 x loading buffer混勻一起上樣，這樣可 以防止在跑電泳的過程，樣品把 marker給擠的越來越窄。4、轉(zhuǎn)膜時(shí)，NC膜的正面左上角先用marker筆做

10、好標(biāo)記，防止后面孵 育抗體與顯色的過程分不清 NC膜的正反面。5、轉(zhuǎn)膜之前，先把NC膜放在轉(zhuǎn)膜液浸泡，注意從一端慢慢的往下浸泡，否者NC膜容易泡不透，影響轉(zhuǎn)膜。6、顯色時(shí)，往NC膜上加轉(zhuǎn)膜液也得從一邊慢慢往下加，否者最后顯色效果也不好。7、轉(zhuǎn)膜時(shí)，NC膜與膠的接觸之前千萬不可有氣泡， 否者對結(jié)果的目的 條帶有影響。常見問題1、膠片是一片空白，是怎么回事？如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。1)二抗的HRP活性太強(qiáng)，將底物消耗光；ECL底物中H2O杯穩(wěn)定，失活；ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；一抗選擇不當(dāng)；5)二抗失活。2、背景高咋回事？膜沒有完全均勻濕透，建議 使用100

11、% methanol浸透膜；洗膜不充分，可以增加洗液體積和洗滌次數(shù)；電極不平衡或者加樣位置偏斜，可以調(diào)整電極和加樣；封閉物用量不足，可以提高封閉物濃度，孵育時(shí)保證封閉液完全浸沒轉(zhuǎn)印膜；封閉物使用不當(dāng)，比如檢測生物素標(biāo)記的蛋白時(shí)不可用脫脂奶粉封閉；封閉時(shí)間不夠，一般情況下室溫37度封閉1小時(shí)以上或者4度封閉過 夜；7）抗體非特異性結(jié)合，可以降低抗體濃度，減少孵育時(shí)間一抗稀釋度不適宜，可以對抗體進(jìn)行滴度測試，選擇最適宜的抗體 稀釋度一抗孵育的溫度偏高，建議4c結(jié)合過夜10）抗體濃度過高或洗滌不夠，建議降低抗體濃度，增加洗滌次數(shù)和時(shí)間11）化學(xué)顯色底物過多，建議按說明書加入適量的顯色底物3、為啥條帶

12、形狀不好看？1）膠凝的不均勻或聚合不好，建議灌膠前將溶液充分混勻2）某些樣品鹽濃度較高，建議除鹽或?qū)悠符}濃度調(diào)成一致3）緩沖液陳舊，成分改變，可以重配4）凝膠下面有氣泡，電泳前要先將氣泡趕走5）電泳時(shí)溫度過高，可以降低電流或電壓6）樣品中含有不溶性顆粒，建議樣品充分?jǐn)嚢杌靹?、蛋白條帶位置（大小）不對咋整？膠濃度不對，不同濃度的膠跑出的蛋白條帶的位置可能有所偏差，可以調(diào)整濃度抗體孵育不充分，建議增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間3）酶失活，建議直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活 了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物4）目的蛋白存在翻譯后修飾或剪切體，建議查詢相關(guān)文獻(xiàn)確定5）標(biāo)本中不含靶蛋白

13、或靶蛋白含量太低，建議設(shè)置陽性對照比對結(jié)果, 增加標(biāo)本上樣量5、有很多雜帶咋回事？1）目的蛋白有多個修飾位點(diǎn)，本身可以呈現(xiàn)多條帶，建議查閱文獻(xiàn)或 進(jìn)行生物信息學(xué)分析，獲得蛋白序列的修飾位點(diǎn)信息，通過去修飾確 定蛋白實(shí)際大小2）樣本處理過程中目的蛋白發(fā)生降解，建議加入蛋白酶抑制劑；樣本 處理時(shí)在冰上操作3）雜蛋白多，建議處理目的蛋白4）抗體特異性不強(qiáng)，建議使用特異性強(qiáng)的抗體5）抗體孵育時(shí)間過久，建議減少抗體孵育時(shí)間6）二抗與抗原有交叉反應(yīng)，建議選擇合適的封閉物7）二聚體或多聚體存在，建議增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度8）底物顯色與曝光時(shí)間過長，建議縮短顯色及曝光的時(shí)間6、背景有黑色斑點(diǎn)或有不均勻的白色

14、斑點(diǎn)以及暗背景上白色帶1）抗體與封閉試劑反應(yīng)，建議使用前過濾封閉試劑HR哈量過高，建議降低酶聯(lián)二抗的濃度HRH禺聯(lián)二抗中有聚集體，建議過濾二抗試劑，去除聚集體4）抗體分布不均勻，建議孵育抗體時(shí)使用搖床7、細(xì)胞水平要做 WB多少細(xì)胞提的蛋白夠做 WB答：一般5X10八6就足夠。8、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有檢測到目的蛋白？可能的原因有：1）細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；2）抗體不能識別目標(biāo)蛋白，多看看說明，是否有問題；3）可能是沒有保持低溫操作，樣品保存不當(dāng)，樣品放置時(shí)間過長；4）細(xì)胞中的蛋白質(zhì)被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制劑，抑制蛋白酶 活性。9、我的目的帶很弱，如何加強(qiáng)？1）可以加大抗

15、原上樣量，這是最主要的；2）也可以將一抗稀釋比例降低；3）還可以延長曝光時(shí)間。10、我做的蛋白質(zhì)分子量很小（10KD ,請問怎么做 WB1）可選擇孔徑0.22um的PVDF膜或者NC膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間縮短，另外可采用 Tricine-SDS體系；2）也可以選擇PSQ膜，同時(shí)縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。也可以將兩張膜疊在一起， 再轉(zhuǎn)移。其他按步驟即可。11、大分子量蛋白200KD在做W嚷注意什么？1）做200kd蛋白的WB寸要注意，分離膠最好選擇7%勺；剝膠時(shí)要小 心；2）轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長；要做分子量參照（否則出現(xiàn)雜帶不知道如 何分析）；3）轉(zhuǎn)膜液中甲醇含量可適當(dāng)降低，推薦使用濕裝轉(zhuǎn)膜效率更高哦！12、如果上樣

16、量超載，要用什么方法來增加上樣量？可以濃縮樣品，也可以根據(jù)目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一 般地，超載30%是不會有問題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子 量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試 1.5mm的。13、WE抗體的可以重復(fù)應(yīng)用嗎？抗體工作溶液一般不主張儲存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反 復(fù)使用2- 3次。稀釋后應(yīng)在2 3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。 14、上下梢緩沖液有何要求，怎樣才能達(dá)到最佳效果？無特殊要求。但一般是上梢放新鮮的緩沖液，下梢可以是重復(fù)使用過 一兩次的緩沖液。15、免疫組化和 W麗以用同一種抗體嗎？免疫組化時(shí)抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位）， 有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影 響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu) 限制，煮后變性會消失。如果所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個 氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于