RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP應(yīng)用于乳品發(fā)酵中新陳代謝活性細(xì)菌的半定量分析百替生物講解學(xué)習(xí)

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP應(yīng)用于乳品發(fā)酵中新陳代謝活性細(xì)菌的半定量分析百替生物-RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP應(yīng)用于乳品發(fā)酵中新陳代謝活性細(xì)菌的半定量分析JorgeI.Sancheza,LiaRossettib,BeatrizMartneza,AnaRodrgueza,GiorgioGiraffab,*aInstitutodeProductosLacteosdeAsturias(IPLA-CSIC),ctra.Infiesto,s/n,33300Villaviciosa,Asturias,Spa

2、inbIstitutoSperimentaleLattieroCaseario,viaA.Lombardo11,26900Lodi,ItalyReceived2February2005;receivedinrevisedform21July2005;accepted28July2005Availableonline21September2005（楊明翻譯）摘要：一種包括RT-PCR擴(kuò)增全部微生物群落的16SrRNA和T-RFLP的方法，對(duì)于在確定的乳酸乳球菌乳酸亞種和檸檬明串珠菌菌株培養(yǎng)中半定量的描述新陳代謝活性數(shù)量是最優(yōu)的，這是兩種在奶酪生產(chǎn)中被通常使用的嗜溫的乳酸菌種。選擇好的PCR引物高

3、效地?cái)U(kuò)增這兩個(gè)菌種的16SrRNA。用DdeI消化PCR產(chǎn)物生產(chǎn)每種菌種的不同的末端限制性酶切片段（T-RFs）。然而，由于嵌合分子的形成和來源于部分單鏈16SrRNA的擴(kuò)增子的假T-RFs產(chǎn)生的額外的T-RFs在兩個(gè)菌種中都被觀察到了，盡管是很少量的。為了避免過量PCR產(chǎn)物對(duì)定量DNA產(chǎn)生的飽和效果導(dǎo)致的對(duì)總量的低估和盡量減少假片段的出現(xiàn)，20個(gè)PCR循環(huán)是最佳的。當(dāng)應(yīng)用于混合乳品培養(yǎng)時(shí)，T-RFLP分析表現(xiàn)出很好的可重復(fù)性。用這種方法和結(jié)果研究包括乳酸乳球菌乳酸亞種菌株和檸檬明串珠菌菌株的兩種混合初始物的動(dòng)力學(xué)，并和用純培養(yǎng)獲得的做對(duì)比。這些數(shù)據(jù)顯示了用T-RFLP進(jìn)行半定量微生物數(shù)量分析

4、的適宜性。某些微小的差別可以用菌落計(jì)數(shù)不能被檢測(cè)到的新陳代謝活性細(xì)胞的出現(xiàn)來解釋。以RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP可以作為傳統(tǒng)方法之外的另外一種選擇，用于研究相對(duì)簡(jiǎn)單的微生物（比如確定乳品起始物的培養(yǎng)物）生態(tài)系統(tǒng)的新陳代謝活性的群體動(dòng)力學(xué)。關(guān)鍵詞：乳品初始物；RT-PCR；半定量；T-RFLP1前言幾種奶酪生產(chǎn)中常用的初始培養(yǎng)物通常包括成酸性的乳球菌，和一些通常屬于乳酸乳球菌乳酸亞種、二丁酮鏈球菌和明串珠菌屬某些種的利用檸檬酸鹽的菌株。這些培養(yǎng)菌對(duì)于器官感覺的特征的發(fā)展是非常重要的（Carcobaetal.,2000.）。確定的菌株的初始物已經(jīng)被奶酪制造商日益增多地采用，作為一種嘗試來解決與

5、未受控制的自然發(fā)酵相關(guān)的問題。這對(duì)于奶酪的質(zhì)量有積極的效果。因?yàn)檎麄€(gè)發(fā)酵過程中菌株的平衡是一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，所以需要監(jiān)控任何對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的暫時(shí)影響，這些影響可能改變想得到的奶酪的特性的正確過程。（Giraffa,2004）培養(yǎng)作為一種評(píng)價(jià)食品中微生物群落多樣性和動(dòng)力學(xué)的方法已經(jīng)有幾十年了。以培養(yǎng)為基礎(chǔ)的方法被長(zhǎng)期接受并獲得普遍成功，但是這些技術(shù)費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且在某些情況下不一定能提供微生物群落組成的可靠信息。未知的和不可培養(yǎng)的種的出現(xiàn)以及樣本的混合和稀釋步驟會(huì)對(duì)微生物的生存能力產(chǎn)生影響，能夠?qū)е聦?duì)產(chǎn)品真實(shí)生態(tài)學(xué)組成的失真的觀察（Fleet，1999）。而且，在不利條件下，比如營(yíng)養(yǎng)耗盡、低溫和其他壓力

6、，某些微生物能進(jìn)入可生存的但不可培養(yǎng)（VNC）的狀態(tài)。VNC狀態(tài)的微生物仍然具有新陳代謝活性但是不能在通常支持它們生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上形成菌落，因此它們不能被傳統(tǒng)的方法發(fā)現(xiàn)。為了克服這些問題，免培養(yǎng)法比如變性梯度凝膠電泳/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）、熒光原位雜交（FISH），或者以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)比如長(zhǎng)度異質(zhì)PCR（LH-PCR）和末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（T-RFLP）在過去幾年得到發(fā)展（GiraffaandNeviani,2001）。T-RFLP是一種分析不同細(xì)菌的16srRNA的差異，并提供微生物種群結(jié)構(gòu)信息的方法（Osbornetal.,2000）。

7、它是以限制性核酸內(nèi)切酶消化熒光末端標(biāo)記的PCR產(chǎn)物為基礎(chǔ)的。單獨(dú)的末端限制性酶切片段（T-RFs）被電泳分開并由熒光信號(hào)亮度量化。依靠微生物群落的物種組成，獲得明顯的外形（T-RF圖案），一種代表一個(gè)物種的存在。一個(gè)相對(duì)定量的分布可以獲得，因?yàn)槊總€(gè)頂點(diǎn)的熒光密度是和混合物中每個(gè)物種的DNA量成比例的。然而，PCR的偏差可能對(duì)微生物群落真實(shí)組成的量化產(chǎn)生消極的影響（SuzukiandGiovannoni,1996;Suzukietal.,1998）。以DNA為基礎(chǔ)的方法的缺點(diǎn)是不能區(qū)分活的和死的生物體，因?yàn)槿芙饧?xì)胞中的DNA能夠在自然環(huán)境中存在很長(zhǎng)時(shí)間（Bentsinketal.,2002;Wo

8、lffsetal.,2005）。因此，以DNA為基礎(chǔ)的PCR不能區(qū)分生活的、VNC和死細(xì)胞，這就限制了它用于監(jiān)控目的的使用（Sheridanetal.,1998）。在死細(xì)胞中RNA比DNA降解的快（VanderVlietetal.,1994），因此，逆轉(zhuǎn)錄酶PCR（RT-PCR）可能是生存能力、新陳代謝活力和細(xì)胞完整性的一個(gè)好的指示器（Bentsinketal.,2002）。這項(xiàng)工作的目的是檢驗(yàn)與RT-PCR相連系的T-RFLP監(jiān)控確定微生物種群（比如乳品確定菌株的初始物）的新陳代謝活性部分的群體動(dòng)力學(xué)的能力。在這一點(diǎn)上，研究了整個(gè)發(fā)酵過程中兩種確定菌株的初始物的成分的演變。為了減少PCR的偏

9、差，這種方法被最優(yōu)化并且檢驗(yàn)了它的可重復(fù)性。2材料與方法2.1細(xì)菌菌株和生長(zhǎng)條件本研究中使用的細(xì)菌菌株包括從人工奶酪中分離的兩株檸檬明串珠菌菌株（IPLA621和IPLA1687）和一株乳酸乳球菌乳酸亞種菌株（IPLA947）（Cuestae=qtal.,1996）。明串珠菌屬在MRS肉湯（Biokar,Beauvais,France）和乳球菌在M17（ScharlauChemie,Barcelona,Spain）中被常規(guī)地繁殖。2.2確定菌株初始物培養(yǎng)兩種確定菌株初始物培養(yǎng)物在10%（wt/vol）復(fù)配脫脂乳（RSM）中準(zhǔn)備；培養(yǎng)物A包括乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947和檸檬明串珠菌IPLA

10、621，培養(yǎng)物B包括乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947和檸檬明串珠菌IPLA1687。前一夜的肉湯培養(yǎng)物在乳中1%被轉(zhuǎn)接，給與起始的種群比率，大約是31.3，分別為乳球菌和明串珠菌。培養(yǎng)物在30培養(yǎng)，并于0，3，6，9和24小時(shí)取樣。2.3微生物分析10倍稀釋法在四分之一濃度套環(huán)溶液被使用，在含有萬古霉素（30mgml-1）的MRS瓊脂和為明串珠菌準(zhǔn)備的蔗糖（2%wt/vol）或者為乳球菌準(zhǔn)備的加入環(huán)己米特的M17瓊脂中進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)。平板在30培養(yǎng)48小時(shí)。2.4DNA提取在MRS或者M(jìn)17培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的純培養(yǎng)物的DNA用如前文描述的基于chelex的程序進(jìn)行提取。分離的DNA在使用前在-20

11、溫度下保存。2.5從培養(yǎng)物中提取RNA用9mlEDTA（1%wt/vol,pH12）預(yù)處理從乳培養(yǎng)物得到的1ml樣品，使凝固的酪蛋白分散以利于細(xì)胞的分離。樣品在8000g離心5分鐘，然后用TEbuffer洗兩次。沉淀物在含有l(wèi)ysozime（20mgml-1）的100l的TES中重懸，然后37培養(yǎng)30分鐘。提取RNA使用Trizol公司的試劑（InvitrogenS.r.L.,Milano,Italy），按照廠家提供的說明書進(jìn)行操作。沉淀物在50l用DEPC處理的水中重懸，污染DNA消化在5U的AmplificationGradeDNA酶I（SigmaAldrich,Milano,Italy）

12、在廠家給定的條件下。RNA的量和純度用260和280nm的光密度確定（Sambrooketal.,1989）。提取的RNA在使用前保存在-80。2.6引物選擇擴(kuò)增16SrRNA可變區(qū)的A域的基因，使用熒光標(biāo)記的正向引物63F（5V-6FAMCAGGCCTAACACATGCAAGTC-3V）（Marchesietal.,1998）和未標(biāo)記的反向引物355R（5V-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3V）（Suzukietal.,1998）。.2.7RT-PCR使用GeneAmpEZrTthRNAPCR試劑盒（AppleraItalia,Monza,Italy），按照廠家的說明進(jìn)行一步PCR。

13、反應(yīng)在終容量為25l的體系中進(jìn)行，包括5l的5EZbuffer，3l的dNTP混合液（每種dNTP濃度10mM），2.5l的mMMn（OAc）2溶液，每種引物溶液1.25l（10M），1l的rTthDNA聚合酶（2.5Ul-1；AppleraItalia）和2.5l的RNA模板（稀釋到100ngl-1）。反應(yīng)在PerkinElmerthermalcycler（mod.9700;AppleraItalia）中進(jìn)行，反應(yīng)條件為：60初始變性步驟于941min，接下來進(jìn)行循環(huán)，循環(huán)數(shù)由樣品決定（10，20，30或者40）。循環(huán)條件為：9415s（變性），4930s（退火），7230s（延伸）。最后一

14、步727min。為了檢查RNA提取物中可能存在的DNA污染，按照上述方法使用RNA提取物作為模板進(jìn)行對(duì)照反應(yīng)。2.8PCR擴(kuò)增提取的DNA和對(duì)照PCR在終體積為20l的體系中進(jìn)行，其中含有2l的10Goldbuffer（AppleraItalia），1.6l的dNTP混合液（每種dNTP濃度2.5mM），1.2l的MgCl2（25mM），每種引物的溶液1l（10M），0.1l的AmpliTaqGoldDNA聚合酶（AppleraItalia）和1l的DNA樣品（或者對(duì)照反應(yīng)的RNA）。反應(yīng)條件為，9510min；25個(gè)循環(huán)9540s，4945s，722min；最后一步727min。2.9限制性

15、核酸內(nèi)切酶的選擇乳酸乳球菌乳酸亞種和檸檬明串珠菌（GenBank的編號(hào)分別為AF111948andAB118036）的16srRNA基因序列，用SequenceNavigatorsoftware（version1.0.1,AppliedBiosystems,FosterCity,CA）進(jìn)行排序。為了選擇限制酶，用一種核苷序列限制位點(diǎn)圖在線軟件Webcutter2.0（網(wǎng)絡(luò)地址為：HYPERLINK/cutter/cut2.html/cutter/cut2.html）進(jìn)行分析。酶切反應(yīng)使用10U限制酶DdeI（NewEnglandBiolabs,Beverly,MA,USA），在20l體系中進(jìn)行

16、1.5h，按照廠家的建議的條件進(jìn)行。2.10T-RFLP分析擴(kuò)增產(chǎn)物的變性和電泳按照全面描述的方法進(jìn)行（Lazzietal.,2004）。電泳結(jié)果在非變性條件下用ABIPrism310基因分析儀（AppliedBiosystems）進(jìn)行分析，T-RFLP結(jié)果使用Genescan軟件（version3.1;AppliedBiosystems）進(jìn)行分析。（葉彥波翻譯）3.結(jié)果檢查所選引物可行性以及PCR產(chǎn)物的大小的預(yù)試驗(yàn)用提取于純培養(yǎng)物的DNA。從每個(gè)菌落利用引物擴(kuò)增真細(xì)菌rDNA的A區(qū)域，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)3191bp，為乳酸乳球菌乳酸亞種（Lazzietal.,2004），和長(zhǎng)3181bp的檸檬明串

17、珠菌（數(shù)據(jù)未顯示）。因?yàn)閮烧逷CR產(chǎn)物的大小差異很小，以致無法精確辨別這些種，樣品用DdeI消化產(chǎn)生一種特殊的標(biāo)記了的T-RF。依照在線的限制分析，當(dāng)以DdeI（圖1）消化的時(shí)候，每個(gè)種有一個(gè)獨(dú)特的式樣。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過silico分析被確認(rèn)，乳酸乳球菌表現(xiàn)為一個(gè)2591bp的峰，檸檬明串珠菌的為1411bp（數(shù)據(jù)未顯示）。這些數(shù)據(jù)證明了引物以及挑選的限制酶可以用來確認(rèn)兩個(gè)種的能力。相同的消化也用于T-RFLP分析擴(kuò)增的rRNA。圖1.在線限制分析確認(rèn)的乳酸乳球菌乳酸亞種和檸檬明串珠菌的DdeI的限制位點(diǎn)，乳酸乳球菌乳酸亞種和檸檬明串珠菌的PCR產(chǎn)物以引物63F和355R擴(kuò)增。3.1來自牛奶培養(yǎng)物

18、的RNA提取和RT-PCR從牛奶培養(yǎng)物被提取RNA，RT-PCR用于檢測(cè)提取方法和RT-PCR的適合條件。對(duì)于第一種嘗試，擴(kuò)增反應(yīng)設(shè)置了40個(gè)循環(huán)。一條大約319bp的帶在所有樣品中都可以看到（圖2A，上膠板），確認(rèn)預(yù)期片段的擴(kuò)增。負(fù)對(duì)照缺少擴(kuò)增帶確認(rèn)了沒有DNA污染發(fā)生。（圖2A，下膠板）。RT-PCR的產(chǎn)物利用DdeI酶切消化并利用毛細(xì)管電泳分離產(chǎn)生的片斷。單獨(dú)的乳酸乳球菌牛奶培養(yǎng)物的RT-PCR產(chǎn)物酶切電泳圖在圖2B中顯示。次級(jí)峰（2791，2871，2991和3191bp）連同2591bp的預(yù)期峰同樣被發(fā)現(xiàn)，盡管濃度相對(duì)較低。這些額外的峰對(duì)應(yīng)的是額外的擴(kuò)增子，因?yàn)楫?dāng)同樣的樣品不經(jīng)消化跑

19、毛細(xì)管電泳時(shí)也被觀察到（見圖2C）。在這種情況下，除了3191bp片斷外，對(duì)應(yīng)于3391，3591，3791和3971bp片段的另外的峰也被發(fā)現(xiàn)。這些非預(yù)期的產(chǎn)物可能是由于非特異性的引物退火或者是由PCR時(shí)基因組中16SrRNA的不同拷貝的重結(jié)合造成的，不同的產(chǎn)物恰好可以反映16SrRNA的序列特異性（WangandWang，1997）。DdeI酶切消化在所有片段的3端產(chǎn)生了一個(gè)60bp（事實(shí)上是28和32bp的二個(gè)片斷，因?yàn)橄拗莆稽c(diǎn)在287bp）的非標(biāo)記片斷（圖2D），顯示序列特異性更靠近5端。缺失這一個(gè)60bp片斷可以解釋產(chǎn)物消化后觀察到的五個(gè)峰中四個(gè)的出現(xiàn)，也就是2591（主要產(chǎn)物），2

20、791，2991和3191bp。對(duì)應(yīng)于3971bp的峰在被消化的樣品中沒有出現(xiàn)，或許因?yàn)樵谙陂g的稀釋使它的濃度太低未被發(fā)現(xiàn)。被消化的樣品（圖2B）中的2871bp的峰與假終端限制片斷的形成相關(guān)（假的T-RFs）。這些假片斷在PCR期間因?yàn)椴糠謫捂?6SrRNA模板的形成被起始，可能是由于模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致聚合酶停止。因?yàn)橄拗菩蛢?nèi)切酶需要雙鏈DNA，因此終點(diǎn)的限制位點(diǎn)不具有功能（Egert和Friedrich.2003）。在我們的情況，總DNA中的一些在第一個(gè)限制位點(diǎn)不被DdeI酶切產(chǎn)生一個(gè)259bp的片斷，而是在第二個(gè)位點(diǎn)酶切因此產(chǎn)生一個(gè)2871bp的假T-RF（見圖1）。相似的結(jié)果在檸

21、檬明串珠菌中也獲得，呈現(xiàn)出1601，1791和2871bp的三個(gè)次級(jí)非預(yù)期峰（數(shù)據(jù)未顯示）。3.2.RT-PCR和T-RFLP的條件最佳化PCR循環(huán)數(shù)對(duì)于檢測(cè)DNA的影響在牛奶的乳酸乳球菌純培養(yǎng)物上被評(píng)估。當(dāng)設(shè)置10個(gè)循環(huán)時(shí)，最初的2591bp的T-RF是被發(fā)現(xiàn)的唯一峰。循環(huán)數(shù)的逐漸增加導(dǎo)致另外的峰出現(xiàn)。2871bp的假T-RF在20個(gè)循環(huán)之后被觀察到，而在30個(gè)循環(huán)之后由于錯(cuò)配起始的其他次級(jí)峰也被觀察到（數(shù)據(jù)未顯示）。盡管使用10個(gè)循環(huán)可以把次級(jí)峰的減到最低，但由于相對(duì)產(chǎn)生的主峰的面積太小，種群數(shù)目的微小變化可能會(huì)導(dǎo)致信號(hào)的完全消失，這使得這樣的條件不可行。因此，20個(gè)循環(huán)對(duì)于進(jìn)一步的分析是

22、最好的選擇（表1）。圖3顯示了對(duì)應(yīng)于從牛奶培養(yǎng)的乳酸乳球菌IPLA947純培養(yǎng)物的主要RT-PCR產(chǎn)物（3191bp）的峰區(qū)域，以及其相應(yīng)的DdeI消化后獲得的主要的T-RF（2591bp）?？梢杂^察到未消化的DNA的峰面積在超過20個(gè)循環(huán)后并沒有增加。然而，被消化的DNA（由于限制性內(nèi)切酶切，與未消化的DNA相比被稀釋4倍）的峰面積在PCR循環(huán)的數(shù)量從20個(gè)循環(huán)到30個(gè)循環(huán)的過程中增加了。這暗示PCR產(chǎn)物過量下所引起的一種DNA定量的飽和效果。為了要避免系統(tǒng)的飽和，這種飽和可能會(huì)造成一些種群成員的低估，一個(gè)120,000個(gè)單位的峰面積被設(shè)為準(zhǔn)確測(cè)量的上限。圖2.（A）上面的膠板:從牛奶培養(yǎng)物

23、提取的RNA擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后的RT-PCR產(chǎn)物。2到7泳道：?jiǎn)蝹€(gè)培養(yǎng)物（2,3:IPLA947；4,5:IPLA621;6,7:IPLA1687）。8到11泳道：混合培養(yǎng)物（8,9:IPLA947和IPLA621；10,11：IPLA947和IPLA1687）。12泳道：PCR對(duì)照。1和13泳道：分子量DNA標(biāo)記1kb以及DNA梯度標(biāo)記（意大利生命技術(shù)公司，米蘭，意大利）。下面的膠板：對(duì)照PCR確定沒有DNA污染。（B和C）單個(gè)牛奶培養(yǎng)物培養(yǎng)的乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947中提取的總RNART-PCR（40個(gè)循環(huán)）DNA片斷DdeI消化后（B）或未消化的（C）的圖。（D）錯(cuò)配分子次級(jí)T-RF

24、s的形成。擴(kuò)增產(chǎn)生主要的產(chǎn)物（319bp）和一些另外的片斷（339，359，379和397bp）。DdeI消化在所有擴(kuò)增產(chǎn)物中都釋放一個(gè)未標(biāo)記的60bp片斷，和259（主要的消化擴(kuò)增子），279，299，319和337bp大小的T-RF。以287bp的DdeI限制位點(diǎn)未顯示。表1使用不同RT-PCR循環(huán)數(shù)的乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947的16srRNA擴(kuò)增子的限制片斷ND:未發(fā)現(xiàn)。a：主要的T-RF。b：錯(cuò)配分子消化產(chǎn)生的片斷。c：假的T-RF。表2以RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLPa的重復(fù)性a：每個(gè)峰面積通過同一樣品的三次獨(dú)立分析確定，包含一個(gè)乳酸乳球菌和檸檬明串珠菌菌株，在RSM中30培

25、養(yǎng)9h后測(cè)定。獨(dú)立分析包括RNA提取，RT-PCR（20個(gè)循環(huán)），內(nèi)切酶消化和毛細(xì)管電泳。b：檸檬明串珠菌的T-RF。c：乳酸乳球菌乳酸亞種的T-RF。d：假的T-RF。圖3.用螢光強(qiáng)度顯示DNA定量的飽和效果。數(shù)據(jù)表示用DdeI（259bp）消化的或未消化（319bp）在10，20或30個(gè)PCR循環(huán)后RT-PCR擴(kuò)增子主要片段的峰面積。消化樣品的濃度是未消化的四分之一，這是因?yàn)橄襟E的稀釋。3.3T-RFLP的重復(fù)性為了測(cè)試T-RFLP分析的重復(fù)性，培養(yǎng)物A作為樣品，包括乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947和檸檬明串珠菌IPLA621，發(fā)酵后9h取出，分別用于三個(gè)獨(dú)立的分析包括RNA提取，RT

26、-PCR，內(nèi)切限制酶切和毛細(xì)管電泳分析。表2顯示了檸檬明串珠菌（1411bp）和乳酸乳球菌（2591bp）的T-RFs的峰面積，以及假的T-RF（2871bp）的峰面積。所有峰三個(gè)樣品之間的標(biāo)準(zhǔn)差在7%以下。同樣地，峰面積與乳酸乳球菌以檸檬明串珠菌的T-RF之間的比的標(biāo)準(zhǔn)差為4.1%，指示在單一樣品里兩個(gè)菌株相對(duì)定量的重復(fù)性很好。（陳忠良）3.4應(yīng)用T-RFLP監(jiān)測(cè)初始培養(yǎng)物的群體動(dòng)力學(xué)為了測(cè)定T-RFLP監(jiān)測(cè)群體動(dòng)力學(xué)的能力，在牛奶培養(yǎng)物中培養(yǎng)的樣品同時(shí)利用菌落計(jì)數(shù)以及發(fā)酵過程中的T-RFLP的分析，然后對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較。化驗(yàn)包含兩種確定的菌落的起始物，乳酸乳球菌乳酸亞種和檸檬明串珠菌。圖4顯

27、示發(fā)酵中兩培養(yǎng)物的進(jìn)化。培養(yǎng)物A中兩者表現(xiàn)為相似的行為，9h到達(dá)靜止期?？膳囵B(yǎng)細(xì)胞數(shù)直到潛伏期結(jié)束保持不變。在培養(yǎng)物B中，可以在9h之后觀察到檸檬明串珠菌IPLA1687的可培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的減少，可能是被酸和/或其他的壓力條件引起。乳酸乳球菌IPLA947的生長(zhǎng)看起來并沒有因IPLA621或IPLA1687的出現(xiàn)而改變。平行的，RT-PCR擴(kuò)增片段的T-RFLP分析也被進(jìn)行。相應(yīng)每個(gè)菌株T-RF的峰面積被測(cè)量，為了對(duì)新陳代謝活性群體進(jìn)行半定量分析，它們之間的比率也被計(jì)算出來。在培養(yǎng)物A中，T-RFLP分析與發(fā)酵時(shí)期菌落計(jì)數(shù)相比菌落IPLA947和IPLA621的相對(duì)比例的波動(dòng)更大。然而，IPLA9

28、47（75.3%和75.1%）和IPLA621（24.7%和24.9%）T-RFLP和菌落計(jì)數(shù)的平均菌體總數(shù)，分別地，在發(fā)酵的最初9h是相似的。24h后兩種技術(shù)的差異則會(huì)相當(dāng)明顯。通過定量T-RFLP計(jì)算得來的IPLA947的比例比通過菌落計(jì)數(shù)得來的數(shù)據(jù)大。這表明部分細(xì)胞仍具有新陳代謝活力，但是處于VNC狀態(tài)，因此，不能通過接菌發(fā)現(xiàn)。另一方面，培養(yǎng)物B的群體動(dòng)力學(xué)用兩種技術(shù)顯示出相似的結(jié)果（圖5B，5D）。IPLA947的相對(duì)總數(shù)隨著發(fā)酵過程逐漸增加，特別是6h以后當(dāng)IPLA1687的可培養(yǎng)總數(shù)明顯的減少時(shí)。兩個(gè)技術(shù)之間的最大不同在24h再次被發(fā)現(xiàn)。如上討論，VNC細(xì)胞的出現(xiàn),在IPLA168

29、7的情形下，可以解釋經(jīng)由以RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP觀察得來的較高比例。圖4.培養(yǎng)物A中（乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947和檸檬明串珠菌IPLA621）以及培養(yǎng)物B（乳酸乳球菌乳酸亞種IPLA947和檸檬明串珠菌IPLA1687）中RSM30培養(yǎng)的嗜溫乳酪起始培養(yǎng)物通過菌落計(jì)數(shù)測(cè)得的生長(zhǎng)。圖5.乳酸乳球菌乳酸亞種和檸檬明串珠菌在培養(yǎng)物A（A）和培養(yǎng)物B（B）中不同培養(yǎng)時(shí)期的半定量分析。相對(duì)的可培養(yǎng)總數(shù)通過菌落計(jì)數(shù)計(jì)算，每個(gè)菌落的結(jié)果被表示成總cfuml1的百分比。相對(duì)的新陳代謝活性群體（可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的）通過RT-PCR為基礎(chǔ)的T-RFLP分析，結(jié)果表示為TRF峰面積占所有峰面積的百

30、分?jǐn)?shù)。只有峰對(duì)應(yīng)1411bp大小的TRF（檸檬明串珠菌）和2591bp（乳酸乳球菌乳酸亞種）被考慮。（劉暢翻譯）4.討論大部份關(guān)于應(yīng)用T-RFLP監(jiān)測(cè)微生物群體的研究都集中于對(duì)環(huán)境樣品的定量分析，但只有很少的關(guān)于這項(xiàng)技術(shù)的定量可行性的工作被出版（Trothaetal.,2002;Lueders和Friedrich，2003）。所有的作者都贊同T-RFLP應(yīng)用于定量分析具有限制性，因?yàn)樗苤朴谒蟹肿拥姆椒ú焕蛩?。?dāng)處理那些微生物多樣性很高并且具有多樣的細(xì)胞裂解抗性（因此提取的核酸有差異）的復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)時(shí)，這些問題變得更明顯，基因組大小或G+C含量也能導(dǎo)致差異的擴(kuò)大（Suzuki和Giova

31、nnoni,1996;Wintzingerodeetal.,1997;Suzukietal.,1998;Marshetal.,2000）?，F(xiàn)階段的工作中，我們挑選了二個(gè)相對(duì)接近的種組成一個(gè)簡(jiǎn)單的模型，因此由模板的差別擴(kuò)增所引起的差異和復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)比較起來被減到最少。盡管模型簡(jiǎn)單，非預(yù)期產(chǎn)物在silico限制分析中以額外的峰的出現(xiàn)被顯示出來，可能是16SrRNA序列特異性引起的PCR假象（Clementetal.,1998），和對(duì)應(yīng)于假的TRFs峰一樣。即使是分析單一培養(yǎng)物，這些現(xiàn)象也可被觀察到。這些結(jié)果顯示一些問題，當(dāng)處理復(fù)雜的成分未知的樣品時(shí)，通常造成對(duì)微生物群體的種群數(shù)量的過高估計(jì)，因?yàn)?/p>

32、許多這樣的峰可能錯(cuò)誤地被指定給不存在的微生物。在目前的情形，因?yàn)榕囵B(yǎng)物的微生物成分完全被定義，人們可以區(qū)分什么是“真的”和“假的”TRFs，這使得T-RFLP應(yīng)用于這類分析成為可能。因?yàn)門-RFLP的分析以PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ)，它便被這項(xiàng)技術(shù)的固有缺陷所限制。在所有能影響T-RFLP的因素之中，PCR循環(huán)數(shù)在退火過程中最重要，同樣還有錯(cuò)配分子造成的假象以及假的TRFs（Suzuki和Giovannoni,1996;Wang和Wang,1997;Wintzingerodeetal.,1997;Egert和Friedrich,2003;Suzukietal.,1998）。所有的作者都贊同通過減少循環(huán)數(shù)

33、將這些影響減到最小?？紤]到這些，低循環(huán)數(shù)的PCR可以清楚地減少了這些干擾峰。另外地，T-RFLP的分析需要有一個(gè)好的重復(fù)性。T-RFLP分析和依賴培養(yǎng)的方法對(duì)混合培養(yǎng)物中的群體比例比較分析表現(xiàn)出相似的結(jié)果。在發(fā)酵末期兩種方法之間觀察的相對(duì)群體總數(shù)的一些不同可以用可培養(yǎng)的和不可培養(yǎng)的細(xì)胞（但是仍然具有新陳代謝活性）的存在所解釋，不可培養(yǎng)的細(xì)胞只能通過T-RFLP分析和總rRNA的RT-PCR發(fā)現(xiàn)。這種方法當(dāng)有些成員用傳統(tǒng)方法監(jiān)測(cè)不出來時(shí)非常有用，同時(shí)，當(dāng)有來自非可見細(xì)胞DNA存在的情況下利用傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增可能造成區(qū)域總數(shù)的高估，這種方法可以避免這種情況。（Wolffsetal.,2005）。考慮

34、到T-RFLP應(yīng)用于復(fù)雜微生物的群體定量分析的局限性，這一工作證明它可以作為一種更快的以及長(zhǎng)效的，可作為傳統(tǒng)方法備選的研究相對(duì)簡(jiǎn)單微生物生態(tài)系統(tǒng)的新陳代謝活性群體動(dòng)力學(xué)的方法，同樣也適用于商業(yè)的起始培養(yǎng)物。致謝這一工作由西班牙MinisteriodeCienciayTecnolog資助（AGL2000-1611C03-02工程）。JorgeIgnacioSanchez是MinisteriodeCienciayTecnologia的FPI博士獎(jiǎng)學(xué)金的接受者。參考文獻(xiàn)1Bentsink,L.,Leone,G.O.M.,vanBeckhoven,J.R.C.M.,vanSchijndel,H.B.,

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