培養(yǎng)基的選擇

1、培養(yǎng)基的選擇和優(yōu)化（初稿）一、培養(yǎng)基的概念：culture medium是人們提供微生物生長(zhǎng)繁殖和生物合成各種代謝產(chǎn)物需要的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。其 成分和配比對(duì)微生物的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝產(chǎn)物的合成，甚至對(duì)于發(fā)酵工業(yè)的生產(chǎn)工藝都有很 大的影響。二、用途和分類(lèi)：用途：篩選菌種、保藏菌種、檢驗(yàn)雜菌、培養(yǎng)種子、發(fā)酵生產(chǎn)。分類(lèi)：按成分不同:天然：用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分不恒定的天然有機(jī)物配制。例：牛肉膏蛋白豚培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基。合成：化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基。1例：查氏培養(yǎng)基、高氏1號(hào)培養(yǎng)基復(fù)合（半合成培養(yǎng)基）：天然成分+化學(xué)試劑按物理狀態(tài)：固體：加入一定量的凝固劑，瓊脂含量1.5%

2、-3.0%,常用來(lái)微生物的分離、鑒定、活菌計(jì)數(shù)及菌種保藏。 半固體：瓊脂0.3%-0.5%，觀察運(yùn)動(dòng)特征，分類(lèi)鑒定液體：不加任何凝固劑，七大規(guī)模生產(chǎn)及在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行微生物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的研究。按實(shí)驗(yàn)?zāi)康模夯A(chǔ)：適合大多數(shù)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，如牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基加富：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)制成的一類(lèi)培養(yǎng)基。如高糖培 養(yǎng)基選擇：在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)，抑制不需要的微生 物的生長(zhǎng)，有利于所需微生物的生長(zhǎng)。如麥康凱培養(yǎng)基鑒別：用于鑒別不同微生物的培養(yǎng)基，微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基 中的化學(xué)物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化，如EMB培養(yǎng)基三、成分來(lái)源：（人

3、工配制的、適合微生物生長(zhǎng)、繁殖或產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，是微生物學(xué)研究和微 生物發(fā)酵生產(chǎn)的基礎(chǔ)。任何培養(yǎng)基都應(yīng)具備微生物所需要的六大營(yíng)養(yǎng)要素，且其間的 比例合適。）營(yíng)養(yǎng)：有機(jī)體吸取和利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過(guò)程。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：微生物為了生存就必須從環(huán)境中吸取各種物質(zhì)以合成細(xì)胞物質(zhì)、提 供能量以及在新陳代謝中起調(diào)節(jié)作用。這些物質(zhì)就稱(chēng)為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。A微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子。1、水：維持細(xì)胞的膨壓和作為生化反應(yīng)的溶劑。水是構(gòu)成微生物細(xì)胞的重要物質(zhì)，其含量約占微生物細(xì)胞的70%-90%。細(xì)菌 75%-85%，酵母菌70-90%，絲狀真菌85-90%，芽胞50%左右。溶劑：生化反應(yīng)、物質(zhì)的吸

4、收。比熱大。d.供氫體。一般情況下，配制培養(yǎng)基時(shí)，可用自來(lái)水、井水等天然水，但在測(cè)定微生物某些生理 特性、合成產(chǎn)物數(shù)量以及其他要求精確性高的試驗(yàn)時(shí)，則必須采用蒸餾水甚至重餾水，以保 證結(jié)果的準(zhǔn)確。2、碳源 (carbon resource)概念：凡是能夠被微生物用來(lái)構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中碳素來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)， 都稱(chēng)為碳源。碳源是組成微生物細(xì)胞的主要元素，也是異養(yǎng)微生物生命活動(dòng)的能源。碳素養(yǎng)料在微生物細(xì)胞中含量最穩(wěn)定，約占細(xì)胞干重的50%?？勺鳛榕囵B(yǎng)基的碳源物質(zhì)很多，最常用的碳源為葡萄糖，因?yàn)槟芾闷咸烟堑奈⑸?物最多，其他糖類(lèi)如蔗糖、麥芽糖、甘露醇、淀粉、纖維素，以及蛋白質(zhì)、脂肪、有機(jī)酸、 醇

5、類(lèi)、烴等都可作為培養(yǎng)不同微生物時(shí)選擇使用的碳源。自養(yǎng)型的微生物以CO2作為碳素 營(yíng)養(yǎng)在細(xì)胞內(nèi)合成有機(jī)物質(zhì)，故不需要向它們提供現(xiàn)成的有機(jī)碳化物作為碳素營(yíng)養(yǎng) 工業(yè)發(fā)酵中常用作碳源的有:米粉、玉米粉、淀粉、飴糖、紅薯粉等。實(shí)驗(yàn)室常用作的碳源的有：葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘油、甘露醇、有機(jī)酸等。碳源的生理功能：1、作為構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的C素骨架；2、提供機(jī)體生命活動(dòng)所需要的能量。3、氮源(nitrogen resource)概念：凡是能夠被微生物利用來(lái)構(gòu)成菌體物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中氮素來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 都稱(chēng)為氮源。氮素是組成細(xì)胞蛋白質(zhì)的主要成分，也是構(gòu)成所有微生物細(xì)胞的基本物質(zhì)。某些固氮細(xì)菌可利用分子態(tài)氮素，其

6、他微生物都需要化合態(tài)氮作為氮素養(yǎng)料?；蠎B(tài)氮有無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮兩類(lèi),無(wú)機(jī)氮有銨鹽、硝酸鹽等。大多數(shù)真菌利用銨鹽以及硝酸鹽；許多細(xì)菌能利用銨鹽，但對(duì)硝酸鹽則不利用。有機(jī)氮有蛋白胨、牛肉膏或牛肉浸汁、各種氨基酸等,此外,豆芽汁、酵母膏等也是 常用的有機(jī)氮源。一些含蛋白質(zhì)較多的農(nóng)副產(chǎn)品如豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅等?？勺鳛榕囵B(yǎng)放線菌的氮源， 又如魚(yú)粉、蠶蛹等，也可作為培養(yǎng)某些微生物的氮素養(yǎng)料。N源物質(zhì)主要用做微生物合成含氮有機(jī)物質(zhì)，一般不用做能源。少數(shù)自養(yǎng)菌以NH4+ 作為氮源和能源。氨基酸既做碳源，又可以做氮源4、無(wú)機(jī)鹽類(lèi)(礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素)磷、硫、鉀、鈣、鎂、鐵等，一般采用含有這些元素的鹽類(lèi)即可。當(dāng)用天

7、然的植物 性或動(dòng)物性物質(zhì)制備培養(yǎng)基時(shí)，往往不必加這些鹽或只加一部分，因?yàn)樗鼈儽旧砗羞@些元 素。除某些特殊生物的特殊需要外，一般在配制培養(yǎng)基時(shí)，不加微量元素，因?yàn)樵跔I(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 及天然水中已含有一些可供微生物的微量元素。生理功能：1、參與酶的組成：輔助因子或輔酶；2、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性：Mg2+與核糖體；3、微生物生長(zhǎng)的能源物質(zhì)：Fe2+，S；4、控制細(xì)胞的氧化還原電位；5、調(diào)節(jié)和控制細(xì)胞的滲透壓平衡。6、酶的激活劑或抑制劑。5、生長(zhǎng)因子概念：是一類(lèi)需要量很少卻能夠促進(jìn)微生物生長(zhǎng)的小分子有機(jī)物質(zhì)的總稱(chēng)。核苷類(lèi)(嘌吟、嘧啶)；維生素；氨基酸野生型(wild type):不需生長(zhǎng)素而能夠在基礎(chǔ)培養(yǎng)基

8、上生長(zhǎng)的菌株。營(yíng)養(yǎng)缺陷型(auxotroph)：自發(fā)或誘導(dǎo)突變后需要特定生長(zhǎng)物質(zhì)才能生長(zhǎng)的菌株。 常用于遺傳和代謝的研究工作中。6、前體和產(chǎn)物促進(jìn)發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)中，除必須營(yíng)養(yǎng)成分以外，考慮到代謝控制，添加某些特殊功用的物質(zhì)， 調(diào)節(jié)產(chǎn)物的形成，而并不促進(jìn)微生物的生長(zhǎng)，目的在于大幅度提高發(fā)酵產(chǎn)率，降低成本。前體物質(zhì)：是指當(dāng)添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化學(xué)物質(zhì)基本上不改變其分子結(jié)構(gòu)而直接 進(jìn)入產(chǎn)物中的小分子物質(zhì)，從而在一定條件下控制產(chǎn)物的合成方向和提高產(chǎn)量。 在發(fā)酵中添加前體物質(zhì)將有利于產(chǎn)物的合成和顯著提高產(chǎn)量，如苯乙酸及其衍 生物被認(rèn)為是青霉素的前體物質(zhì)。大多數(shù)前提物質(zhì)具毒性，生產(chǎn)中采用少量多次的流程。

9、誘導(dǎo)物(產(chǎn)物促進(jìn)物)：目前工業(yè)用微生物酶多數(shù)為誘導(dǎo)酶，如蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶 等。誘導(dǎo)物的存在能大大強(qiáng)化誘導(dǎo)酶的生物合成。酶的正常底物或底物的類(lèi)似物都 可作為誘導(dǎo)物。在各種微生物酶的發(fā)酵培養(yǎng)基中必須加入誘導(dǎo)物，例如淀粉、 糊精或麥芽糖是淀粉酶或糖化酶的誘導(dǎo)物。只有添加這些物質(zhì)的培養(yǎng)基，才能 獲得高產(chǎn)。四、發(fā)酵生產(chǎn)中常用的培養(yǎng)基有哪些？往往根據(jù)生產(chǎn)的流程和作用：斜面培養(yǎng)基、種子、發(fā)酵、搖瓶。斜面培養(yǎng)基：作用：這是供微生物細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖用的，包括細(xì)菌，酵母等的斜面培養(yǎng)基以 及霉菌、放線菌生抱子培養(yǎng)基或麩曲培養(yǎng)基等。這類(lèi)培養(yǎng)基主要作用是供給細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所 需的各類(lèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。特點(diǎn)：富含有機(jī)氮源，少含

10、或不含糖分。有機(jī)氮有利于菌體的生長(zhǎng)繁殖，能獲得更多的細(xì)胞。 對(duì)于放線菌或霉菌的產(chǎn)抱子培養(yǎng)基，則氮源和碳源均不宜太豐富，否則容易長(zhǎng)菌絲而較少形 成抱子。斜面培養(yǎng)基中宜加少量無(wú)機(jī)鹽類(lèi)，供給必要的生長(zhǎng)因子和微量元素。種子培養(yǎng)基（包括搖瓶種子和小罐種子培養(yǎng)基）：必須有較完全和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別需要充足的氮源和生長(zhǎng)因子。種子培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度不必太高。供抱子發(fā)芽生長(zhǎng)用的種子培養(yǎng)基，可添 加一些易被吸收利用的碳源和氮源。種子培養(yǎng)基成分還應(yīng)考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分相近。發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基是發(fā)酵生產(chǎn)中最主要的培養(yǎng)基，是決定發(fā)酵生產(chǎn)成功與否的重要因素。五、培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)和優(yōu)化：配制原則：“目的明確

11、，營(yíng)養(yǎng)協(xié)調(diào)，理化條件適宜，經(jīng)濟(jì)節(jié)約”對(duì)菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物相偶聯(lián)的發(fā)酵類(lèi)型，充分滿足細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基就能獲得最 大的產(chǎn)物。對(duì)于生產(chǎn)氨基酸等含氮的化合物時(shí)，它的發(fā)酵培養(yǎng)基除供給充足的碳源物質(zhì)外，還應(yīng)該添加足夠的銨鹽或尿素等氮素化合物。發(fā)酵培養(yǎng)基的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度應(yīng)盡可能高些，這樣在同等或相近的轉(zhuǎn)化率條件下有利于提高單位容積發(fā)酵罐的利用率，增加經(jīng)濟(jì)效益。發(fā)酵培養(yǎng)基需耗用大量原料，因此，原料來(lái)源、原材料的質(zhì)量以及價(jià)格等必須予以 重視。細(xì)菌（常用牛肉膏蛋白胨瓊脂）；放線菌（常用高氏一號(hào)）；真菌（PDA）。PH,水活度，氧還電位。以粗代精，以野代家，以廢代好，以簡(jiǎn)代繁，以氮代骯，以纖代糖，以烴代糧，以國(guó)

12、代進(jìn)必須提供合成微生物細(xì)胞和發(fā)酵產(chǎn)物的基本成分。有利于減少培養(yǎng)基原料的單耗，即提高單位營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所合成產(chǎn)物數(shù)量或最大產(chǎn)率。有利于提高培養(yǎng)基和產(chǎn)物的濃度，以提高單位容積發(fā)酵罐的生產(chǎn)能力。有利于提高產(chǎn)物的合成速度，縮短發(fā)酵周期。盡量減少副產(chǎn)物的形成，便于產(chǎn)物的分離純化。原料價(jià)格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易。所用原料盡可能減少對(duì)發(fā)酵過(guò)程中通氣攪拌的影響，以利于提高氧的利用率，降低能耗。有利于產(chǎn)品的分離純化，并盡可能減少產(chǎn)生“三廢”的物質(zhì)。培養(yǎng)基的優(yōu)化設(shè)計(jì)：根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)和培養(yǎng)基成分確定時(shí)一些必須考慮的問(wèn)題，初步確定可能的培養(yǎng)基成分；通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；當(dāng)培養(yǎng)基成分確定后，剩下的問(wèn)

13、題就是各成分最適的濃度，由于培養(yǎng)基成分很多，為減 少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，常采用一些合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法。（正交，拉丁方等）從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)大生產(chǎn)，過(guò)程上轉(zhuǎn)變，參數(shù)變化？不同之處：消毒方式不同：搖瓶是蒸汽靜態(tài)加熱；發(fā)酵罐是直接蒸汽動(dòng)態(tài)加熱，部分是直接和蒸汽混 合，影響培養(yǎng)基的質(zhì)量，體積，PH，透光率等指標(biāo)。接種方式不同：搖瓶是吸管加入，發(fā)酵罐是火焰直接接種（還有其它方式），接種時(shí)，菌 株的損失和菌種的適應(yīng)特性等?？諝獾耐夥绞讲煌簱u瓶是表面直接接觸，發(fā)酵罐是空氣混合接觸，其中CO2的濃度 和氧氣的溶解度情況不同。蒸發(fā)量不同：搖瓶的蒸發(fā)量不好控制，濕度控制好的話，蒸發(fā)量會(huì)少，發(fā)酵罐蒸發(fā)量大， 但可以通過(guò)補(bǔ)料來(lái)

14、解決。攪拌方式不同：搖瓶是以搖轉(zhuǎn)的形式進(jìn)行，對(duì)菌株的剪切力較??；發(fā)酵罐是直接攪拌， 剪切力影響較大。pH控制方法不同：搖瓶一般加入碳酸鈣和間斷補(bǔ)料控制；發(fā)酵罐直接加酸堿，方便。溫度控制不同：搖瓶是空氣直接接觸或者熱傳控制；發(fā)酵罐是蛇罐或者夾套水降溫控制， 應(yīng)注意降溫和加熱的影響。染菌的控制方法不同：發(fā)酵罐可以根據(jù)染菌的周期和類(lèi)型采取一定的措施。搖瓶直接處理。檢測(cè)方法不同：搖瓶量少，不能方便的控制和檢測(cè)；發(fā)酵罐可以取樣或者儀表時(shí)時(shí)檢測(cè)。原材料不同：發(fā)酵罐廉價(jià)粗放，工藝控制和搖瓶有很大區(qū)別。搖瓶和發(fā)酵罐有很大區(qū)別，搖瓶?jī)?yōu)化是培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的第一步，一般用再菌種的篩選，以及作 為反應(yīng)器水平上研究的基礎(chǔ)，從反應(yīng)器水平的優(yōu)化可作為最終發(fā)酵基礎(chǔ)配方。六、培養(yǎng)基的滅菌和消毒常用的方法有：（一）火焰滅菌將物品直接放在火焰上進(jìn)行燒而達(dá)到滅菌的方法。如接種環(huán)、接種