腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)-林星石

1、腫 瘤 細(xì) 胞 培 養(yǎng) 技 術(shù)1Histroy腫瘤類型：間充質(zhì) 上皮 神經(jīng)外胚層 造血源性（1955-1958-1963-1965）In vitro: 原代 傳代 建系（1967-1970）配基成分：純血清 含血清 無血清生物學(xué)特性：細(xì)胞 亞細(xì)胞 酶和分子 2腫瘤細(xì)胞in vitro的特點(diǎn)細(xì)胞保持永生性：自我復(fù)制形態(tài)學(xué)：大小不一 逐漸一致增殖力更強(qiáng)：DNA合成期、分裂期達(dá)50%突變性：不同于正常細(xì)胞，失去穩(wěn)定的控制高分化 變低分化表面性狀：負(fù)電荷數(shù)量正常，貼壁性，抗原性可 變異接觸抑制減弱或消失：懸浮生長特征：成瘤性：移植到動(dòng)物體內(nèi)可成瘤3腫瘤細(xì)胞in vitro 培基RPMI1640：最常用

2、，+1020%FCS，上皮性 或懸浮性（+0.03%谷氨酰胺）DMEM：常用F12： 適用于上皮性癌，如肝癌，L-15： 注意：+2g/L NaHco3 或 +20mmol/L HEPESpH7.2RPMI1640+F12或L-15（1:1）：適用肉瘤4培養(yǎng)液特殊添加劑 常用的促細(xì)胞生長因子及使用的終濃度 添加劑 終濃度 添加劑 終濃度 BSA 10-5mol/ml EGF 5ng/ml transferrin 5-10 g/ml FGF 5ng/ml insulin 5 pg/ml NGF 5ng/ml 氫化可的松 10-5mol/ml 5腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)與常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)相同 一個(gè)細(xì)胞群體，

3、存在多種亞群，復(fù)雜性建株細(xì)胞較正常細(xì)胞易于培養(yǎng)6細(xì)胞分裂增殖的調(diào)控（細(xì)胞周期）多種基因的協(xié)同作用調(diào)控因子： 基因：Cdc2、 cyclin 蛋白磷酸化 蛋白激酶的調(diào)控 胸苷激酶的調(diào)控 負(fù)調(diào)：DNA損傷與DNA修復(fù)：抑制抗性 腫瘤細(xì)胞 7細(xì)胞間的相互影響不同亞群代表不同分化程度的細(xì)胞群 表型、形態(tài)、受體、對因子的反應(yīng)等 均不同不同亞群釋放不同的正負(fù)調(diào)節(jié)因子 (陰陽調(diào)控)8細(xì)胞因子與激素對腫瘤細(xì)胞的調(diào)控一個(gè)重要而復(fù)雜的因素 因素 高分化 低分化胰島素 生長 -凝血孝素 生長 -前列腺素 促進(jìn)（400) 抑制激情素 - 助黏附維生素A 抑制生長及分化_調(diào)整培基中的成分可調(diào)控細(xì)胞的生長與分化9影響培養(yǎng)

4、腫瘤細(xì)胞生長的因素PH營養(yǎng)：如血清效價(jià)低細(xì)胞生長因子的自分泌及旁分泌癌基因抑癌基因的變化排泄廢物的影響細(xì)胞外基質(zhì)的作用細(xì)胞相互間的作用污染10培養(yǎng)技術(shù) - 取材手術(shù)標(biāo)本活檢標(biāo)本胸腹水穿刺細(xì)針頭穿刺內(nèi)窺鏡活檢 關(guān)鍵：新鮮、無菌、及時(shí)、準(zhǔn)確11技術(shù)- 分離純化分離：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等 密度沉降分離純化：反復(fù)貼壁去除成纖維細(xì)胞 自然淘汰去除正常細(xì)胞 利用特異抗原標(biāo)志篩選法( panning) 分亞型 流式細(xì)胞儀分選 克隆建株 高轉(zhuǎn)移株的建立：反復(fù)接種12技術(shù)-培養(yǎng)原代培養(yǎng)：去除纖維細(xì)胞及淋巴細(xì)胞， 防止細(xì)菌、真菌污染。傳代培養(yǎng)：增殖力低的細(xì)胞需要飼養(yǎng) 細(xì)胞適當(dāng)密度, 基本長

5、滿后 傳代, 前10代不穩(wěn)定，注意 培養(yǎng)條件，適當(dāng)調(diào)整培基。13技術(shù)- 鑒定與建株鑒定：組織來源 、形態(tài)特征、核型染色體分析、生長特性、對細(xì)胞因子的反應(yīng)（TNF)、集落形成、致瘤實(shí)驗(yàn)（裸小鼠）建株：生長半年以上，病理診斷、光鏡及電鏡觀察、生長特征、染色體分析、腫瘤標(biāo)志、致瘤及轉(zhuǎn)移情況注意：不是每一腫瘤組織都能建株14應(yīng)用- 腫瘤治療的研究治療藥物敏感性的鑒定與篩選腫瘤的多藥耐藥性的鑒定各種新藥治療的實(shí)驗(yàn)研究 體外：腫瘤的生長（3HTdr摻入） 腫瘤的殺傷率（MTT、51Cr釋放） 體內(nèi)：裸鼠或免疫功能抑制鼠，成瘤率、抑瘤 生長率、轉(zhuǎn)移率、生存時(shí)間及死亡率 作用機(jī)理的研究：基因、蛋白、酶、標(biāo)志、

6、受體15腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用腫瘤細(xì)胞的遺傳特性：各種癌基因及抑癌基因的分析、染色體定位（FISH法）腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為：細(xì)胞周期（FACS)、信號(hào)傳遞腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志與激素、受體變化（免疫細(xì)胞化學(xué)、放射自顯影、酶免疫、熒光免疫、放射免疫、免疫印跡）1617單克隆抗體的制備18單克隆抗體的制備 基本原理：Bunet抗體選擇學(xué)說，每個(gè)B細(xì)胞只能夠產(chǎn)生一種針對它的特異性抗原決定簇的抗體。從一個(gè)祖先B細(xì)胞分裂繁殖形成的純細(xì)胞系，稱為克隆。19單克隆抗體的制備 單克隆抗體定義：來自克隆系的細(xì)胞基因完全相同，產(chǎn)生的抗體完全相同。這種從一株克隆系產(chǎn)生的抗體 單克隆抗體（McAb)。 1975年Kohler 和

7、 Milstein 首先利用細(xì)胞融合技術(shù)制備了永久分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。20單克隆抗體的制備特點(diǎn)：腫瘤細(xì)胞易體外培養(yǎng)和長期生長； B淋巴細(xì)胞 分泌特異性抗體； 二者雜交融合雜交瘤，繼承二者性質(zhì)。 HAT培基：H次黃嘌呤、 A氨基蝶呤 T胸腺嘧啶核苷 21單克隆抗體的制備腫瘤細(xì)胞DNA合成途徑： 葉酸衍生物 氨基酸、小分子化合物合成DNA HGPRT -TK 次黃鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 胸腺嘧啶核苷激酶 核苷酸前體22單克隆抗體的制備HAT特點(diǎn)：“A” 葉酸拮抗物骨髓瘤-骨髓瘤：DNA合成途徑阻斷；缺HGPRT， 不能利用“H”死亡。脾細(xì)胞-脾細(xì)胞：有HGPRT，缺增殖能力死亡。骨髓瘤-脾

8、細(xì)胞：HGPRT+無限增殖能力 存活。23單克隆抗體的制備方法抗原：純度、分子量。1. 細(xì)胞121072. 可溶性蛋白質(zhì)抗原10 100 g動(dòng)物：BALB/C鼠，周齡：68周，雌性佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、脂質(zhì)體24免 疫 方 法1.常規(guī)免疫：腹腔或頸部多點(diǎn)皮下 0 天：基礎(chǔ)免疫抗原+完全佐劑 15天：基礎(chǔ)免疫抗原+不完全佐劑 30天：基礎(chǔ)免疫抗原+不完全佐劑 45天：追加免疫同量抗原 48天：進(jìn)行細(xì)胞融合 25免 疫 方 法備注：1. 細(xì)胞、細(xì)菌、病毒等顆粒性抗原有較強(qiáng)抗原性，可不加佐劑，直接腹腔注射。2. 可溶性蛋白質(zhì)抗原需加佐劑。本研究室經(jīng)驗(yàn)：26免 疫 方 法2. 脾內(nèi)免疫：

9、2.1 0 天：基礎(chǔ)免疫 15 天：脾內(nèi)免疫 18 天：細(xì)胞融合2.2 0 天：脾內(nèi)免疫 4 天：細(xì)胞融合27免 疫 方 法脾內(nèi)免疫優(yōu)點(diǎn)：時(shí)間短，使用抗原量少。 可溶性抗原：210g 細(xì)胞抗原：1 105缺點(diǎn)：效果差于常規(guī)免疫，尤其無基礎(chǔ)免 疫的脾內(nèi)免疫。28免 疫 方 法脾內(nèi)免疫方法： BALB/C小鼠乙醚麻醉，右臥位，消毒，無菌操作剪開皮膚，透過腹膜，用 4號(hào)針頭注射器注入脾臟，盡量刺深，勿刺透，縱軸方向，邊退邊注射或多點(diǎn)注射。注意事項(xiàng)： 抗原體積 0.2 ml，脾內(nèi)逐步注射后，針頭拔出口時(shí)要停留片刻， 縫合切口或用醫(yī)用黏合劑涂抹切口。29免 疫 方 法3 . 弱免疫原免疫方案； 0 天：

10、基礎(chǔ)免疫 30 天：基礎(chǔ)免疫 45 天：基礎(chǔ)免疫 60 天：基礎(chǔ)免疫 75 天：基礎(chǔ)免疫 6個(gè)月內(nèi)，至鼠血清測出抗體產(chǎn)生。靜脈 或脾內(nèi)追加免疫后7296h細(xì)胞融合。30免 疫 方 法4. 體外免疫： 分離小鼠脾細(xì)胞，置 10% 20% FCS RPMI1640培基，加適量滋養(yǎng)細(xì)胞與抗原（可溶性抗原 0.5 5 g/ ml；細(xì)胞性抗原10 5106/ ml），37，5%CO2 培養(yǎng) 3 天，再分離淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞，融合。31單 克 隆 抗 體 制 備一.滋養(yǎng)細(xì)胞制備：1. 機(jī)制：不明，通常認(rèn)為這類細(xì)胞釋放 一種或幾種生長因子，提供必要生長 條件。2. 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備滋養(yǎng)細(xì)胞 正常無感染

11、BALB/C小鼠，處死。 75%乙醇浸泡 510min，32單 克 隆 抗 體 制 備 撕開腹部皮膚， 充分暴露腹腔， 提起 腹膜，剪開，吸管注入5 ml無血清培基， 小心提動(dòng)或輕揉腹膜， 吸出培基。 無血清培基洗2次，細(xì)胞濃度2105/ml, 0.1 ml / 孔/ 96孔，相當(dāng)于 2104。通 常獲2106 5106 只。33單 克 隆 抗 體 制 備二. 骨髓瘤細(xì)胞準(zhǔn)備：Sp2/0, NS-1等1. 復(fù)蘇，20%FCSRPMI-1640培基為好。2. 培養(yǎng)、傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞（1105 5 105/ml），按1：5 1：10 稀釋傳代，2、3天擴(kuò)大培養(yǎng)，選生長狀態(tài)、形態(tài)好對數(shù)生長期細(xì)

12、胞融合用。3. RPMI-1640培基洗3次（1000r/min 5min )34單 克 隆 抗 體 制 備注意事項(xiàng)：1. 骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞活數(shù)應(yīng)在95%，2. 無各種污染，3.骨髓瘤細(xì)胞質(zhì)量保證、生長密度合適。35單 克 隆 抗 體 制 備三. 免疫脾細(xì)胞懸液制備：1. 免疫BALB/C鼠，放眼血致死（收集眼血制成血清）。2. 浸泡于75%乙醇515分，入超凈臺(tái)，打開腹腔（逐次換器械），取脾。3. 剪碎脾臟，注射器內(nèi)芯研磨過100目鋼篩， 平皿預(yù)先23ml RPMI-1640，移入圓底試管，補(bǔ)加適量培基，靜置35分，取上2/3懸液移入50ml離心管，上述反復(fù)23次。36單 克 隆 抗 體 制

13、 備三. 免疫脾細(xì)胞懸液制備：5. 上述培基洗細(xì)胞2次（ 1000r/min 10 min ），6. 不完全培基10ml重懸液，臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)活 脾細(xì)胞數(shù)，1 10 8 2.5 10 8 /只。37單 克 隆 抗 體 制 備四. 50%PEG的準(zhǔn)備： 融合前，稱PEG（mw = 4000) 2g，置小瓶內(nèi)，低壓消毒（8磅），15min,取出立即邊加邊搖加入2ml完全培基，（內(nèi)含0.3%ml二甲基亞楓，以提高融合率），至完全混合，4 保存。用前37 預(yù)熱。要求PEG現(xiàn)配，防止PH變堿。38單 克 隆 抗 體 制 備五. 細(xì)胞融合：1. 將準(zhǔn)備好的骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞混合于 50ml離心管內(nèi)（脾細(xì)胞1

14、10 8，骨髓瘤細(xì)胞1 10 7）。用SP2/0時(shí)，脾細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞以10：1為好；用NS-1，脾細(xì)胞：骨髓瘤細(xì)胞以5：1為好。39單 克 隆 抗 體 制 備2. RPMI-1640培基洗2次（1500r /min/8min）；3. 傾倒上清，吸盡殘留液，輕彈管底， 使細(xì)胞疏松，離心管移至超凈臺(tái)預(yù)先放置的37 水浴。4. 1 ml 吸管吸取 0.8 ml 37 PEG，110 8 脾細(xì)胞+ 0.8 ml PEG，邊加邊搖，60s內(nèi)加完，輕搖1.5 min。5 min內(nèi)搖動(dòng)緩和加入10 ml 預(yù) 溫37 的RPMI-1640。40單 克 隆 抗 體 制 備注意： 第1 min 加 1 ml;

15、第2 min 加 1 ml; 第3 min 加 1.5 ml; 第4 min 加 1.5 ml; 第5 min 加 5 ml; 再補(bǔ)加40 ml。 離心：1000r / min / 5min.41單 克 隆 抗 體 制 備5. 移出上清，取少量HAT小心吹散細(xì)胞，細(xì) 胞移入HAT培基中，按免疫脾細(xì)胞210 5 / 孔/96孔， 加入 0.1 ml 0.2 ml/孔（已加入融合當(dāng)天制備的滋養(yǎng)細(xì)胞）， CO2 孵箱 37 。提示：接種1012塊96孔板，使80%雜交瘤生長為單克隆，減少克隆化次數(shù)，陽性孔不易丟失。42單 克 隆 抗 體 制 備六. 融合細(xì)胞觀察與換液：1. 第23天骨髓瘤細(xì)胞退化、

16、核縮、碎裂， 增生、吞噬碎片；第45天可見小堆雜交瘤細(xì)胞生長。記錄。2. 融合后57天確認(rèn)骨髓瘤細(xì)胞全部死亡， 毛細(xì)吸管吸出0.1ml 0.15ml HAT，換成同量HT培基。43單 克 隆 抗 體 制 備七. 雜交瘤抗體檢測： 培基變黃，雜交瘤細(xì)胞占孔底面積1/4、狀態(tài)好，可測上清液抗體（非分泌性比分泌性雜交瘤長速快），及時(shí)測抗體及時(shí)克隆化，以免目的雜交瘤丟失。 測定時(shí)間：融合后1015天，第次換液3天后，ELISA、冰凍切片熒光技術(shù)等。 陽性孔雜交瘤轉(zhuǎn)入24孔板，1天后細(xì)胞狀態(tài) 好即可克隆化。44單 克 隆 抗 體 制 備八. 克隆化：有限稀釋法。1. 按前述準(zhǔn)備新鮮滋養(yǎng)細(xì)胞用HT培基接種 96孔板，0.1ml/孔。2. 向24孔板加0.9 ml/孔HT，通常每個(gè)待克隆雜交瘤需34孔。3. 用1ml吸管吹散待克隆的雜交瘤細(xì)胞，取適量加入含0.9mlHT24孔板第孔，混勻，吸0.1ml加入第孔，同法稀釋第3孔、第4孔。4. 混勻第1孔細(xì)胞計(jì)數(shù)。45單 克 隆 抗 體 制 備5. 計(jì)數(shù)后從相應(yīng)孔取100個(gè)細(xì)胞（如第3孔細(xì)胞計(jì)數(shù)為1.210 3，則從第3孔取100/1.2 1030.083ml），加入10ml HT，接種預(yù)先加入滋養(yǎng)細(xì)胞96孔板，0.