浙江溫嶺福立氯霉素測定技術(shù)PPT

1、氯霉素測定技術(shù)1背景2002年3月:泰國、越南、印尼、印度、孟加拉;77個樣品中有16個含量超標(biāo)我國出口荷蘭、法國等歐盟國家的乳制品等已被銷毀或退回，歐盟及北美等發(fā)達(dá)國家加強(qiáng)進(jìn)口商品的檢測。 美國和加拿大不容許氯霉素用于最終為人類食用的動物身上；僅批準(zhǔn)用于寵養(yǎng)動物疾病的治療，如貓、狗和馬 歐盟的96/23(EEC)指令中把氯霉素列入禁用藥 : 氯霉素類藥物是A類禁用藥日本規(guī)定所有最終為人類所食用的動物源性食品中氯霉素殘留的容許量必須為零。 2氯霉素分析氯霉素類：別名左霉素，氯胺苯醇。 化學(xué)結(jié)構(gòu) 毒理學(xué)藥物(代謝)動力學(xué)獸醫(yī)上禁止使用代謝物化學(xué)結(jié)構(gòu)測定方法提取和凈化分析: GC/MS-MS等 3

2、氯霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)化學(xué)名:2,2-二氯-N-2-羥基-1-(羥甲基)-2-(4-硝基苯基)-乙基乙酰胺CAS編碼56-75-7。分子式：C11H12O5N2Cl2 分子量：323.14; 4藥理作用和用途 CAP是第一個廣譜抗生素藥，有廣譜抑菌作用，對革蘭氏陽性、陰性菌均有抑制作用，尤其對傷寒、副傷寒桿菌作用更強(qiáng)。其次為大腸桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、流感桿菌和百日咳桿菌等，廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)及獸醫(yī)方面的細(xì)菌性感染疾病的控制和治療，應(yīng)用至今已有40年的歷史。氯霉素的抗菌作用通過在生物體內(nèi)將硝基還原成亞硝基，而后亞硝基不可逆地同線粒體細(xì)胞結(jié)合，抑制了細(xì)菌細(xì)胞壁形成所必需的蛋白質(zhì)的合成。苯環(huán)對位上的硝基

3、可增強(qiáng)這類“苯醇類”物質(zhì)的抗菌作用。作為獸藥,CAP最常被作為獸醫(yī)用的治療和預(yù)防用藥,經(jīng)口服后很快就被吸收。低計量時，CAP表現(xiàn)為抑菌作用。殺菌活性出線在較高劑量時。 5用法及用量 混飼：每1000公斤飼料，雞預(yù)防用100-300克，治療用500-1000克；混飲：每升水，雞預(yù)防用100-300毫克，治療用500毫克。內(nèi)服：一次量，每公斤體重，犢牛、狗、貓10-20毫克，每日二次。靜脈、肌肉或皮下注射：一次量，每公斤體重，禽20-50毫克；豬、羊10-20毫克；狗、貓20毫克，每日二次。 6毒理學(xué)氯霉素主要毒性反應(yīng)是抑制骨髓造血機(jī)能，可引起粒細(xì)胞及血小板減少及再生障礙性貧血?？诜袗盒摹捠?、

4、腹脹、腹瀉等胃腸道反應(yīng)。目前一些國家和地區(qū)，還把氯霉素作為一種畜用飼料添加劑和動物疾病的治療用藥，這樣必然會造成動物肌肉、內(nèi)臟和乳汁中的殘留，直接或間接威脅人類的健康。為此世界各國紛紛在臨床上已嚴(yán)格控制使用。 7藥物(代謝)動力學(xué)通過用同位素示蹤的的方法研究。發(fā)現(xiàn)CAP排泄的主要途經(jīng)是:糞便（64.3%）;尿(16.0%),代謝:除了未經(jīng)變化的CAP,有CAP-葡糖苷酸、CAP-堿、CAP-乙醇、CAP-草氨酸、CAP-乙酰芳基胺等。 8氯霉素高穩(wěn)定性較長的殘留時間當(dāng)母體化合物殘留量降到檢測線以下,其與蛋白質(zhì)結(jié)合的代謝物仍然能檢測到 9氯霉素測定技術(shù)1) HPLC法 a.色譜柱:通常用C18柱

5、或C8柱。 b.流動相：通常用甲醇-水；0.01M乙酸鈉緩沖液(PH4.3)-乙腈。 c.UV測定波長：有280;278;270和285nm等。HPLC法測定低限較差。一般在10ppb 10氯霉素測定技術(shù)2）HPLC/MS法 HPLC條件如上， 費(fèi)用昂貴。 HPLC/MS/MS檢測，測定低限一般在 0.1ppb。 11氯霉素測定技術(shù)3) GC法GC法包括GC-ECD法和GC-MS法。在用GC法測定時，要將CAP衍生化。由于硅烷化條件不同，可生成不同的產(chǎn)物，為了提高硅烷化程度，一般用：BSTFA99%+1%TMS; 12氯霉素測定技術(shù)4) ELISA法（酶聯(lián)免疫法）國外已有商品試劑合供應(yīng)市場。只

6、限于樣品篩選。 13氯霉素檢測特點(diǎn)沸點(diǎn)高極性強(qiáng)質(zhì)譜的背景噪音高衍生化14衍生化的作用在GCMS方法分析樣品時，對羥基、胺基、羧基等官能團(tuán)進(jìn)行衍生化有十分重要的作用，主要表現(xiàn)在：改善樣品的氣相色譜性質(zhì)。如羥基、羧基等氣相色譜特性不好。改善樣品的熱穩(wěn)定性。改善樣品的分子質(zhì)量。分子量增大，有利于樣品與基質(zhì)的分離。改善樣品的質(zhì)譜行為。引入鹵素或吸電子基團(tuán)，是樣品可用CI檢測，提高靈敏度。分離手性化合物。15GC-MS方法中常用的衍生化方法硅烷化(silylation)?；?acylation)烷基化(alkylation)16判斷衍生化反應(yīng)的指標(biāo)反應(yīng)是否迅速、定量進(jìn)行，反應(yīng)重復(fù)性好壞，反應(yīng)條件是否溫和

7、，是否容易操作。反應(yīng)選擇性高，最好只于目標(biāo)化合物反應(yīng)。衍生化產(chǎn)物只有一種，反應(yīng)的副產(chǎn)物和過量的衍生化試劑應(yīng)不干擾目標(biāo)化合物的分離和檢測。衍生化試劑通用性好，價廉易得。17衍生化方法應(yīng)用不當(dāng)?shù)谋锥酥涎苌赡軗p傷色譜柱。某些衍生化試劑需氮?dú)獯蹈伞Ｑ苌煌耆?，影響靈敏度。衍生化試劑不當(dāng)，產(chǎn)物分子量過大?？傊?，GCMS檢測中選用衍生化試劑時，除了和氣相色譜法相同的準(zhǔn)則外，還應(yīng)注意衍生物的質(zhì)譜特性：質(zhì)量碎片特征性強(qiáng)，分子量適中，適合質(zhì)量型檢測器檢測，有利于與基質(zhì)干擾物的分離。18硅烷化衍生化方法是氣相色譜樣品處理中應(yīng)用最多的方法，它是利用質(zhì)子性化合物（如醇、酚、酸、胺、硫醇等）與硅烷化試劑反應(yīng)，形

8、成揮發(fā)性的硅烷化衍生物。19常用的硅烷化試劑硅烷化試劑中的烷基硅烷基和反應(yīng)物中的羥基或胺基上的氫發(fā)生交換，形成烷基硅烷基產(chǎn)物。常用的硅烷化試劑有：N，O雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）和N，O雙三甲基硅基乙酰胺（BTA）：能衍生化胺基和羥基。常用于體內(nèi)藥物及其代謝物的檢測。N甲基叔丁基二甲基硅基三氟乙酰胺（MTBSTFA）：常用于藥物、類固醇的檢測。由于叔丁基二甲基硅基有較大的空間效應(yīng)，有些胺基較難衍生化。在質(zhì)譜檢測中，該衍生物很容易失去叔丁基形成較強(qiáng)的(M-57)+離子，有利于作為MS-MS的母離子。N甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）：最常用的硅烷化試劑之一。衍生化也是引入三甲基硅

9、基。20硅烷化的技術(shù)要點(diǎn)常用的硅烷化試劑的一般衍生化條件：在吹干的提取物殘渣中加入100l的MSTFA或BSTFA，加入50 l的吡啶或乙腈，或用事先配好的衍生化試劑中加催化劑（三甲基碘硅烷TMSI或三甲基氯硅烷TMSCI）和抗氧劑（硫代赤蘚糖醇）。衍生化小瓶加蓋后在60oC衍生化530min，或微波衍生化23min，視不同化合物而定。殘渣吹干水分對衍生化十分關(guān)鍵。因?yàn)檠苌噭㎝STFA和BSTFA遇水立即分解。21衍生化氯霉素衍生物22技術(shù)發(fā)展趨勢 1）開發(fā)高靈敏的檢測方法的研究，降低測定檢測限；2）利用新的如：GC/NCI，GC/MS/MS、HPLC/MS、HPLC/MS/MS技術(shù)提高定性能力；3）建立快速、靈敏的篩選方法： ELISA試劑合的開發(fā)：4）建立適用于不同機(jī)體的靈敏度高、定性能力強(qiáng)