動物細胞培養(yǎng)制藥工藝課件

1、第十七章 動物細胞培養(yǎng)制藥工藝動物細胞培養(yǎng)的應(yīng)用動物細胞培養(yǎng)制藥工藝17.1 制藥動物細胞的表達系統(tǒng)與特征17.2 基因工程動物細胞系的構(gòu)建17.3 動物細胞培養(yǎng)基的制備17.4 動物細胞培養(yǎng)技術(shù)17.5 培養(yǎng)過程檢測與工藝控制17.1制藥動物細胞的表達系統(tǒng)與特征一、動物細胞的結(jié)構(gòu)與功能二、制藥動物細胞的種類三、生產(chǎn)用細胞系四、動物細胞的生產(chǎn)特征17.1制藥動物細胞的表達系統(tǒng)與特征 1.動物細胞的結(jié)構(gòu)與功能2、動物細胞培養(yǎng)的代謝特征葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代謝的前體。葡萄糖限制:通過增加谷氨酰胺消耗得以補償，反之亦然。葡萄糖代謝：糖酵解為主，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累

2、。另一條途徑為TCA循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生CO2和水。一小部分為戊糖磷酸途徑，生成4、5、7碳糖和NADPH。中間產(chǎn)物進入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝。葡萄糖代謝旺盛，產(chǎn)生大量乳酸，對細胞有毒性。三羧酸循環(huán)2、動物細胞培養(yǎng)的代謝特征谷氨酰胺代謝：脫氨、轉(zhuǎn)氨等，合成其他非必需氨基酸。脫氨作用：生成谷氨酸，脫氨產(chǎn)生的氨，對細胞有毒性。轉(zhuǎn)氨作用：生成嘧啶，嘌呤，氨基糖等合成代謝前體。谷氨酰胺與丙酮酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸，進入培養(yǎng)液并積累。離體動物細胞，轉(zhuǎn)氨是主要代謝途徑；Gln是動物細胞的氮源，Gln受限制時，通過增加其他氨基酸的消耗得以補償。流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整個代謝過程，避免有毒廢物

3、的積累。 蛋白質(zhì)合成場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體，以 mRNA為模板，進行密碼的翻譯。3、蛋白質(zhì)合成，糖基化修飾和分泌表達動物細胞制藥表達系統(tǒng)蛋白質(zhì)糖基化修飾糖基化場所：粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)和高爾基體，加工修飾形成糖基化蛋白質(zhì)，糖基結(jié)構(gòu)易變化。不同細胞系糖基化特征不同，根據(jù)藥物的結(jié)構(gòu)，選擇適宜細胞系。動物細胞制藥表達系統(tǒng)糖基化改造是研究熱點。糖基化蛋白質(zhì)分泌分泌泡與細胞膜融合，把產(chǎn)物釋放到胞外，完成了蛋白質(zhì)的分泌表達。動物細胞制藥表達系統(tǒng)細胞周期：細胞從分裂開始到分裂結(jié)束的一段時間。一個細胞分裂，形成兩個細胞。1224h。4、細胞周期與凋亡四個階段：M期：分裂期，很短，0.51 h分裂間期 G1 S

4、G2 期。 G1期：DNA 復(fù)制前期,差異大 S期：DNA 合成期，68 h G2期：DNA 復(fù)制后期，25 h 細胞死亡的兩種方式：壞死：環(huán)境因素或病原物入侵，細胞受到嚴重傷害時快速膨脹，染色質(zhì)凝聚而死亡，細胞直接裂解。 特征是壞死過程不受細胞自主控制。細胞凋亡：細胞對環(huán)境變化作出的有計劃的、執(zhí)行預(yù)定程序的死亡應(yīng)答過程。特征是細胞收縮，細胞核和DNA斷裂，同時被膜包裹形成凋亡小體。4、細胞周期與凋亡動物細胞制藥表達系統(tǒng)顯微鏡下凋亡的細胞形態(tài)反應(yīng)器中的死亡形式主要是凋亡不同細胞凋亡發(fā)生不同原因：缺乏生長因子或血清、營養(yǎng)受限和逆境等均可引發(fā)凋亡發(fā)生。細胞培養(yǎng)中需嚴格控制條件，防止細胞凋亡。動物細

5、胞制藥表達系統(tǒng) 5、制藥動物細胞表達系統(tǒng) 5.1 哺乳動物細胞表達系統(tǒng) 5.2 昆蟲表達系統(tǒng)基于細胞來源：原代細胞，傳代細胞。基于細胞壽命：有限細胞系，無限細胞系?；诩毎娜旧w數(shù)目：二倍體細胞系，異倍體細胞系?；讷@得方式：工程細胞系，癌變細胞系?；谏L特性：貼壁依賴型，非貼壁依賴型5.1 哺乳動物細胞表達系統(tǒng)1、細胞系的分類動物細胞制藥表達系統(tǒng)概念：是生長和壽命有限的細胞，經(jīng)過若干傳代培養(yǎng)后失去增殖能力，老化死亡。特點：有限生長（時間），有接觸抑制性（密度）。舉例： WI-38、MRC-5、2BS等用于藥品生產(chǎn)，曾經(jīng)廣泛應(yīng)用，但不是理想的生產(chǎn)細胞系。壽命：取決于細胞來源的物種和年齡、器

6、官。人細胞最高培養(yǎng)次數(shù)為5060代。胚成纖維細胞：人，50代；雞胚，30代；小鼠，8代。 （1）有限細胞系動物細胞制藥表達系統(tǒng)概念：細胞在生長基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯集成片，當每個細胞與其周圍的細胞互相接觸時，細胞就停止增殖。特點：保持充足的營養(yǎng)，細胞仍可存活一段時間，但細胞密度不再增加。大多數(shù)細胞：形成單層細胞，有少數(shù)懸浮培養(yǎng)細胞（癌細胞）：無接觸抑制（2）無限細胞系概念是壽命和活性不受傳代次數(shù)影響的細胞系，可連續(xù)培養(yǎng)。也稱為永久細胞系或連續(xù)細胞系。其特點：永生，沒有接觸抑制現(xiàn)象，對培養(yǎng)條件和營養(yǎng)因子等要求較低，倍增時間短，非常適合于制藥工業(yè)生產(chǎn)。動物細胞制藥表達系統(tǒng)（3）工程細胞系采用基因工

7、程技術(shù)對宿主細胞的遺產(chǎn)物質(zhì)進行了修飾改造，獲得具有穩(wěn)定遺傳的獨特性狀的細胞系。方法：融合或重組Namalwa：類淋巴母細胞，懸浮生長。英國Wellcome公司Sendai病毒誘導(dǎo)，大規(guī)模生產(chǎn)干擾素，批準上市。產(chǎn)品逐漸淘汰。WI-38：Wistar Institute（WI），二倍體成纖維細胞系，壽命有限。貼壁生長，對很多病毒敏感，第一個被用于制備疫苗。MRC-5：二倍體成纖維細胞系，生長較WI-38快，對逆境有一定抗性，用于制備疫苗。2、生產(chǎn)用細胞系動物細胞制藥表達系統(tǒng)（1）人源細胞系CHO細胞：Chinese hamster ovary特點：貼壁型生長，也可懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓有較高的

8、忍受能力。最為普遍和成熟表達糖基化蛋白藥物的細胞。多種衍生突變株，高表達。藥物：EPO、HBsAg、G-CSF、凝血因子、DNA酶I（2）哺乳動物細胞系動物細胞制藥表達系統(tǒng)BHK21：baby hamster kidney，成纖維樣細胞，用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白。上市重組凝血因子。Vero細胞系：非洲綠猴腎的成纖維細胞，多倍體核型，貼壁依賴性。Vero E6最為常用，可增殖多種病毒，生產(chǎn)疫苗。動物細胞制藥表達系統(tǒng)（2）哺乳動物細胞系是脾臟B細胞與骨髓瘤細胞的融合細胞特點：無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長，容易轉(zhuǎn)染和生長，大量分泌和高效表達。應(yīng)用：抗體藥物生產(chǎn)。（3）雜交瘤細胞系動物細胞制藥

9、表達系統(tǒng)昆蟲桿狀病毒科核多角體病毒（載體）攜載外源基因，感染昆蟲細胞或幼蟲（宿主），高水平表達外源蛋白質(zhì)。1983：苜蓿尺蠖核多角體病毒秋黏蟲細胞表達系統(tǒng)1984：家蠶核多角體病毒家蠶幼蟲表達系統(tǒng)。應(yīng)用：生產(chǎn)抗體、試劑盒等。日本批準用家蠶系統(tǒng)生產(chǎn)干擾素已上市。常用的昆蟲表達系統(tǒng)：Sf21：來源于秋粘蟲的卵巢細胞。容易放大，高效表達。Sf9：從SF21中分離得到，最常用?？箼C械剪切，無血清培養(yǎng)基的攪拌反應(yīng)器中生長。TN-5B1-4：來源于粉紋夜蛾。表達能力高，能懸浮培養(yǎng)。5.2 昆蟲表達系統(tǒng)家蠶完成基因組測序（西南大學(xué)完成）優(yōu)點：安全：桿狀病毒無致病性，產(chǎn)品安全性受FDA認可易飼養(yǎng)：家蠶喪失了野

10、外生存能力，飼養(yǎng)，發(fā)育快。高量表達：強啟動子，外源基因可超量表達；高效表達：可容納較大的外源基因（12kb），表達數(shù)個外源基因，如抗體，并且裝配成有功能的分子。缺點：翻譯后的加工：昆蟲細胞能進行一系列翻譯后的加工，但與哺乳動物細胞不完全相同；蛋白質(zhì)合成與加工不匹配，修飾效率可能不高，引起溶解性、穩(wěn)定性、免疫性等變化。重組率低，篩選困難，周期長，需要410d。2、優(yōu)點與不足表達系統(tǒng)對培養(yǎng)條件要求嚴格對培養(yǎng)基組成要求高天然結(jié)構(gòu)與活性的藥物6.動物細胞的生產(chǎn)特征對培養(yǎng)條件要求嚴格1、溫度2、氧氣3、pH值 對培養(yǎng)基組成要求高 天然結(jié)構(gòu)與活性的藥物 生產(chǎn)工藝特征17.2 基因工程動物細胞的構(gòu)建17.2

11、.1 表達載體的設(shè)計與構(gòu)建17.2.2 轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)17.2.3 篩選與鑒定病毒載體： 牛痘病毒：構(gòu)建多價疫苗 腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒：腫瘤基因治療 (重組人p53腺病毒注射液；5型腺病毒載體DNA和人p53腫瘤抑制基因重組；術(shù)中、術(shù)后使用可消滅殘留癌)。 桿狀病毒:外源基因表達（昆蟲）。質(zhì)粒載體：穿梭載體，細菌體內(nèi)擴增，在動物細胞中表達。 選擇標記，擴增系統(tǒng)。17.2.1 表達載體的設(shè)計與構(gòu)建1、載體類型動物細胞制藥細胞系構(gòu)建動物病毒啟動子：SV40早期和晚期啟動子、腺病毒晚期啟動子、CMV立即早期基因啟動子。動物基因的啟動子：高表達，延長因子EF-1啟動子、泛素蛋白C啟動子、IgG啟動子。2、

12、啟動子與復(fù)制子啟動子編碼藥物基因終止子，選擇標記動物細胞制藥細胞系構(gòu)建終止密碼子: T(U)AA, T(U)AG,T(U)GA PolyA信號序列：不宜太長，避免能量過度消耗。常用:SV40 polyA(131)、BGH的polyA(225bp)。3、終止子表達載體結(jié)構(gòu)舉例化學(xué)方法：磷酸鈣，樹脂，DEAE-葡聚糖物理方法：基因槍，顯微注射，電擊穿孔生物方法：病毒17.2.2 轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)動物細胞制藥細胞系構(gòu)建轉(zhuǎn)染：通過病毒載體把外源基因?qū)氩溉閯游锛毎募夹g(shù)?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)染動物細胞制藥細胞系構(gòu)建動物細胞制藥細胞系構(gòu)建磷酸鈣轉(zhuǎn)染電擊穿孔物理轉(zhuǎn)染病毒載體的轉(zhuǎn)染病毒感染細胞的過程：吸附，脫殼核酸進入進入細胞

13、核整合動物細胞制藥細胞系構(gòu)建DNA合成途徑阻斷標記，抗生素抗性標記：篩選標記與原理動物細胞制藥細胞系構(gòu)建選擇劑基因作用機理甲氨喋呤dhfr二氫葉酸類似物，競爭性抑制DHFR活性。氨喋呤Tk抑制正常途徑dTTP合成5-溴脫氧尿苷Tk阻斷dNTP正常合成途徑G418, Zeocinneo干擾核糖體，阻斷蛋白合成小結(jié)與思考題動物細胞培養(yǎng)制藥擴增培養(yǎng)：非選擇性培養(yǎng)基，1-2d篩選培養(yǎng)：選擇性培養(yǎng)基,2-4d更換培養(yǎng)基，23周，獲得單克隆細胞集落。鑒定：對獨立集落進行穩(wěn)定性、表達量、生物活性等鑒定。建庫：按生物制品要求，建立細胞系和建庫，妥善保存。動物細胞制藥細胞系構(gòu)建3、篩選與鑒定、建庫動物細胞培養(yǎng)基

14、制備培養(yǎng)基組成成分培養(yǎng)基種類培養(yǎng)基質(zhì)量控制動物細胞培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基組成成分1、糖類2、氨基酸3、維生素4、無機鹽類5、生長類因子與激素動物細胞培養(yǎng)的種類1、天然培養(yǎng)基2、合成培養(yǎng)基血清（Serum）成分與作用血清（Serum）成分與作用血清（Serum）成分與作用2、合成培養(yǎng)3、無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)基質(zhì)量的控制1、培養(yǎng)用水質(zhì)2、緩沖液Ca,Mg離子具有細胞凝集作用3、生理鹽水和平衡鹽溶液3、生理鹽水和平衡鹽溶液4、氨基酸配制5、NaHCO3配制6、培養(yǎng)基滅菌動物細胞培養(yǎng)技術(shù)動物細胞培養(yǎng)技術(shù)動物細胞生長和基質(zhì)依賴性動物細胞培養(yǎng)基本過程動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法動物細胞生長和基質(zhì)依賴性1、生長基質(zhì)2、貼壁依賴性細胞3、非貼壁依賴性細胞4、兼性貼壁依賴性細胞動物細胞培養(yǎng)基本過程1、原代細胞培養(yǎng) 過程2、傳代細胞培養(yǎng) 過程動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)方法1、單層貼壁培養(yǎng) 概念與過程1、單層貼壁培養(yǎng) 特點2、懸浮培養(yǎng)3、微載體培養(yǎng)4、固定化培養(yǎng) 90年代以來, 醫(yī)學(xué)界開始嘗試以微膠囊作為基因重組細胞的免疫隔離和運載工具, 利用重組細胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機體生理功能, 治療相關(guān)疾病。 微囊化人胰島 培養(yǎng)15d微囊化小牛腎上腺嗜鉻細胞 培養(yǎng)0d微囊化肝癌細胞 培養(yǎng)40d不同放大倍