基因工程第八章克隆基因的表達課件

1、第九章 克隆基因的表達人粒細胞集落刺激因子 Lac啟動子遺傳信息從DNA到蛋白質(zhì)的傳遞過程中心法則（central dogma）。 一、基因表達：二、克隆基因的表達：外源基因在宿主細胞中表達。外源基因表達載體重組載體導入宿主細胞在宿主細胞中 表達出蛋白質(zhì)提取蛋白宿主細胞：原核細胞或真核細胞。用原核生物作宿主。A dividing E. coli 第一節(jié) 外源基因在原核細胞中的表達原核或噬菌體啟動子MCSSD序列終止子識別原核細胞的啟動子，催化所有的RNA合成。數(shù)個相關的結構基因與其調(diào)控區(qū)結合形成一個表達的協(xié)同單位。一、原核生物基因表達的特點2. 以操縱子為單位1. 只有一種RNA多聚酶有意義鏈

2、5 反意義鏈3 轉(zhuǎn)錄mRNA5 3 翻譯蛋白質(zhì)NC5 3 3. 轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行。4. 不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)。5. 調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上。原核生物中起始密碼子AUG上游712個核苷酸序列因其與16SrRNA 3末端反向互補而被認為在核糖體-mRNA的結合過程中起作用，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。6. mRNA具有核糖體結合位點SD序列Shine-Dalgarno（S-D）sequence:二、原核表達系統(tǒng)的注意事項外源基因不能帶有內(nèi)含子。2. 真核生物不能用基因組DNA ，必須用cDNA 。3. 必須利用原核細胞的調(diào)控元件（啟動子等）4. 防止外源基因產(chǎn)物

3、對宿主細胞的毒害。是DNA上的能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。 大腸桿菌的所有啟動子中都有兩段一致順序（consensus sequence）。 三、原核生物基因表達的調(diào)控1. 啟動子-35 Box 和 -10 Box（1） 啟動子序列 consensus sequences5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -10box（Pribnow Box）TTGACA TATAAT 轉(zhuǎn)錄起始位點17bp5 核糖體結合位點RNA聚合酶 亞基的識別位點 。 -35box原核啟動子共有序列的相對位置（2）翻譯的起始位點核糖體結合位點（ RBS）1）Shine-Dalgarno（SD）

4、 sequence：mRNA上與核糖體16sRNA結合的序列。ribosome binding siteSDmRNA 5AGGAGGUAUG 16S rRNA3 UCCUCCAS-D序列距離AUG的距離也影響翻譯AUG（91%） GUG（8%） UUG（1%）位于SD序列下游。ii）起始密碼：全酶是一個5聚體，含有兩個小亞基，和2兩個大亞基（和），一個亞基。 2. RNA多聚酶 大腸桿菌只有一種類型的RNA多聚酶轉(zhuǎn)錄tRNA，rRNA和mRNA。（1）結構3. 轉(zhuǎn)錄終止子內(nèi)終止子intrinsic terminator：E.coli中促使轉(zhuǎn)錄終止的DNA位置有一段反向回文順序，其后緊接一串A，

5、稱為內(nèi)終止子，形成終止信號。在表達載體克隆位點的下游一般設計一段轉(zhuǎn)錄終止子。啟動子操縱子S-D序列目的基因終止子由于莖環(huán)3段緊接一串A/U的配對，穩(wěn)定性比較差，有利于轉(zhuǎn)錄物脫落而不利于轉(zhuǎn)錄延續(xù)。 原因：反向回文順序被轉(zhuǎn)錄后，立即形成一個莖環(huán)結構，使轉(zhuǎn)錄物與模板之間配對的堿基數(shù)降低，整個減弱了RNA 與DNA的互作 莖環(huán)結構 多聚A/U5-CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAA CT TCT TTCT-3 3-GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAGAAAGA-5(模板)轉(zhuǎn)錄5-CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGG

6、CAUUUU-OH-3(RNA)RNA折疊mRNA折疊 U CC U GGCAUCGCGGCCGCGGCA A CCCAC UUUU3 DNARNA聚合酶脫落大腸桿菌偏愛UAA。一般安置上全部的三個終止密碼UAA，UAG，UGA，防止核糖體跳躍（skipping）。4. 翻譯終止密碼5. 翻譯增強子Translation enhancer能夠顯著增強外源基因在大腸桿菌細胞中的表達效率的特殊序列。T7噬菌體基因10前導序列（簡稱g10-L序列）; 大腸桿菌atpE基因mRNA5-UTR（非翻譯區(qū)）中富含U的區(qū)段。 必須是一種強啟動子能使外源基因的蛋白產(chǎn)量達到細胞總蛋白的10%-30%以上。 應呈

7、現(xiàn)低水平的基礎轉(zhuǎn)錄便于表達毒性蛋白等。應是可誘導型的用溫度或化學試劑誘導。（1）最佳啟動子必須具備的條件 6. 基因工程常用的原核啟動子 來自大腸桿菌的乳糖操縱子。用乳糖或其類似物IPTG充當誘導物，與阻遏蛋白結合，解除抑制。PlacO目的基因（2） 乳糖啟動子lac阻遏物與操縱基因結合四聚體的阻遏物單體的阻遏物阻遏物與DNA的結合乳糖操縱子控制區(qū)的結構阻遏物作用區(qū) CAP作用區(qū) cAMP +CRP= CAPRNA聚合酶作用區(qū)組成：長度：205bp的HaeIII片段 （包括-半乳糖苷酶的前8個密碼）。環(huán)腺苷酸（cAMP）受體蛋白CRP（cAMP receptor protein），cAMP與C

8、RP結合后所形成的復合物稱激活蛋白CAP（cAMPactivated protein ）。當大腸桿菌生長在缺乏葡萄糖的培養(yǎng)基中時，CAP合成量增加，CAP具有激活乳糖（Lac）等啟動子的功能。一些依賴于CRP的啟動子缺乏一般啟動子所具有的典型的-35區(qū)序列特征（TTGACA）。因此RNA聚合酶難以與其結合。 CAP的功能：顯著提高酶與啟動子結合常數(shù)：CAP通過改變啟動子的構象以及與酶的相互作用幫助酶分子正確定向，以便與-10區(qū)結合，起到取代-35區(qū)功能的作用。CAP還能抑制RNA聚合酶與DNA中其它位點的結合，從而提高與其特定啟動子結合的概率。 IPTG有毒、昂貴Sigma 636.00元 /

9、gIPTG =異丙基硫代-D半乳糖 人粒細胞集落刺激因子 人粒細胞集落刺激因子 重組大腸桿菌染色體 （3）色氨酸啟動子trptrpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpBtrpAtrpR阻遏蛋白基因；P1P2啟動子；O操縱基因； 衰減子來自大腸桿菌的色氨酸操縱子。色氨酸操縱子色氨酸合成相關基因5個，編碼3種酶。trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpBtrpA鄰氨基苯甲 酸合成酶吲哚甘油 硼酸合成酶色氨酸 合成酶鏈 鏈 分支酸鄰氨基 苯甲酸磷酸核糖基 鄰氨基苯甲酸CDRP吲哚甘 油-磷酸色氨酸阻遏物轉(zhuǎn)錄（P1是主要啟動子，P2的作用只有3%。）沒有色氨酸時，阻遏蛋白不能與操縱基

10、因結合，能轉(zhuǎn)錄合成色氨酸所需要的酶。苯氨基磷酸脫氧核酮糖 trpRP1O trpEtrpDP2trpCtrpBtrpA阻遏物色氨酸結合不轉(zhuǎn)錄用于表達載體的trp啟動子一般還附帶操縱基因、和部分trpE基因。P1OtrpE目的基因有色氨酸時，阻遏蛋白與色氨酸結合后才能與操縱基因結合，從而阻止色氨酸合成酶類的轉(zhuǎn)錄。 （色氨酸稱為corepressor輔阻遏物）（4）PL和PR啟動子是從噬菌體中得到的一類啟動子，比lac啟動子的活性高8-10倍，比trp啟動子活性高。 cIIINPL/OLcIPMOR/PRCroPEcIIN:抗終止蛋白； Cro: 抗阻遏蛋白(裂解必需的）；cI, cII, cII

11、I: 阻遏蛋白； P:啟動子；O:操縱子。R:右；L:左cIIINPL/OLcIPMOR/PRCroPEcII阻遏物轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄當cI合成后，與OL和OR結合阻止RNA聚合酶，則左右基因都受到抑制。但促進PM使cI進一步轉(zhuǎn)錄。進入溶原期。 早期左邊早期右邊cI857:表達載體常用的噬菌體啟動子是PL。調(diào)節(jié)基因cI 則是選擇了一個溫度敏感性的突變基因cI857。 整合在宿主基因組里，或克隆到載體上。44-45oC時阻遏蛋白失活，外源基因大量轉(zhuǎn)錄cI857PL外源基因32oC時阻遏PL，外源基因不轉(zhuǎn)錄。四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位1. 細胞質(zhì)中表達（1）包涵體（inclusion body）

12、是存在于細胞質(zhì)中的一種不溶性蛋白質(zhì)聚集折疊而成的晶體結構物。形成原理未知。在大腸桿菌細胞內(nèi)表達人生長激素（human growth hormone, hGH）。例：使重組蛋白易于分離、免受蛋白酶降解、不損害寄主細胞回收的蛋白生物活性差。 缺點 優(yōu)點2. 周質(zhì)中表達（1）周質(zhì)（periplasm）格蘭氏陰性大腸桿菌位于內(nèi)膜和外膜之間的細胞結構部分。蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運到周質(zhì)的復雜機理目前不完全清楚優(yōu)點： 容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-內(nèi)酰胺酶（lactamase）、 腸毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等 （3）常

13、用的原核信號肽大腸桿菌的信號肽：能帶領蛋白穿過膜到達周質(zhì)。但以后需要正確切割掉。（2）信號肽（signal peptide）一般位于N端。鼠源RNase、人生長激素信號肽。也能在細菌中起作用。（2）真核信號肽胡蘿卜歐氏桿菌的PelB蛋白。金黃色葡萄球菌的蛋白A。枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡聚糖酶 （endoglucanase）。由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質(zhì)到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。用溶血素（hemolysin）基因構建分泌性融合蛋白；溶血素(hemolysin)是一種可使紅血球細胞溶解的毒素(cytolytic toxin)。在許多病原菌被證明與致病相關。 使在大腸桿菌細胞中表達

14、的外源蛋白分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。3. 胞外表達或與細菌素釋放蛋白（bacteriocin release protein)共表達。載體表達出的外源基因蛋白質(zhì)不與細菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起。S-D序列ATG-外源基因-TAG優(yōu)點五、幾種類型的原核表達載體1. 非融合型表達載體產(chǎn)物結構接近于真核細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結構。缺點：容易被宿主菌的蛋白酶所破壞。哈佛大學的Gilbert實驗室建立的。表達能力強。（1）pKK223-3 載體組成結構： 強啟動子: tac（trp-lac）:trp的-35區(qū)lacUV5的-10區(qū)lac操縱基因操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。終止子：調(diào)節(jié)基因：Lac I宿主菌染色體上的

15、乳糖操縱子系統(tǒng)。 如JM105菌。rrnB（rRNA操縱子的強終止子）S-D插入位點區(qū)S-D序列和插入位點區(qū)：tac PLac OS-D插入位點區(qū)rrnB T宿主lac I載體的其余部分：來自pBR322質(zhì)粒。表達誘導物： IPTG（乳糖的類似物，不會被降解）阻遏物IPTG必須選擇一個有l(wèi)acI的宿主菌。條件：載體表達出的外源蛋白質(zhì)與細菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細胞周質(zhì)中。如：pIN III系列： 2. 分泌型表達載體pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,（1）組成結構Ipplac Plac OS-D/ATGompa插入位點Ipp

16、（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子。調(diào)節(jié)基因：lac I S-D序列和起始密碼ATG。 分泌信號肽：大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。插入位點區(qū)（多克隆位點）。 強啟動子：pIN III-comA1以pBR322為基礎構建的。 調(diào)節(jié)基因不必借助于宿主的lacI.表達出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。啟動子：tac 操縱基因：lacP 調(diào)節(jié)基因：lacI S-D序列3. 融合蛋白表達載體系統(tǒng)-pGEX系列（1）優(yōu)點（2）組成結構便于融合蛋白的分離和純化。lacItac lac OS-D/ATGGST插入位點TGAlacPori：pBR322 ori 融合肽：GST(谷胱

17、甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）GST融合蛋白用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharose)親和層析柱分離純化。（3）產(chǎn)物提純（4）產(chǎn)物分離用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白從谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶GST上切下來。柱（column）GST外源蛋白凝血酶 外源蛋白柱（column）GSTGST洗脫柱（column）可再利用pGEX插入?yún)^(qū)：pGEX-1TCTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC GTG ACT GAC TGA CGALeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr AspEcoR IBamH I凝血酶

18、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶 CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGACGLeu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg AspEcoR IBamH I凝血酶ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTGACTGACIle Giu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser SerEcoR IBamH IXa因子pGEX-2X的插入?yún)^(qū)：pGEX-3X的插入?yún)^(qū)：Sma ISma I（5）其他融合蛋白系統(tǒng)His-tag（組

19、氨酸標簽）：在外源多肽的N端或C端接上6個組氨酸（His）。His-tag序列可與帶二價正電的陽離子相螯，His-tag能與Ni2+柱結合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質(zhì)。人胰島素在大腸桿菌中的表達溴化氰Cyanogen bromide：由于半乳糖苷酶可以和其底物類似物ABTG結合，但不能使之分解，因此可以ABTG為配體進行親和層析純化融合蛋白。 5-TTGACA-3 5-TATAAT-3 -35box -10box（Pribnow Box）六、影響外源基因表達效率的因素1. 啟動子的結構對表達效率的影響RNA聚合酶 亞基的識別位點（1）一致順序（2）-35區(qū)與-10

20、區(qū)之間的距離間隔為17bp時，啟動子最強。（3） -35區(qū)和-10區(qū)的堿基順序越接近一致順序，啟動子越強。5-TTGACA TATAAT 一致順序lactrpPL recAtac Itac II5-TTTACA TATGTT 5-TTGACA TTAACT 5-TTGACA GATACT 5-TTGATA TATAAT 5-TTGACA TATAAT 5-TTGACA TTTAAT -35box-10box5-AGGAGGU-3 S-D序列后面的4個堿基： 如果是A（T）, 翻譯效率最高； 如果是G（C）,效率只有50%或25%。2. 翻譯起始序列對表達效率的影響（1）S-D序列？AUG左側的

21、三個堿基也有影響。 （2）起始密碼AUG-半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左側如果是UAU或CUU時，最為有效； 如果是UUC、UCA或AGG時下降20倍。3. 啟動子與外源基因之間的距離轉(zhuǎn)錄終止區(qū)的存在保證載體不會轉(zhuǎn)錄非必須基因，不必浪費源量和能量、不會干擾正常的表達。增加載體的拷貝數(shù)會增加轉(zhuǎn)錄出的mRNA數(shù)目。增加表達效率。4. 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)對表達效率的影響5.載體拷貝數(shù)及穩(wěn)定性對表達效率的影響6.外源蛋白在菌體中的穩(wěn)定性對表達效率的影響但過度的外源基因的表達會影響宿主的正常生長。選擇強啟動子序列，如tac 等七、提高表達水平常用的方法2. 調(diào)整S-D序列與AUG堿的距離距離過長或過短都影響

22、真核基因的表達。根據(jù)不同的啟動子選擇不同的距離。3. 改變起始密碼下面的幾組密碼子一般為5-9bp。能提高翻譯的起始效率。4. 增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性在外源基因的下游插入“重復性基因外回文序列”能防止mRNA受到35外切酶的攻擊。5. 減輕宿主細胞的代謝負荷合理地調(diào)節(jié)代謝負荷與外源基因高效表達的關系。將宿主生長代謝與外源基因表達分開。（1）誘導表達 一般采用溫度誘導或藥物誘導。cI857阻遏物有活性，抑制PL啟動子，外源基因不表達，宿主大量生長。32C:42C:cI857阻遏物失活，PL啟動子啟動，外源基因高水平表達，宿主生長受到限制。cI857PL外源基因POPL啟動子是溫度誘導型調(diào)節(jié)

23、基因lac I（位于宿主基因組內(nèi)或載體上）始終產(chǎn)生阻遏物。無IPTG:阻遏物與lac操縱基因結合，抑制外源基因轉(zhuǎn)錄。宿主大量生長。有IPTG:阻遏物與IPTG結合，lac操縱基因解放，外源基因大量轉(zhuǎn)錄。宿主生長受抑制。tac啟動子是藥物誘導型（2）表達載體誘導復制 將宿主的生長與載體的復制分開。當宿主大量生長后，再誘導載體質(zhì)粒的復制，增加拷貝數(shù)。當需要宿主大量生長時，抑制載體質(zhì)粒的復制。溫度控制誘導DNA復制的質(zhì)粒pCI10125C37C10拷貝1000拷貝藥物誘導溫度誘導ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點。而且在沒有菌體蛋白質(zhì)合成的條件下（蛋白質(zhì)合成抑制劑，氯霉素等存在下）仍能復

24、制，達到每個細胞的拷貝數(shù)10003000個！N末端：由原核基因編碼一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。（1）設計成融合蛋白 這是避免被降解的最好措施。質(zhì)粒基因產(chǎn)物目的基因產(chǎn)物NC切割6. 提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性防止被宿主的酶降解。Z系列載體：ZUV5載體:lac ZGAATTCCTTAAG外源基因Z2載體:lac ZGGGAATTCCCCTTAAG外源基因Z3載體:lac ZGGAATTCCCTTAAG外源基因提供三種融合插入閱讀框。使用次黃嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，減少宿主菌的蛋白酶合成。 大腸桿菌的htp R基因突變也減少蛋白酶的降解作用。 T4噬菌體的pin基因產(chǎn)物能抑制細菌的蛋

25、白酶?？砂裵in增加到載體上。（2） 使用突變菌株，保護外源蛋白不被降解 減少宿主菌本身的蛋白酶的表達。（3）表達分泌蛋白 細胞質(zhì)外膜內(nèi)膜周間質(zhì)質(zhì)粒染色體“外排”： 蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)跨過內(nèi)外膜到培養(yǎng)液中。 “分泌”： 蛋白質(zhì)從細胞質(zhì)跨過內(nèi)膜到周間質(zhì)中。細菌蛋白分泌的條件：位于N端，一般為15-30aa 。真核與原核的結構相似, 功能相似，可以互換。 堿性氨基酸N疏水氨基酸核心區(qū)切割位點Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信號肽酶外源蛋白 有信號肽。 細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運機制。真核細胞中的分泌蛋白能在大腸桿菌中很好地分泌表達； 但非分泌蛋白很難在大腸桿菌中分泌。信號肽酶I、信號肽酶II等近20多

26、種蛋白質(zhì)的參與。 蛋白質(zhì)內(nèi)有與分泌相關的aa 序列。 為蛋白指明目的地。八、細菌表達載體舉例colE ori lacI intein CBD MCS T7Promotor AmprM13 ori rop 維持拷貝數(shù)pTYB1，pTYB2，pTYB11，pTYB12 幾丁質(zhì)結合區(qū)域1. pTYB1，pTYB2: intein在C端pTYB系列E.coli表達載體：內(nèi)含肽pTYB1, pTYB2的 MCS內(nèi)含肽2. pTYB11，pTYB12:內(nèi)含肽intein在N端pTYB11, pTYB12的 MCS內(nèi)含肽內(nèi)含肽利用Intein 分離純化外源蛋白內(nèi)含肽Intein與Chitin柱結合DTT(二

27、硫蘇糖醇)或-巰基乙醇或半胱氨酸能夠誘導內(nèi)含肽Intein的自我裂解活性3. pTYB系列的特點單柱一步純化蛋白。無需蛋白酶作用即可將目的蛋白從融合蛋白分離 IPTG誘導的T7啟動子分離純化出天然蛋白，不帶有載體蛋白殘基。九、外源蛋白質(zhì)表達后的正確修飾分子內(nèi)二硫鍵、分子間二硫鍵。二硫鍵異構酶催化。使蛋白質(zhì)能夠正確折疊。1. 形成正確的二硫鍵 人胰島素分子抗體分子人血紅蛋白分子亞鐵血紅素如信號肽、內(nèi)含肽（intein）等序列的切割。2. 前體切割 （1）O-糖基化（Ser, Thr）3. 蛋白質(zhì)糖基化 糖基（2）N-糖基化（Asn）Dol：長醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-Ac

28、Glc：N乙酰氨基葡萄糖甲基化、羰基化、磷酸化、乙?；?、硫酸化、丙烯酸化、豆冠酸化、軟脂化4. 氨基酸殘基的修飾 羥脯氨酸甲基組氨酸羥賴氨酸羧基谷氨酸缺乏蛋白質(zhì)的加工。 （如糖基化、氨基酸修飾等）。十、原核細胞表達的缺陷酵母菌、植物原生質(zhì)體、動物培養(yǎng)細胞等。第二節(jié) 外源基因在真核細胞中的表達真核或病毒啟動子MCSPolyA信號終止子外源基因 能在E.coli中克隆和擴增。1. 酵母克隆載體一、在酵母中表達Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; 有合適的克隆位點。 有酵母的選擇標記Ori 有大腸桿菌的選擇標記Ampr、Tetr。Dividing Saccharomyces cerevis

29、iae (bakers yeast) cells由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片段（選擇標記）構成。ColE1酵母Leu 2+如 PYeleu10:（1）整合型載體(YIp) 轉(zhuǎn)化率低（110轉(zhuǎn)化子/微克DNA）。特點：載體上只有細菌的復制區(qū)，沒有酵母的自主復制區(qū)?？膳c受體細胞的染色體DNA同源重組，隨染色體一起復制。不能在酵母細胞中自主復制整合到酵母的染色體上不能從酵母細胞中提取載體。由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的DNA片斷(選擇標記和酵母DNA自主復制順序ARS）構成。大腸桿菌質(zhì)粒酵母ARS （2）復制型載體(YRp) 酵母選擇標記 ARSARS（automously replicating seq

30、uence）:ATTTTATATTTAT G T250bp保守區(qū)特點：轉(zhuǎn)化率高（102-103轉(zhuǎn)化子/微克DNA) 。不穩(wěn)定，容易丟失?？蓮拇竽c桿菌和酵母中提取質(zhì)粒。既能在大腸桿菌中復制，又能在酵母細胞中自主復制。穿梭載體（shuttle vector）在YRp質(zhì)粒中插入酵母染色體的著絲粒區(qū)。特點：YRp質(zhì)粒酵母著絲粒（3）著絲粒質(zhì)粒(YCp) 不易從細胞中提取。行為像染色體，能穩(wěn)定遺傳。 單拷貝存在。由大腸桿菌質(zhì)粒、2m質(zhì)粒及酵母染色體DNA選擇標記構成。 大腸桿菌質(zhì)粒酵母選擇標記 2m質(zhì)粒如pYF92:pBR3222m酵母his 3+（4）附加體型載體(YEp) 2m質(zhì)粒：釀酒酵母的內(nèi)源質(zhì)

31、粒，長度是2m 。含有自主復制起始區(qū)ori和STB序列（使質(zhì)粒在供體中維持穩(wěn)定）。(1)它們是封閉環(huán)狀的雙鏈DNA分子，周長約2m(6kb左右)，以高拷貝數(shù)存在于酵母細胞中，每個單倍體基因組含60-100個拷貝，約占酵母細胞總DNA的30%； (2)各含約600bp長的一對反向重復順序； (3)由于反向重復順序之間的相互重組，使2m質(zhì)粒 在細胞內(nèi)以兩種異構體(A和B)形式存在。 (4)該質(zhì)粒只攜帶與復制和重組有關的4個蛋白質(zhì)基因(REP1、REP2、REP3和FLP)，不賦予宿主任何遺傳表型，屬隱蔽性質(zhì)粒。2m質(zhì)粒特點附加體型載體(YEp)特點：很高的轉(zhuǎn)化活性（103-105轉(zhuǎn)化子/微克DNA

32、）?？截悢?shù)多（25-100拷貝/細胞）。 比YRp穩(wěn)定。2m oripMB1 oriLeu- 酵母原生質(zhì)體感受態(tài)酶去壁CaCl2、 PEG整合到染色體上， 或獨立在酵母細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化Leu營養(yǎng)缺陷型 培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子克隆生長酵母載體大腸桿菌提取插入外源基因鑒定克隆發(fā)酵表達外源基因產(chǎn)物分離、純化2. 酵母轉(zhuǎn)化和表達的一般過程 （1）優(yōu)點 對其遺傳學和生理學的研究比較深入。 小量培養(yǎng)和大規(guī)模反應器中都能生長。 已經(jīng)分離出很強的啟動子。 有翻譯后的加工。 本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的純 化。 安全性高（FDA確認的安全生物），不 需要宿主的安全性檢驗。3. 酵母表達系統(tǒng)的特點 美國食品和藥物管理局(

33、Food and Drug Administration)簡稱FDA 常常發(fā)生質(zhì)粒丟失。 重組蛋白常常超糖基化表達量普遍低。（2）缺點每個N-寡糖鏈上含有100多個甘露糖，分泌困難。正常的高甘露糖寡糖鏈上僅有8-13個甘露糖。分泌型蛋白有時會留在壁膜間隙，診斷試劑丙肝病毒蛋白 抗體HIV-1艾滋病毒外殼蛋白 抗體種類名稱疫苗乙肝病毒表面抗原瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白HIV-1艾滋病毒外殼蛋白4. 在啤酒酵母中表達的重組蛋白人類治療用蛋白藥物上皮生長因子胰島素類胰島素生長因子血小板源生長因子胰島素前體成纖維細胞生長因子集落刺激因子1抗胰蛋白酶 凝血因子VIIIa（1）細胞質(zhì)內(nèi)表達 例：人Cu/Zn-SO

34、D在酵母中表達：5. 在啤酒酵母中表達外源蛋白的方式超氧化物H+H2O2H2O過氧化物酶表達出的SOD修飾正確：起始氨基酸被切掉， 第二個氨基酸丙氨酸也被乙酰化。SOD(超氧化物歧化酶)宿主： 亮氨酸合成缺陷型酵母。GAPD： 甘油醛磷酸脫氫酶（2）表達分泌型蛋白在啤酒酵母中，只有分泌型的蛋白質(zhì)才能被糖基化。 需要糖基化的重組蛋白必須是分泌蛋白。方法：構建載體在重組蛋白的前面加一段編碼酵母菌交配類型因子a1的前導肽，與重組蛋白的N端通過Lys(賴氨酸）-Arg（精氨酸）相連。前導肽（leader peptide）：蛋白質(zhì)分泌到壁膜間隙時，酵母菌的內(nèi)切蛋白酶識別這個切點信號，把重組蛋白正確切下來

35、。信號肽的切割：前導肽Lys-Arg重組蛋白（水蛭素）內(nèi)切蛋白酶6.其它酵母表達系統(tǒng)（1）乙肝表面抗原在嗜甲醇酵母中表達在大型發(fā)酵反應器中容易生長； 以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 有甲醇時，表達的乙醇氧化酶高達胞內(nèi)總蛋白的40%！嗜甲醇酵母（Pichia pastoris）的特點HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作為疫苗。 Aox1啟動子：乙醇氧化酶基因1啟動子（受甲醇激活調(diào)控）。 His4：組氨酸合成所需的組氨酸脫氫酶基因。 Aox1啟動子和3-aox1：整合到特定染色體的位點序列。表達載體構建（整合型）：誘導物：甲醇。產(chǎn)量： 9106劑疫苗/240L發(fā)酵罐。整合到染色體中乙肝表面抗原乙

36、肝表面抗原（2）牛溶菌酶C2在嗜甲醇酵母中的表達作為飼料添加劑促進反芻動物消化。產(chǎn)量：10L，200h連續(xù)發(fā)酵產(chǎn)出50g溶菌酶。乙醇氧化酶基因1乙醇氧化酶基因1二、昆蟲培養(yǎng)細胞表達系統(tǒng)1. 桿狀病毒（Baculovirus）廣泛侵染包括許多昆蟲在內(nèi)的無脊椎動物。（1）侵染周期：兩種形式單獨病毒粒子形式病毒 粒子宿主細胞病毒 粒子侵染釋放病毒 粒子宿主細胞侵染宿主細胞侵染合成多角體蛋白裂解釋放多面體溶解一般使用苜蓿銀紋夜蛾細胞核型多角體病毒（Autographa california multiple nuclear polyhedrosis virus，AcMNPV）多面體形式（2）桿狀病毒的

37、表達特點感染后36-48h，病毒開始合成大量的 多角蛋白。多角蛋白的啟動子特別強。 多角蛋白基因可以被替換掉而不影響 病毒的繁殖。多角體基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面體。3. 轉(zhuǎn)化子篩選通過顯微鏡檢查看是否有多面體形成。源自草地夜蛾的細胞株，在這種細胞中，多角蛋白的啟動子特別活躍。2. 最普遍應用的宿主細胞株（1）轉(zhuǎn)移載體的構建大腸桿菌質(zhì)粒，插入兩段AcMNPV序列以供同源重組。4. 桿狀病毒轉(zhuǎn)化載體桿狀病毒的基因組太大（13kb環(huán)狀DNA），不能直接插入。必須使用同源重組的辦法。多角蛋白的啟動子和終止子及polyA加尾信號。啟動子與終止子之間插入多克

38、隆位點轉(zhuǎn)移載體（2）桿狀病毒載體轉(zhuǎn)化過程 轉(zhuǎn)移載體中插入外源基因 轉(zhuǎn)移載體與野生型AcMNPV DNA共同轉(zhuǎn)染宿主細胞 轉(zhuǎn)移載體與病毒基因組發(fā)生雙交換 外源基因被交換轉(zhuǎn)入病毒基因組中 重組病毒侵染宿主4-5天后即可收獲重組蛋白。4.目前已經(jīng)用桿狀病毒在真核生物細胞中表達的外源蛋白外源蛋白外源蛋白干擾素腺苷酸脫氫酶干擾素淀粉酶前體蛋白Blue tongue virus中和抗原紅細胞生成素HIV-1外殼蛋白流感病毒凝集素白細胞介素2Lassa virus蛋白鼠單克隆抗體脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白類狂犬病病毒蛋白狂犬病病毒糖蛋白Simian rotavirus外殼蛋白抗原組織型纖溶酶原激活劑5. 桿狀病毒大

39、規(guī)模表達存在的問題桿狀病毒侵染昆蟲幼蟲，在幼蟲體內(nèi)表達外源蛋白，成為“低成本蛋白工廠”。 22只粉蚊夜蛾幼蟲4天后表達的人腺苷酸脫氫酶占幼蟲總蛋白的2%-5%。共產(chǎn)出9mg很純的產(chǎn)物。（1）壽命短感染4-5天后宿主細胞裂解或幼蟲死亡。（2）共同轉(zhuǎn)染率低重組率更低。0.1%-1%。6. 構建可持續(xù)表達的載體利用AcMNPV的一個早期基因IE1的啟動子。 IE1基因的轉(zhuǎn)錄不依賴于病毒的其他基因產(chǎn)物，而且在昆蟲細胞中表達正常。 把外源基因插入到IE1啟動子和IE1終止子之間。構成整合型載體。 載體轉(zhuǎn)染宿主細胞后隨即整合到宿主染色體上，實現(xiàn)外源蛋白的持續(xù)表達。載體IE1啟動子外源基因IE1終止子載體三

40、、外源基因在植物中表達根瘤根癌農(nóng)桿菌含有一種內(nèi)源質(zhì)粒，當農(nóng)桿菌同植物接觸時這種質(zhì)粒會引發(fā)植物產(chǎn)生腫瘤（冠癭瘤），所以稱此質(zhì)粒為Ti質(zhì)粒（tumor inducing plasmid）。1. Ti質(zhì)粒: 環(huán)狀雙鏈DNA，1.5105-2.0105bp（185kb）(相當于細菌染色體的3%-5%）。（1）Ti質(zhì)粒的結構 轉(zhuǎn)移DNA，編碼冠癭堿的合成，能隨機整合到植物的染色體上。長度一般為12-24kb，是Ti質(zhì)粒最重要的部分。左邊界右邊界生長素 基因細胞分裂 素基因冠癭堿 合成T-DNA（transfer-DNA）生長素基因:iaaM（tms1）和iaaH（tms2）編碼合成吲哚乙酸（植物生長激素

41、）的酶iaaM: 色氨酸-2-單加氧酶iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶色氨酸吲哚-3-乙酰胺iaaH:吲哚-3-乙酰胺水解酶吲哚乙酸細胞分裂素基因tmr（ipt）：異戊烯轉(zhuǎn)移酶, 催化：二磷酸異戊烯（IPP）異戊烯酰嘌呤單磷酸（IPA）5-AMPiaaM: 色氨酸-2-單加氧酶章魚堿（octopine)胭脂堿（nopaline）NH-(CH2)3-CH-COOHNHCH3-CH-COOHHN=CNH2NH-(CH2)3-CH-COOHNHHOOC-(CH2)2-CH-COOHHN=CNH2Arg與丙酮酸縮合成Arg與酮戊二醛縮合成冠癭堿（opine）的類型和化學結構農(nóng)桿堿（agropine）冠

42、癭堿（opine）的作用 冠癭堿是在冠癭瘤內(nèi)合成并分泌出來的，是農(nóng)桿菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠癭堿。Glu 谷氨酸的二環(huán)糖衍生物。毒性基因（vir）決定土壤農(nóng)桿菌對植物的感染和T-DNA的轉(zhuǎn)移， 進入和整合。毒性基因（vir）的產(chǎn)物能誘導Ti質(zhì)粒產(chǎn)生T-DNA區(qū)域的單鏈拷貝。單鏈拷貝從Ti質(zhì)粒脫離后，可與vir的產(chǎn)物VIR D2蛋白結合，并在VIR D4和VIR B蛋白的幫助下穿過農(nóng)桿菌內(nèi)膜、外膜、壁和植物細胞壁、細胞膜及核膜，最后整合到植物染色體上。單鏈的3和5端分別是左邊界和右邊界區(qū)域，含有25bp重復序列，參與整合。章魚堿代謝基因和胭脂堿代謝基因： 不相容性基因控制

43、Ti質(zhì)粒的不相容性。冠癭堿代謝基因分別編碼代謝這兩種冠癭堿的酶。維持農(nóng)桿菌生長。（1）第一步:植物受傷植物受傷后能分泌酚類化合物（如乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮），誘導Ti質(zhì)粒上的毒性基因表達。2. 農(nóng)桿菌的感染和生存（1）第二步 感染植物（3）第三步 毒性基因（vir）表達T-DNA上的產(chǎn)物催化產(chǎn)生過量的生長素和細胞分裂素，形成植物冠癭瘤。農(nóng)桿菌吸附于植物的表面?zhèn)诓课唬ǔＴ谇o的基部）。virA、virG、virD、virB（4）第四步 T-DNA轉(zhuǎn)移T-DNA被vir基因產(chǎn)物切下來，并運送到植物細胞核里，整合到植物基因組中。（5）第五步 誘導冠癭瘤（6）第六步 土壤農(nóng)桿菌代謝冠癭堿。乙酰丁香

44、酮、羥基乙酰丁香酮3. Ti質(zhì)粒的種類根據(jù)所編碼的冠癭堿（opine），分為（1）章魚堿（octopine)型質(zhì)粒（3）農(nóng)桿堿（agropine）型質(zhì)粒（2）胭脂堿（nopaline）型質(zhì)粒裸子植物、雙子葉被子植物、禾谷類單子葉植物（玉米）。（1）能夠自發(fā)地整合到植物的染色體上。 （2）能轉(zhuǎn)化多種植物。 （3）強啟動子4. Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對象5. Ti質(zhì)粒作為載體的可能性T-DNA的opine合成酶基因上有一個強啟動子，能啟動外源基因的表達。（1）分子量太大（200kb）！ （2）限制性酶切位點太多。 （3）被轉(zhuǎn)化的植物細胞成為腫瘤，不能 再分化。 （4）在大腸桿菌中不能復制。6. 天然Ti質(zhì)

45、粒作載體的缺點（4）冠癭堿合成對于植物無意義。應剔除掉。（5）加入大腸桿菌的ori和選擇標記。（6）加上真核生物的轉(zhuǎn)錄信號和結束信號以 及添加polyA的信號序列。（1）保留T-DNA的轉(zhuǎn)移功能部分（vir基因， 左右邊界）。 （2）減少限制性酶切位點，引入單一插入位 點。 （3）取消T-DNA的致瘤基因，使被轉(zhuǎn)化的植 物細胞不再成為腫瘤，能正常分化。7. Ti質(zhì)粒的改造改造后的Ti質(zhì)粒載體模式leftrightM C SAMProriVirselect8. Ti載體的類型（1）共整合載體（cointegrate vectors）最早獲得廣泛應用的Ti質(zhì)粒是比利時科學家P.Zambrisky等

46、1983年改造的pGV3850需要同源重組才能插入外源基因。 pGV3850的特點：是一種受體質(zhì)粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322質(zhì)粒作為中間載體。宿主土壤農(nóng)桿菌的選擇標記是位于中間載體pBR322上的卡那霉素抗性（Kanr）基因。位于T-DNA右半部分的胭脂堿合成酶基因（nos）。1）農(nóng)桿菌選擇標記2）最終受體植物的選擇標記 選擇標記卡那霉素抗性（ Kanr ）基因（卡那霉素對植物有劇毒?。?外源基因插入pGV3850的過程外源基因Kanr pBR322土壤農(nóng)桿菌 含pGV3850植物組織卡那霉素篩選胭脂堿篩選抗卡那霉素 的土壤農(nóng)桿菌外源基因 表達鑒定轉(zhuǎn)化插入感染pBR32

47、2與pGV3850重組整合到 染色體上pBR322不能在土壤農(nóng)桿菌中復制，只能同pGV3850重組。只有這樣，土壤農(nóng)桿菌才能得到抗卡那霉素性狀。轉(zhuǎn)化后可誘導愈傷組織分化成轉(zhuǎn)基因植物（2）雙元載體（binary vectors）既有大腸桿菌復制起點也有農(nóng)桿菌復制起點，是個穿梭載體。Ti質(zhì)粒被剔除了T-DNA、冠癭堿代謝基因、vir基因。 大幅度減小質(zhì)粒的體積。（10kb）雙元載體的結構Ti的精髓：Vir基因（轉(zhuǎn)移）和左右界（整合）雙元載體的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌之前，所有的克隆步驟都在大腸桿菌里操作。受體農(nóng)桿菌內(nèi)要求帶有整套vir基因（但缺失T-DNA及左右邊界）的“幫助質(zhì)?！碧峁﹙ir產(chǎn)物。1）基因插

48、入2）幫助質(zhì)粒（ helper plasmid）Vir產(chǎn)物使雙元載體上的T-DNA左右邊界及其外源基因轉(zhuǎn)入到植物細胞，并整合到植物染色體上。左右外源基因雙元載體Vir幫助質(zhì)粒農(nóng)桿菌Vir農(nóng)桿菌左右外源基因感染植物轉(zhuǎn)化左右外源基因進入植物細胞核，整合，表達E.coli（3）三親融合法(triparental matig)含雙元載體的大腸桿菌：含有外源基因和左右邊界。含有幫助質(zhì)粒的輔助細菌：含vir基因。受體農(nóng)桿菌（空）：三種菌混合培養(yǎng)，然后通過各自的抗菌素抗性標記選擇吸收了外源基因、左右界、和Vir的農(nóng)桿菌。三親四、在哺乳動物細胞中表達1.動物細胞基因克隆和表達載體-SV40病毒常用的SV40載

49、體，是從猿猴空泡病毒SV40（simian vacuolating virus40）改造而來的。 20面體外殼：由VP1、VP2和VP3三種病毒外殼蛋白構成。5243bp的環(huán)狀雙鏈。 DNA：（1） SV40病毒的結構SV40猿猴細胞細胞裂解釋放SV40嚙齒類細胞細胞癌變SV40DNA整合到寄主染色體上受納細胞非受納細胞（2）SV40感染和生存方式T-抗原（tumor antigen）:兩個6聚體的T抗原結合在SV40 DNA的復制起始點上，分別向相反方向移動，將雙鏈DNA解螺旋。 隨后單鏈DNA結合蛋白（ssB）與解開的單鏈DNA結合維持解旋狀態(tài)。(3) SV40 DNA的復制解鏈SV40編

50、碼的蛋白。功能是在SV40 DNA復制的時候解開DNA雙鏈。T抗原SV40 DNA雙鏈 SV40 復制起始位點5-CTCACTACTTCTGGAATAGC3-GAGTGATGAAGACCTTATCG120早期回文序列TCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTAGTCTCCGGCTCCGCCGGAGCCGGAGA2147T抗原結合位點GCATAAATAAAAAAAATTAGTCCGTATT TATTTT TTTTAATCAG富含AT區(qū)4869早期表達區(qū)： (4) SV40病毒的轉(zhuǎn)錄和翻譯編碼大T抗原（控制DNA復制）和小t抗原。晚期表達區(qū)：在DNA復制一段時間后表達，產(chǎn)物是VP1、VP2和