免疫學(xué)檢驗(yàn)chap第七章熒光免疫技術(shù)

1、第七章 熒光免疫技術(shù)(Chapter 7 Fluoroimmunoassay)課程承擔(dān)：濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室課件制作：醫(yī)學(xué)免疫學(xué)省級(jí)教學(xué)團(tuán)隊(duì)主 講 人：馬 群授課班級(jí)：2010級(jí)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)本科授課時(shí)間：2013年9月10日臨床免疫學(xué)檢驗(yàn) 熒光免疫技術(shù)：是將抗原抗體反應(yīng)與熒光技術(shù)相結(jié)合而建立的一種免疫標(biāo)記技術(shù)，具有高度特異性、敏感性和直觀性。第七章 熒光免疫技術(shù)fluorescence antibody technique, FATfluorescence immunoassay 熒光：熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原來處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋

2、放出能量，這種發(fā)射光稱為熒光。第七章 熒光免疫技術(shù) 熒光：熒光物質(zhì)在吸收激發(fā)光的能量后，使原來處于基態(tài)的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，激發(fā)態(tài)的電子以發(fā)射光的形式釋放出能量，這種發(fā)射光稱為熒光。常用熒光物質(zhì)： 異硫氰酸熒光素（FITC） 四乙基羅丹明（RB200） 藻紅蛋白（PE）第七章 熒光免疫技術(shù) 熒光抗體：是熒光免疫技術(shù)的關(guān)鍵試劑，是將熒光素與特異性的高親和力單克隆抗體通過化學(xué)共價(jià)鍵的方法結(jié)合而成。保存： 小量分裝、避光、4（半年）、-20（23年）、稀釋后4可保存13天。第七章 熒光免疫技術(shù) 熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)：即熒光抗體技術(shù)、熒光顯微鏡技術(shù)，采用熒光素標(biāo)記抗體與標(biāo)本片中組織或細(xì)

3、胞抗原反應(yīng)，經(jīng)洗滌分離后，在熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)特異性熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在部位，借此對(duì)組織細(xì)胞抗原進(jìn)行定性和定位監(jiān)測(cè)或?qū)ψ陨砜贵w進(jìn)行定性和滴度測(cè)定。第一節(jié) 熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)(Section 1 Fluorescence Immunohistochemistry Technique)一、基本原理（一）直接法第一節(jié) 熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)簡便快速特異性強(qiáng)一種熒光抗體只能檢測(cè)一種抗原敏感度不如間接法一、基本原理（一）直接法第一節(jié) 熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)一、基本原理（二）間接法第一節(jié) 熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)一、基本原理（三）雙標(biāo)記法第一節(jié) 熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)設(shè)立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)對(duì)照正確區(qū)分特異性染色

4、和非特異性染色顯色分布、深淺為判斷依據(jù)二、結(jié)果判斷第一節(jié) 熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)二、結(jié)果判斷第一節(jié) 熒光免疫組織化學(xué)技術(shù)第二節(jié) 熒光免疫分析(Section 2 Fluorescence Immunoassay) 熒光免疫分析是將抗原抗體反應(yīng)與熒光物質(zhì)發(fā)光分析相結(jié)合，用熒光檢測(cè)儀測(cè)定抗原抗體復(fù)合物中特異性熒光強(qiáng)度，對(duì)液體標(biāo)本中微量或超微量物質(zhì)進(jìn)行定量測(cè)定。時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定熒光偏振免疫測(cè)定熒光酶免疫測(cè)定 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TRFIA）是以鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，并與時(shí)間測(cè)定技術(shù)相結(jié)合而建立起來的一種新型非放射性微量分析技術(shù)。一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定靈敏度高發(fā)光穩(wěn)定熒光壽命長自然熒光干擾少標(biāo)

5、準(zhǔn)曲線范圍寬第二節(jié) 熒光免疫分析（一）基本原理1時(shí)間分辨自發(fā)熒光壽命短:1ns10ns鑭系元素壽命長: 10s1000s短壽命熒光完全衰變后再測(cè)定鑭系元素特異熒光 一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第二節(jié) 熒光免疫分析（一）基本原理2Stokes位移一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第二節(jié) 熒光免疫分析stokes位移:激發(fā)光譜和發(fā)射光譜的波長差鑭系元素Stokes位移大(273nm)，容易分開。（一）基本原理3發(fā)射光譜和激發(fā)光譜一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第二節(jié) 熒光免疫分析發(fā)射光譜帶較窄：613nm10nm，干擾少（生物制品的本底熒光波長350600nm） 激發(fā)光譜帶較寬：300nm350nm，利于增加激發(fā)能，提

6、高靈敏度。一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第二節(jié) 熒光免疫分析（二）標(biāo)記物和標(biāo)記方法 鑭系元素銪(Eu3+)鋱(Tb3+)釤(Sm3+)釹(Nd3+)鏑(Dy3+)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)熒光物質(zhì)熒光壽命(ns)非特異熒光背景110Sm3+ -NTA65000人血清蛋白4.1Sm3+-PTA60000球蛋白3.0Eu3+-NTA714000細(xì)胞色素C3.5Eu3+-PTA925000FITC4.5Tb3+-PTA96000丹黃酰氯14Dy3+-PTA1000羅丹明B3.0一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第二節(jié) 熒光免疫分析（三）方法類型雙抗體夾心法一、時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定第二節(jié) 熒光免疫分析（三）方法評(píng)價(jià)靈敏

7、度高：最小檢出值達(dá)10-18mol/L分析范圍寬：45個(gè)數(shù)量級(jí)標(biāo)記物穩(wěn)定：有效使用期長測(cè)量快速，易自動(dòng)化無放射性污染第二節(jié) 熒光免疫分析二、熒光偏振免疫測(cè)定 熒光偏振免疫測(cè)定是利用抗原抗體競(jìng)爭反應(yīng)原理，根據(jù)熒光素標(biāo)記抗原與熒光素抗原抗體復(fù)合物之間熒光偏振程度的差異，測(cè)定體液中小分子抗原物質(zhì)的含量。 熒光素經(jīng)單一波長的偏振光照射后吸收光能，釋放出相應(yīng)的偏振熒光，該熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)受激發(fā)時(shí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度成反比。（一）基本原理光線通過偏振濾光片后，形成一個(gè)方向的平面光稱為偏振光。偏振熒光(525550nm)偏振光(485nm)熒光物質(zhì)第二節(jié) 熒光免疫分析二、熒光偏振免疫測(cè)定AgF分子小，轉(zhuǎn)動(dòng)速度快

8、，偏振熒光弱 AgF-Ab分子大，轉(zhuǎn)動(dòng)速度慢，偏振熒光強(qiáng) 若待檢抗原多，則AgF-Ab少，AgF多，偏振熒光弱待檢抗原含量與偏振熒光強(qiáng)度成反比（一）基本原理第二節(jié) 熒光免疫分析二、熒光偏振免疫測(cè)定（二）方法評(píng)價(jià)第二節(jié) 熒光免疫分析二、熒光偏振免疫測(cè)定 樣品用量少 熒光素標(biāo)記試劑穩(wěn)定，使用壽命長 快速，易自動(dòng)化，重復(fù)性好 適于小分子物質(zhì)檢測(cè) 靈敏度低于非均相熒光免疫測(cè)定法第二節(jié) 熒光免疫分析三、熒光酶免疫測(cè)定 熒光酶免疫測(cè)定是利用酶標(biāo)記抗體（或抗原）與待測(cè)抗原（或抗體）反應(yīng)，借助酶催化熒光底物，經(jīng)酶促反應(yīng)生成穩(wěn)定且高效的熒光物質(zhì)，通過測(cè)定熒光強(qiáng)度確定待檢抗原或抗體的含量。第二節(jié) 熒光免疫分析三、

9、熒光酶免疫測(cè)定（一）基本原理 標(biāo)記酶：堿性磷酸酶（ALP） 底物：4-甲基傘形酮磷酸鹽（4-MUP） 產(chǎn)物：4-甲基傘形酮（4-MU） 照射：4-MU經(jīng)360nm激發(fā)光照射，可發(fā)出450nm的熒光，熒光測(cè)定儀測(cè)定其強(qiáng)度。第二節(jié) 熒光免疫分析三、熒光酶免疫測(cè)定（二）方法類型雙抗體夾心法雙抗原夾心法固相抗原競(jìng)爭法第二節(jié) 熒光免疫分析三、熒光酶免疫測(cè)定（三）方法評(píng)價(jià) 綜合了酶免疫測(cè)定的放大效應(yīng)和熒光測(cè)定的高敏感性 固相熒光酶免疫測(cè)定法效果好第三節(jié) 熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用(Section 3 Application of Fluoroimmunoassay)（一）病原體檢測(cè)疾病診斷、流行病學(xué)調(diào)查、臨床回顧診斷。（二）自身抗體檢測(cè)輔助診斷自身免疫性疾病。抗核抗體(均質(zhì)型)抗核抗體(斑點(diǎn)型)抗核抗體(核膜型)第三節(jié) 熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用（三）免疫病理檢測(cè)組織中Ig、C、IC的檢測(cè)，和腫瘤相關(guān)抗原的鑒定。腫瘤（人肝癌細(xì)胞）第三節(jié) 熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用（四）細(xì)胞表面抗原和受體檢測(cè)淋巴細(xì)胞及其亞群的鑒定。第三節(jié) 熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用（四）細(xì)胞表面抗原和