藥學(xué)微生物基礎(chǔ)教案課件

1、藥學(xué)微生物基礎(chǔ)教案上課時間: 200 年 月 日授課內(nèi)容:第二節(jié) 抗生素效價的微生物測定技術(shù)授 課 人: 汪穗福任教班級: 級 班課 時:課 型:教學(xué)媒體:教學(xué)目標：、熟記抗生素效價單位的表示方法 、熟知抗生素效價、二劑量法和管碟法的概念 、知道二劑量法的原理和操作技術(shù)教學(xué)重點：1、概念和抗生素效價單位的表示方法2、二劑量法的原理和操作技術(shù)教學(xué)難點：二劑量法的原理和操作技術(shù)第二節(jié) 抗生素效價的微生物測定技術(shù) 本節(jié)主要介紹抗生素效價和單位的含義及表示方法、抗生素微生物學(xué)測定技術(shù)的種類，重點介紹管碟法中二劑量法的概念、原理及操作技術(shù)。 一、抗生素的效價和單位 抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此人們通常所說

2、的某種抗生素常常是幾種相似成分的混合物；而且抗生素性質(zhì)不穩(wěn)定，產(chǎn)品中混雜著分解產(chǎn)物、異構(gòu)物等；再加上抗生素生產(chǎn)過程中不可避免地混入一些發(fā)酵產(chǎn)生的雜質(zhì)，這些情況還會隨著工藝路線的不同、生產(chǎn)菌種的變異、培養(yǎng)基原料和培養(yǎng)條件的改變而發(fā)生相應(yīng)的變化，所以必須對抗生素的有效成分加以測定。效價 是指抗生素有效成分的含量，即在同一條件下由抗生素的檢品和標準品的抗菌活性的比值得出的百分數(shù)。 單位 是衡量抗生素有效成分的尺度，是效價的表示方法。 抗生素的含量用效價和單位表示，有時把這兩個名詞不加區(qū)別統(tǒng)稱為效價單位（指每毫升或每毫克中所含某種抗生素的有效成分的多少）。（1）質(zhì)量單位 以抗生素的生物活性部分(不包括

3、無活性的酸根部分)的質(zhì)量作為效價單位。1g=1U， 1mg=1000U。用這種方法表示不同酸根的同一抗生素的效價單位時，雖然抗生素稱重不同，只要單位一樣，則表示其有效部分的質(zhì)量是一樣的。如硫酸鏈霉素、鹽酸土霉素、硫酸卡那霉素、硫酸新霉素、硫酸慶大霉素、乳酸紅霉素等 1抗生素效價單位的表示方法（2）類似質(zhì)量單位 以純粹抗生素鹽類的質(zhì)量(包括無生物活性的酸根部分)作為效價單位。lg=1U，lmg=1000U。這是根據(jù)國際使用習(xí)慣而來的。如四環(huán)素、新生霉素等 （3）質(zhì)量折算單位以特定的純粹抗生素鹽的某一質(zhì)量作為效價單位加以折算。如青霉素的單位，最初是指定在50ml肉湯培養(yǎng)基內(nèi)能夠完全抑制金黃色葡萄球

4、菌生長的青霉素的最小量為1U，后來制得純品，這一量相當(dāng)于青霉素G鈉鹽0.5988g。因而國際上一致認定0.5988g為1U，則1g=1670U；又如硫酸黏菌素指定488 10mg為1U，則lmg硫酸黏菌素相當(dāng)于20500U。 （4）特定單位 以特定的抗生素樣品的某一質(zhì)量作為效價單位，經(jīng)國家有關(guān)機構(gòu)認可而定的。如特定的一批桿菌肽稱重0018mg為1U，即lmg55U；又如制霉菌素，第一批標準品1mg=3000U。 （1）國際標準品與國家標準品 抗生素的國際標準品由世界衛(wèi)生組織邀請有條件的國家檢測機構(gòu)或藥廠協(xié)作標定后，由生物檢定專家委員會最后通過決定。抗生素的標準品是與供試品同質(zhì)的純度較高的抗生素

5、，用來測定效價的標準。標準品分為國家標準品和國際標準品。經(jīng)國際協(xié)議，每lmg標準品中含有一定的單位，其單位稱為國際單位（U）。2標準品與供試品國際標準品供各國檢定國家標準品時作對照用，不用于常規(guī)檢驗。國家標準品制備后，須與國際標準品的效價單位進行比較，定出效價單位。 我國于1952年開始建立國家標準品，由衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所會同全國有關(guān)單位共同進行選樣、分裝、協(xié)作標定、確定效價等，經(jīng)衛(wèi)生部審定后，向全國各使用位分發(fā)。 對于沒有國際標準品的我國特有品種，由我國按照一定的原則自定效價單位。標準品應(yīng)按規(guī)定條件保存。（2）供試品 供試品是供檢定其效價的樣品，它的活性組分應(yīng)與標準品基本相同。 抗生素

6、微生物檢定法是利用抗生素抑制或殺死細菌或真菌的程度作為客觀指標來衡量抗生素中有效成分的效力的一種方法。各國藥典均有采用。它比物理學(xué)方法或化學(xué)方法都更能夠確定抗生素的醫(yī)療價值，且有較高的靈敏度，所以被各國藥典收載為測定抗生素效價的經(jīng)典方法。二、抗生素微生物檢定法的種類1稀釋法現(xiàn)在已不用來測定抗生素的效價，而以之測定抗生素的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度(MBC)。2比濁法用透光度測量濁度，渾濁程度越高，光吸收越好，通過的光線也就越小，采用分光光度計來測定吸光度，用二劑量法或三劑量法可計算出供試品的效價。這種方法準確、快速、不受擴散影響且自動化程度高。 這種方法準確、快速、不受擴散影響且自動

7、化程度高，各國藥典相繼收載。我國藥典2005年收載此法。有二個品種。根據(jù)抑菌圈的大小可判斷細菌和真菌對抗生素的敏感程度。也可將供試品的抑菌圈與標準品的抑菌圈進行比較，計算出供試品的效價。 擴散法根據(jù)擴散形式不同可分為多種，其中管碟法是國際通用的方法。我國藥典微生物檢定法也一直采用管碟擴散法。 3擴散法1管碟法的概念 管碟法是利用抗生素溶液在含敏感試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)擴散滲透作用形成一定的抑菌圈而設(shè)計的。通過瓊脂培養(yǎng)基，可觀察并測量出抑菌圈的大小。在一定的抗生素濃度范圍內(nèi)，抗生素的對數(shù)濃度(劑量)與抑菌圈的面積或直徑成正比。2抑菌圈的形成原理三、管碟法 將不銹鋼小管（俗稱牛津杯）放置在含敏感試驗

8、菌的瓊脂培養(yǎng)基上，將抗生素溶液注入小鋼管中，抗生素分子隨溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈放射狀擴散。同時將培養(yǎng)基置于適宜試驗菌生長的條件下培養(yǎng)，試驗菌開始生長。抗生素分子在瓊脂培養(yǎng)基中的濃度，隨離小鋼管的距離增大而降低，離小鋼管越遠，瓊脂培養(yǎng)基中抗生素的濃度越低。當(dāng)抗生素分子擴散到一定時間，在小鋼管周圍形成了一個能有效抑制試驗菌生長的范圍，也就是通常所說的抑菌圈，抑菌圈的邊緣處所含的抗生素濃度恰好是抗生素對試驗菌的最低抑制濃度。抗生素的濃度不同，形成的抑菌圈的大小也不同。圖 ：抗生素在含試驗菌平板上擴散示意圖3管碟法的動力學(xué)公式 抗生素溶液在培養(yǎng)基內(nèi)呈球面擴散，利用分子擴散定律推導(dǎo)出的動力學(xué)公式如下： r2=

9、4Dt1nM-lnc-ln(4DtH) 或 lgM=1(921Dt) r2+lg(4cDtH) 式中，D為擴散系數(shù)，mm2h；t為抗生素擴散時間，h；M為管中抗生素總量，U；r為管中心到抑菌圈邊緣距離，mm；H為培養(yǎng)基厚度，mm；c為最低抑菌濃度，Uml。 由上式可知，lgM與r2成直線關(guān)系，即抗生素總量的對數(shù)值與抑菌圈半徑的平方值成直線關(guān)系，抗生素的量可從抑菌圈的大小來計算。 四、二劑量法（一）概念 二劑量法是根據(jù)在一定的濃度范圍內(nèi)，抗生素的對數(shù)劑量和抑菌圈的直徑或面積成正比的原理，將抗生素的標準品(S)和供試品(U)各稀釋成一定比例的兩種劑量，即高劑量和低劑量（2：1或4：1）在同一含試驗

10、菌的平板上進行比較，根據(jù)兩種劑量4種溶液所產(chǎn)生的抑菌圈的大小，計算出供試品的效價。根據(jù)設(shè)計原理不同，管碟法分一劑量法(標準曲線法)、二劑量法(22法)和三劑量法(33法)三種常用的方法。（二）效價計算公式(不講)效價計算公式的推導(dǎo)如下(圖 )：設(shè)lg=lg效價 =直線角度 K =高劑量與低劑量之比 UH=供試品高劑量之抑菌圈直徑 UL=供試品低劑量之抑菌圈直徑 SH=標準品高劑量之抑菌圈直徑 SL=標準品低劑量之抑菌圈直徑 V=(UH+UL)(SH+SL) W=(SH+UH) (SL+UL)由圖知 lg=tg(UHSH) lg=tg(ULSL) + 2lg=tg(UHSH)+(ULSL) =t

11、g(UH+ UL)(SH+ SL) = tgv lg= tgV/2 而 lgK = tg(UHUL) lgK = tg(SHSL) + 2lgK= tg(UHUL)+( SHSL) = tg(UH+SH)( UL+SL) = tgW tg=21gK /W 代入得 lg=21gKWV2 lg=lg(KW/V) =lg-1(KW/V) 由公式即可算出效價。 注意：公式中的為相對效價，即供試品效價(Pu)與標準品效價(Ps)之比；所以供試品的效價代入下列公式即可求出。 Pu=Ps =lg-1(KW/V) K =高劑量與低劑量之比 UH=供試品高劑量之抑菌圈直徑 UL=供試品低劑量之抑菌圈直徑 SH=

12、標準品高劑量之抑菌圈直徑 SL=標準品低劑量之抑菌圈直徑 V=(UH+UL)(SH+SL) W=(SH+UH) (SL+UL) 為相對效價，即供試品效價(pu)與標準品效價(ps)之比；所以供試品的效價代入下列公式即可求出。 pu=ps抗生素微生物檢定法的檢驗程序標準品的稱量 標準品的稀釋標準品溶液 供試品的稱量 供試品的稀釋供試品溶液 滴 加緩沖液的制備 平板的制備 藥 液 凝固后 凝固后 培養(yǎng)基的制備 底層20 ml菌層5ml 加小鋼管 加菌液 菌液的制備 加陶瓦園蓋 可靠性測驗，計算結(jié)果 測量抑菌圈培 養(yǎng)圖：ZY-300IV型智能抑菌圈測量儀圖:CHB1型抗生素效價測量儀抗生素微生物檢定法的過程標準品、供試品的稱量標準品、供試品的稀釋緩沖液的制備培養(yǎng)基的制備菌液的制備平板的制備抗生素微生物檢定法的過程加陶瓦園蓋